STT Loại mẫu Số mẫu Tỉ lệ (%)
1 Xúc xích 4 26,7
2 Ngô hộp 2 13,3
3 Thịt hộp 3 20,0
4 Thịt xơng khói 4 26,7
5 Pate Minh Chay 2 13,3
3.2. Kết quả xác định tính chất sinh vật hóa học C. botulinum bằng kit
API 20A
Các mẫu sau khi thu thập về phịng thí nghiệm đều được tiến hành ni cấy phân lập vi khuẩn C. botulinum. Các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái nghi ngờ vi khuẩn C. botulinum như: bề mặt thơ ráp, bờ khơng đều, có xu hướng mọc lan, tạo
kết tủa trắng và có phản ứng lipase trên môi trường CBI đều được cấy thuần, lưu giữ chủng, tách DNA bằng phương pháp nhiệt độ để chạy PCR phát hiện gen sinh độc tố và thực hiện kỹ thuật định danh loài bằng kỹ thuật xác định tính chất sinh vật hóa học bằng kit API 20A.
Kết quả xác định tính chất sinh vật hóa học bằng kit API 20A của nghiên cứu đã thu được 6 chủng có kết quả định danh là vi khuẩn C. botulinum với độ tin cậy
lớn hơn 75%, kết quả được trình bày ở bảng 3.5. Trong đó 2 chủng có ký hiệu CBGS 01 và CBGS 02 là 2 chủng phân lập được từ mẫu đất thu thập tại trang trại ni ong tỉnh Bắc Giang, 2 chủng có ký hiệu Cbt3F01 và Cbt21F18 là các chủng phân lập được từ mẫu thực phẩm pate chay thu thập từ bệnh nhân ngộ độc thực phẩm do botulinum, chủng có ký hiệu CHB39 là chủng phân lập từ mật ong thu thập tại Bắc Giang và chủng có ký hiệu CHB175 là chủng phân lập từ mẫu mật ong thu thập tại Hà Giang. Tính chất sinh vật hóa học của các chủng khác nhau ở đường glucose, maltose, arabinose, trehalose.
Bảng 3. 5. Kết quả định danh chủng C. botulinum bằng bộ kit API 20A Phản ứng sinh hóa Kết quả của chủng CBGS 01 CBGS 02 Cbt3F 01 Cbt21F18 CHB 39 CHB 175 IND - - - - - - URE - - - - - - GLU + + + + - -
Sử dụng phần mềm APIweb để phiên giải kết quả cho thấy cả 6 chủng được định danh là C. botulinum với độ tin cậy lần lượt là 96,5%; 87,4%; 96,5%; 96,5%; và 97,1% và 75,3%. MAN - - - - - - LAC - - - - - - SAC - - - - - - MAL + + + + + - SAL - - - - - - XYL - - - - - - ARA + - + + - - GEL + + + + + + ESC + - + + + + GLY - - - - - - CEL - - - - - - MNE - - - - - - MLZ - - - - - - RAF - - - - - - SOR - - - - - - RHA + + + + - - TRE + + + + - - CAT - - - - - - Mã số APIweb 40160003 40120003 40160003 40160003 00060003 00160003
3.3 Kết quả xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng mồi của nhóm độc tố thường gây bệnh cho người và động vật là các loại độc tố A, B, C, D, E và F và DNA tách bằng phương pháp nhiệt độ để chạy phản ứng PCR phát hiện gen sinh độc tố từ những khuẩn lạc có đặc điểm hình thái nghi ngờ C. botulinum. Kết quả thu được 4 chủng có băng kích thước trùng với
băng độc tố B (205 bp) – là các chủng CBGS01, CBGS02, Cbt3F01, Cbt21F18. Có 2 chủng lên băng tương tứng độc tố A (782 bp) là Cbt3F01 và Cbt21F18. Còn 2 chủng CHB 39 và CHB 175 âm tính với tất cả các gen độc tố A, B, C, D, E và F của
C. botulinum. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và hình 16, 17.
Bảng 3 .6. Kết quả xác định gen sinh độc tố bằng kỹ thuật PCR
Stt Mã chủng Gen độc tố A B C D E F 1 CBGS01 - + - - - - 2 CBGS02 - + - - - - 3 Cbt3F01 + + - - - - 4 Cbt21F18 + + - - - - 5 CHB39 - - - - - - 6 CHB175 - - - - - -
Hình 10: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen độc tố B C. botulinum.
