Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ THỊ HẢI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG EGCG TRONG LÁ CÂY TRÀ HOA VÀNG (Camellia hakodae Ninh) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆ.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN QUÂN Y BỘ QUỐC PHÒNG LÊ THỊ HẢI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG EGCG TRONG LÁ CÂY TRÀ HOA VÀNG (Camellia hakodae Ninh) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN QUÂN Y BỘ QUỐC PHÒNG LÊ THỊ HẢI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG EGCG TRONG LÁ CÂY TRÀ HOA VÀNG (Camellia hakodae Ninh) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC Cán hướng dẫn: ThS Nguyễn Hồng Hải TS Nguyễn Công Bàng HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới Ban giám đốc Học viện, Phịng Đào tạo tồn thể cán Giảng viên, Kỹ thuật viên Viện Đào tạo Dược giúp đỡ em trình học tập nghiên cứu, quan tâm dìu dắt truyền cho em kiến thức quý giá suốt năm theo học học viện Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Hồng Hải TS Nguyễn Công Bàng, người cô, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình học tập nghiên cứu nhà trường, người dìu dắt giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy cô, anh chị kỹ thuật viên khoa Hóa Dược- Dược Lâm Sàng mơn Kiểm nghiệm tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ q trình nghiên cứu khóa luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ủng hộ, động viên tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2022 Học Viên Lê Thị Hải MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY TRÀ HOA VÀNG (Camellia hakodae Ninh) VÀ EGCG 1.1.1 Giới thiệu Trà hoa vàng (Camellia hakodae Ninh) 1.1.2 TỔNG QUAN VỀ EGCG 1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KỶ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 11 1.2.1 Định nghĩa 11 1.2.2 Cấu tạo hệ thống HPLC 12 1.2.3 Cơ sở để lựa chọn điều kiện sắc ký 13 1.2.4 Thẩm định quy trình phân tích 13 CHƯƠNG - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 16 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 16 2.1.2 Hóa chất, dung mơi 16 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 17 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Kiểm tra chất lượng dược liệu Error! Bookmark not defined 2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng 18 2.2.3 Thẩm định phương pháp định lượng 23 2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 26 2.4 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ECGC 27 3.1.1 Kết đánh giá tiêu chất lượng dược liệu 27 3.1.2 Kết lựa chọn điều kiện sắc kí 27 3.1.3 Xây dựng quy trình chiết xuất EGCG 33 3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG EGCG 39 3.2.1 Tính tương thích hệ thống 39 3.2.2 Độ đặc hiệu 40 3.2.3 Khoảng tuyến tính 42 3.2.4 Độ xác 44 3.2.5 Độ 46 3.2.6 Giới hạn phát giới hạn định lượng 47 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên hình Trang 1.1 Một số cơng trình định lượng EGCG HPLC 10 2.1 Hóa chất dung môi nghiên cứu 17 2.2 Thiết bị dụng cụ dùng nghiên cứu 18 2.3 Các nội dung khảo sát để chiết xuất EGCG từ dược liệu 22 3.1 Hàm ẩm dược liệu Trà hoa vàng 28 3.2 Kết khảo sát pha động 31 3.3 Kết khảo sát phương pháp chiết 35 3.4 Kết khảo sát dung môi chiết 36 3.5 Kết khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi (g/ml) 37 3.6 Kết khảo sát thời gian chiết 39 3.7 Thơng số sử dụng cho quy trình chiết xuất 40 3.8 Kết tính tương thích hệ thống 41 3.9 Kết đánh giá khoảng tuyến tính 44 3.10 Kết đánh giá độ lặp lại 45 3.11 Kết định lượng EGCG ngày khác 46 3.12 Kết đánh giá độ 47 3.13 Kết xác định LOD LOQ 48 3.14 Kết định lượng EGCG Trà hoa vàng 48 