Giếng M: Thang chuẩn 100bp; Giếng 1: chứng âm; Giếng 2, 3: mẫu mật ong CHB39, CHB175. Giếng 4, 5: mẫu CBGS 01, CBGS 02; Giếng 6, 7: mẫu Cbt3F01, Cbt21F18
Hình 11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen độc tố A C. botulinum
Giếng M: Thang chuẩn 100bp; Giếng 1: chứng âm; Giếng 2, 3: mẫu Cbt3F01, Cbt21F18. Giếng 4.5: mẫu CBGS 01, CBGS 02. M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 500bp 1000bp 100bp 100bp 500bp 1000bp
Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR xác định gen sinh độc tố cho thấy 4 trong 6 chủng có kết quả định danh bằng phương pháp xác định tính chất sinh vật hóa học mang gen sinh độc tố, trong đó 2 chủng CBGS01 và SBGS02 mang gen sinh độc tố B và 2 chủng Cbt3F01 và Cbt21F18 mang đồng thời gen sinh độc tố A và B. 2 trong 6 chủng không mang gen sinh độc tố là các chủng CHB39 và CHB175 phân lập từ mật ong.
3.4 Tỉ lệ phân lập C. botulinum từ các loại mẫu
Kết quả định danh bằng phương pháp xác định tính chất sinh vật hóa học và kết quả xác định gen sinh độc tố cho thấy, nghiên cứu đã phân lập được 6 chủng C.
botulinum từ các loại mẫu. Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Tỉ lệ phân lập C. botulinum từ các loại mẫu Thứ
tự Tên mẫu Số mẫu
Số mẫu dƣơng tính
Mã mẫu Gen sinh độc tố 1 Mật ong 129 2 CHB39 CHB175 Khơng có 2 Đất 325 2 CBGS01 CBGS02 B 3 Thực phẩm 15 2 Cbt3F01 Cbt21F18 A, B Tỷ lệ chung 469 6
Trên môi trường CBI, cả 6 chủng này đều sinh enzym lipolytic (enzym tiêu mỡ) tạo axít béo tự do từ lòng đỏ trứng và tạo mảng óng ánh ngọc trai khi nhìn nghiêng đĩa thạch (phản ứng lipase dương tính).
Trên các loại môi trường dinh dưỡng (thạch máu, Brucella, GAM) thấy khuẩn lạc của của các chủng này có bờ khơng đều, bề mặt thơ ráp, có xu hướng mọc lan (hình 3.2; 3.5). Trên mơi trường thạch máu, khuẩn lạc gây tan máu hồn tồn (hình 3.1).
Hình 12: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch máu
Hình 64: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch Brucella
Hình 86: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch EYA 3.5. Kết quả giải trình gen
Đề tài tiến hành giải trình tự đoạn gen độc tố của chủng phân lập từ thực phẩm pate chay mã số Cbt3F01. Kết quả thu được:
Trình tự nucleotide gen độc tố A: TTAGTATATGATTTTACCGATGAACTAGCGAAGTAAGTACTACGGATAA AATTGCGGATATAACTATAATTATTCCATATATAGGACCTGCTTTAAATA TAGGTAATATGTTATATAAAGATGATTTTGTAGGTGCTTTAATATTTTCA GGAGCTGTTATTCTGTTAGAATTTATACCAGAGATTGCAATACCTGTATT AGGTACTTTTGCACTTGTATCATATATTGCGAATAAGGTTCTAACCGTTC AAACAATAGATAATGCTTTAAGTAAAAGAAATGAAAAATGGGATGAGG TCTATAAATATATAGTAACAAATTGGTTAGCAAAGGTTAATACACAGAT TGATCTAATAAGAAAAAAAATGAAAGAAGCTTTAGAAAATCAAGCAGA AGCAACAAAGGCTATAATAAACTATCAGTATAATCAATATACTGAGGAA GAGAAAAATAATATTAATTTTAATATTGATGATTTAAGTTCGAAACTTA ATGAGTCTATAAATAAAGCTATGATTAATATAAATAAATTTTTGAATCA ATGCTCTGTTTCATATTTAATGAATTCTATGATCCCTTATGGTGTTAAAC GGTTAGAAGATTTTGATGCTAGTCTTAAAGATGCATTATTAAAGTATAT
ATATGATAATAGAGGAACTTTAATTGGTCAAGTAGATAGATTAAAAGAT AAAGTTAATAATACACTTAGTACAGATATACCTTT
So sánh trình tự nucleotide gen độc tố A của chủng phân lập với chủng C.botulinum ATCC 25763 (ID: EF028391.1); Chủng C. botulinum ATCC 19397 (ID:
CP000726.1) và nhiều chủng khác trên ngân hàng genbank đều cho độ chính xác
Identities từ 99.86 - 100%
Trình tự nucleotide gen độc tố B
TTAGATGAAAATGAGACTATAGCTATAGGTATACAAAATCATTTTGCAT CAAGGGAAGGCTTCGGGGGTATAATGCAAATGAAGTTTTGCCCAGAATA TGTAAGCGTATTTAATAATGTTCAAGAAAACAAAGGCGCAAG
So sánh trình tự nucleotide gen độc tố B của chủng phân lập với chủng C. botulinum CDC 69094 (ID: CP013246.1); Chủng C. botulinum CDC28184 (ID:
FJ981690.1) và nhiều chủng khác trên ngân hàng genbank đều cho độ chính xác từ
98.57 - 100%.
Đề tài cũng tiến hành giải trình tự tồn bộ hệ gen vi khuẩn chủng phân lập từ pate chay mã số Cbt3F01. Dữ liệu thô thu được từ máy miseq (file raw) sẽ được gửi lên hệ thống NCBI Sequence Read Archive (SRA, accession number: PRJNA762208). Các đoạn ngắn DNA được thực hiện lắp ráp bằng phần mềm Spades phiên bản 3.1.2 với các thông số là "careful", và chế độ đọc tự động “auto”, cài đặt hệ số k- mer =77. Các gen sau đó đánh dấu bằng phần mềm DDBJ Fast Annotation and Submission Tool (có sẵn trên website https://dfast.ddbj.nig.ac.jp/). Sự liên kết gene cốt lõi (Core gene alignments) được thực hiện bằng phần mềm Roary v.3.13.0 với các tùy chọn “-i 80” và “-e --mafft” [9 . Kết quả thu được từ phần mềm Roary sẽ được dùng để vẽ cây phả hệ toàn bộ hệ gen bằng phần mềm IQ- tree v.2.1.2 với kiểu tỉ lệ 1/1000.
Hình 17: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với các chủng C. botulinum nhóm I, II, III III
Hình 18: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với các chủng C. tobulinum nhóm I
Kết quả phân tích cho thấy chủng Cbt3F01 vi khuẩn C. botulinum, sequence type ST15, chiều dài chromosome chủng Cbt3F01 là 3822371bp. Chủng có mối quan hệ gần gũi với các chủng C. botulinum NCTC 2916; ATCC 3502 và ATCC
19397 (hình 17, 18)
Dữ liệu giải trình tự tồn bộ hệ gen vi khuẩn chủng Cbt3F01 cũng đã được upload lên ngân hàng gen tại đường link:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA762208 Mã xác định của chủng trên genbank là PRJNA762208.
Các thông tin mô tả gồm: SRX12130100 - WGS C.botulinum isolated from
home-canned food
1 ILLUMINA (Illumina MiSeq) run: 1.1M spots, 255.1M bases, 142.8Mb downloads
Design: DNA from the Cbt3F01 strain was extracted from overnight culture using DNeasy Blood and Tissue Kit. Whole-genome sequencing using the NEBNext Ultra DNA Library Prep kit for Illumina (New England Biolabs) was performed using the MiSeq machine.