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Cây Trà hoa vàng non trưởng thành 1.2 Đặc điểm hoa, lá, quả, hạt Trà hoa vàng 1.3 Cấu trúc chung saponin triterpen vòng 2.1 Lá dược liệu Camellia hakodae Ninh làm khơ 16 3.1 Bước sóng EGCG chuẩn 29 3.2 Sắc ký đồ EGCG với pha động ACN : acid formic 0,1% (95:5) 3.3 Sắc ký đồ EGCG với pha động ACN : acid formic 1% (97:3) 30 30 3.4 Sắc ký đồ EGCG với pha động ACN : acid trifluoroacetic 0,05% (90:10) 31 3.5 Sắc ký đồ EGCG chuẩn tốc độ dòng 0,8 ml/phút 32 3.6 Sắc ký đồ EGCG chuẩn tốc độ dòng 1,0 ml/phút 32 3.7 Sắc ký đồ EGCG chuẩn tốc độ dòng 1,2 ml/phút 33 3.8 Sắc ký đồ dược liệu Trà hoa vàng 34 3.9 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng dung môi đến hàm lượng EGCG chiết từ dược liệu 36 3.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ dược liệu/dung môi đến hàm lượng EGCG chiết 38 3.11 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng EGCG chiết từ dược liệu 39 3.12 Sắc ký đồ mẫu trắng MeOH 42 3.13 Sắc ký đồ mẫu chuẩn EGCG nồng độ 10µg/ml 42 3.14 Sắc ký đồ mẫu dược liệu Trà hoa vàng 43 3.15 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic EGCG 46 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt ký hiệu Giải thích ACN Acetonitril C Catechin CG Catechin gallat DĐVN V Dược điển Việt Nam V EC Epicatechin ECG Epicatechin gallat EGC Epigallocatechin EGCG Epigallocatechin gallat EtOH Ethanol 10 GC Gallocatechin 11 GCG Gallocatechin gallat 12 HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) 13 HDL 14 Lipoprotein tỉ trọng cao The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for ICH Pharmaceuticals for Human Use (Hội đồng quốc tế hài hòa yêu cầu kỹ thuật dược phẩm dùng cho người) 15 LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp 16 LOD Limit of Detection (Giới hạn phát ) 17 LOQ Limit of Quantifitation (Giới hạn định lượng) 18 MeOH Methanol không vượt 15% Như vậy, đường chuẩn xây dựng đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích định lượng HPLC 3.2.4 Độ xác Độ lặp lại đánh giá cách định lượng EGCG mẫu thử với thí nghiệm riêng biệt Kết thu thể bảng sau: 44 Bảng 3.10 Kết đánh giá độ lặp lại Khối lượng dược Diện tích pic Hàm lượng EGCG liệu (g) (µV*s) dược liệu (µg/g) 1,0037 555739 393,88 1,0017 551246 391,30 1,0042 560129 396,97 1,0072 560575 396,12 1,0047 560443 397,00 1,0009 550101 390,76 556372 ± 4782 394,34 ± 2,81 STT X ± SD RSD (%) 0,71 Nhận xét: kết thử độ lặp lại phương pháp cho thấy, điều kiện sắc ký chọn, độ lệch chuẩn tương đối kết 0,71 % (< 2%) Như vậy, phương pháp chọn đảm bảo độ lặp lại kết thử nghiệm thực song song Độ xác trung gian xác định cách tiến hành định lượng EGCG ngày khác Kết thu bảng 3.11: 45 Bảng 3.11 Kết định lượng EGCG ngày khác STT Ngày Ngày 393,88 391,78 391,30 399,29 396,97 393,67 396,12 395,23 397,00 396,82 390,76 397,38 𝑿 394,34 395,69 RSD 0,71 0,68 Hàm lượng EGCG trung bình thu 395,015 µg/g RSD trung bình ngày 0,70% Nhận xét: Từ bảng 3.10 bảng 3.11 thấy kết độ lặp lại ngày độ lặp lại khác ngày < 2% Điều chứng tỏ phương pháp có độ xác trung gian phù hợp 3.2.5 Độ Xác định độ phương pháp thêm chuẩn Thêm ml dung dịch chuẩn gốc EGCG 100 µg/ml vào bình nón chứa mẫu thử Kết thu bảng sau: Bảng 3.12 Kết đánh giá độ STT Lượng Diện tích píc chuẩn thêm (chuẩn+ thử) vào (µg) 204,08 Diện tích píc chuẩn Lượng tìm (µV*s) tìm lại (µV*s) lại (µg) 867995 311668 200,8 46 % Thu hồi 98,39 204,08 870079 313752 202,28 100,04 204,08 871893 315566 203,56 100,67 204,08 872947 316620 204,31 101,04 204,08 869491 313164 201,86 99,83 204,08 867268 310941 200,28 99,05 𝑋̅ ± 𝑆𝐷 99,84 ± 0,99 RSD (%) 0,77 Nhận xét: Tỷ lệ thu hồi đạt 98,85 – 100,83% so với lượng chuẩn thêm vào, RSD = 0,77%