Submitted by: National Institute of Hygiene and Epidemiology Study: Botulism food poisoning in Vietnam
PRJNA762208 • SRP336489 • All experiments • All runs show Abstract Sample: Vegeterian Pate (food)
SAMN21380365 • SRS10110219 • All experiments • All runs Organism: Clostridium botulinum
Library:
Name: C.botulinum_run2 Instrument: Illumina MiSeq Strategy: WGS
Source: GENOMIC
Selection: size fractionation Layout: PAIRED
CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN
Trung bình mỗi năm ở Hoa Kỳ có 70-100 trường hợp ngộ độc thịt được báo cáo. Khoảng 25% trường hợp bị ngộ độc thịt do thực phẩm và 72% bị ngộ độc thịt đường ruột ở trẻ sơ sinh [41, 44 . Từ năm 1976, trên 1500 ca bệnh ngộ độc thịt trẻ em được báo cáo ở hơn 15 quốc gia. Trong số những nguồn tiềm ẩn nha bào C. botulinum khác nhau như bùn đất, cát thì mật ong là nguồn thực phẩm liên quan tới
bệnh ngộ độc thịt. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh nha bào C. botulinum có
mặt tự nhiên trong một số mẫu mật ong [37, 38, 40 . Các nghiên cứu trên thế giới đã báo cáo tỉ lệ phát hiện nha bào C. botulinum trong mật ong rất khác nhau trong
khoảng từ 1,3-30,6% tùy địa điểm thực hiện và quy mô nghiên cứu [7, 22, 28, 38, 40, 41 . Nhìn chung, kết quả đều cho thấy nồng độ nha bào trong mẫu mật ong thấp (1 nha bào/gam). Một số mẫu có nồng độ cao hơn (36-60 nha bào/gam) do vi khuẩn nhân lên trong xác ong và tổ ong [7, 27 . Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, mức độ nhiễm nha bào C. botulinum phụ thuộc vào vùng thu hoạch và tình trạng vệ sinh
trong cả quá trình thu hoạch mật ong [7, 28 . Hầu hết các yếu tố ảnh hưởng đến sự có mặt của nha bào C. botulinum là: kích thước thùng chiết, khơng thay ủng khi đi từ ngồi vào phịng tách chiết, điều kiện nơi rửa tay trong phịng chiết và sự có mặt của C. botulinum trong mẫu đất [27 . Trong nghiên cứu của chúng tôi, với tổng số 129 mẫu mật ong thu thập được, chủ yếu từ các nguồn gia đình và mua ở siêu thị, chỉ có 10 mẫu (chiếm 7,8%) mua trực tiếp từ các trại ni ong do chi phí thu thập mẫu tại trang trại ni ong khá cao, khó tiếp cận chủ trang trại vì vậy việc tìm hiểu và xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự hiện diện của nha bào là khơng khả thi.
Trong q trình ni cấy phân lập C. botulinum, tất cả các mẫu đều phải thực
hiện 4 quy trình ni cấy (1 mẫu gốc và 1 mẫu sau làm giàu ủ kỵ khí ở nhiệt độ phòng 25-260C; 1 mẫu gốc và 1 mẫu sau làm giàu trong tủ kỵ khí 370C) nên khá tốn kém cơng sức và ngun vật liệu, vì trong mẫu có thể có cả C. botulinum nhóm I và nhóm II, nhóm I sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 370C nhưng nhóm II lại sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 250C. Nghiên cứu này sử dụng môi trường EYA để phân lập C. botulinum từ mẫu mật ong. Hầu hết các mẫu mật ong khi cấy trên EYA đều âm tính vi khuẩn,
số ít mẫu mọc vi khuẩn khác, lipase âm tính, khuẩn lạc mềm. Có 5 mẫu có khuẩn lạc thơ ráp, mọc lan, lipase dương. Tuy nhiên kết quả PCR xác định gen sinh độc tố của các mẫu này với các mồi đặc hiệu gen độc tố A, B, C, D, E, F đều cho kết quả âm tính. Khuẩn lạc của 2 mẫu mật ong mã CHB 39 và CHB 175 có phản ứng lipase dương tính trên mơi trường EYA và hình thái khuẩn lạc mọc lan, thô ráp, bờ không đều giống C. botulinum. Kết quả định danh bằng xác định tính chất sinh vật hóa học có độ tin cậy từ 75 – 95% nhưng kết quả PCR 2 mẫu này lại âm tính với các gen độc tố A, B, C, D, E, F.
Kết quả nghiên cúu không phân lập được chủng C. botulinum mang gen sinh độc tố từ mẫu mật ong. Tuy nhiên đề tài cũng đã kiểm chứng quy trình ni cấy bằng cách trộn các nồng độ khác nhau vi khuẩn C. botulinum độc tố B phân lập từ bùn đất vào mẫu mật ong âm tính và tiến hành ni cấy. Quy trình đã thành cơng khi phát hiện được C. botulinum ở nồng độ 103
cfu/ml. Điều này chứng tỏ quy trình phân lập C. botulinum từ mẫu mật ong mà đề tài áp dụng là đạt yêu cầu.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng hai nguồn nha bào C. botulinum tiềm ẩn quan trọng nhất là mật ong và bùn đất. Sự tích tụ C. botulinum trong đất là do sự đào thải nha bào vi khuẩn từ đường tiêu hóa của người, động vật, chim và cá. Lịch sử các nghiên cứu giám sát khẳng định rằng sự hiện diện của C. botulinum rất phổ biến trong đất với tỉ lệ phân lập khác nhau dao động từ 9,6-23,5% tùy từng vùng địa lí [10, 12, 21, 30, 37 . C. botulinum thường tìm thấy phổ biến ở mẫu đất và cặn bùn. Một vài nghiên cứu về giám sát đất tại Mĩ nhằm phát hiện C. botulinum
độc tố A, B, C, D và E cho thấy C. botulinum độc tố A tìm thấy chủ yếu ở phía tây sơng Mississippi và độc tố B thì phổ biến ở phía Đơng. Chủng độc tố F lại được phân lập từ cặn biển Pacific và từ cua ở vịnh Chesapeake. Ngồi ra, có mối liên hệ chặt chẽ giữa sự phân bố các loại độc tố của C. botulinum và độc tố gây bệnh ngộ độc thịt trẻ sơ sinh. Ở Mĩ, ngộ độc thịt trẻ sơ sinh type A tìm thấy chủ yếu ở phía Tây sông Mississippi, trong khi những ca bệnh mang type B lại phổ biến ở phía Đơng. Ví dụ như tỉ lệ ngộ độc thịt trẻ sơ sinh type B khá cao ở vùng Đông Nam Pennsylvania (43/44 ca) [37].
Một số nghiên cứu trong nước cũng đã phân lập được vi khuẩn C. botulinum
từ mẫu bùn đất quanh khu vực chăn nuôi vịt ở Cần Thơ [1, 2 . Tuy nhiên, nghiên cứu về sự phân bố vi khuẩn C. botulinum trong đất tại Việt Nam chưa có số liệu vì vậy nhóm nghiên cứu lựa chọn ngẫu nhiên 7 tỉnh thành phía Bắc để thu thập mẫu bùn đất. Chúng tôi đã chọn những vùng đất ẩm ướt, giàu chất hữu cơ, gần khu chăn nuôi quy mơ lớn là những vị trí có khả năng phân lập được C. botulinum để thu thập mẫu. Cũng như các mẫu mật ong và đồ hộp, khi xử lí mẫu đất, các mẫu này cũng đều được lặp lại ở 2 nhiệt độ ủ (nhiệt độ phịng và 370C). Khi ni cấy mẫu đất, đề tài sử dụng môi trường chọn lọc CBI cùng với bước sốc cồn mẫu trước khi nuôi cấy để diệt các vi khuẩn không sinh nha bào, ưu tiên cho nha bào C. botulinum sinh trưởng. Chúng tôi đã phân lập được 2 chủng C. botulinum đều mang gen độc tố B,
cả 2 chủng đều từ mẫu bùn đất ở Bắc Giang (mã số chủng CBGS 01 và CBGS 02). Hai chủng này đều có khuẩn lạc điển hình C. botulinum, đường kính 3 mm, bờ khơng đều, hơi dính, xám nhẹ và mọc lan, Catalase âm tính, phản ứng lipase dương tính, tạo bề mặt óng ánh như ngọc trai khi nghiêng đĩa thạch. Các kết quả định danh 2 chủng C. botulinum trên tương tự như các nghiên cứu khác đã báo cáo [13 . Môi trường bùn đất đủ độ ẩm, kỵ khí và giàu dinh dưỡng do đó C. botulinum dễ dàng