BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TRẦN THANH MAI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KETOPROFEN TRONG TRANSFEROSOME BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KH.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TRẦN THANH MAI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KETOPROFEN TRONG TRANSFEROSOME BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TRẦN THANH MAI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KETOPROFEN TRONG TRANSFEROSOME BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Dược học KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Người hướng dẫn khóa luận: TS Nguyễn Văn Bạch HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, ban Giám đốc Học viện Quân y, phòng Đào tạo, hệ quản lý học viên Dân sự, trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược, khoa, phòng ban chức quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để học tập suốt năm qua thực khóa luận tốt nghiệp Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Văn Bạch – Giảng viên Bộ môn Kiểm nghiệm – Độc chất Cảm ơn thầy suốt thời gian làm khóa luận ln quan tâm hướng dẫn tận tình giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Trịnh Nam Trung tồn thể thầy giáo, giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Kiểm nghiệm – Độc chất môn khác thuộc trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược - Học viện Quân y nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tiến hành nghiên cứu, học tập để hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè, người đồng hành, ủng hộ động viên tơi q trình học tập q trình thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Trần Thanh Mai MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ KETOPROFEN 1.1.1 Cơng thức hố học 1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học 1.1.4 Dược động học 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Chỉ định liều dùng 1.1.7 Tác dụng không mong muốn chống định 1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.2 Các thông số đặc trưng trình sắc ký 1.2.3 Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.4 Xây dựng phương pháp định lượng 1.2.5 Thẩm định phương pháp định lượng HPLC 12 CHƯƠNG - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ 16 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 16 2.1.1 Nguyên vật liệu hóa chất nghiên cứu 16 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 17 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 17 b Thời gian thực khóa luận: 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng 17 2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng 19 2.2.3 Định lượng KETO transferosome 23 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 24 CHƯƠNG - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1.1 Kết xây dựng phương pháp định lượng 25 3.1.1.1 Kết khảo sát bước sóng phân tích 25 3.1.1.2 Kết khảo sát thành phần pha động 26 3.1.1.3 Kết khảo sát tốc độ dòng 28 3.1.1.4 Kết khảo sát dung mơi hịa tan mẫu thử 30 3.1.2 Kết thẩm định phương pháp định lượng HPLC 32 3.1.2.1 Tính tương thích hệ thống 32 3.1.2.2 Độ đặc hiệu 33 3.1.2.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 35 3.1.2.4 Độ 36 3.1.2.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 37 3.1.2.6 Độ lặp lại, độ chụm trung gian 38 3.1.3 Kết định lượng KETO transferosome 40 3.2 BÀN LUẬN 41 KẾT LUẬN 46 Về xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen transferosome 46 Về thẩm định phương pháp xây dựng theo hướng dẫn ICH 46 KIẾN NGHỊ 47 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Tổng hợp số nghiên cứu định lượng KETO HPLC 2.1 Các nguyên vật liệu, hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 2.2 Dãy dung dịch chuẩn KETO 21 2.3 Dãy dung dịch thử thêm chuẩn 22 3.1 Lựa chọn thành phần pha động 26 3.2 Lựa chọn tốc độ dòng 28 3.3 Kết khảo sát dung mơi hịa tan mẫu 30 3.4 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký 32 3.5 Kết khảo sát phụ thuộc Spic vào nồng độ dung dịch 35 3.6 Kết độ chệch điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn 36 3.7 Kết khảo sát độ 37 3.8 Kết khảo sát LOD LOQ 38 3.9 Kết khảo sát độ lặp lại 38 3.10 Kết khảo sát độ chụm trung gian 39 3.11 Hàm lượng KETO xác định ngày 40 3.12 Kết định lượng KETO transferosome 41 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Cơng thức cấu tạo ketoprofen 1.2 Đồ thị phương pháp thêm đường chuẩn 11 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại dung dịch KETO 20 µg/ml 25 3.2 Sắc ký đồ KETO chuẩn pha động Mb 26 3.3 Sắc ký đồ KETO chuẩn pha động Mb 27 3.4 Sắc ký đồ KETO chuẩn pha động Mb 27 3.5 Sắc ký đồ KETO chuẩn với tốc độ dòng 1,2 ml/phút 28 3.6 Sắc ký đồ KETO chuẩn với tốc độ dòng 0,8 ml/phút 29 3.7 Sắc ký đồ KETO chuẩn với tốc độ dòng 1,0 ml/phút 29 3.8 Sắc ký đồ dung mơi hịa tan mẫu thử MeOH 30 3.9 Sắc ký đồ dung mơi hịa tan mẫu thử EtOH 96% 31 3.10 Sắc ký đồ dung mơi hịa tan mẫu thử ACN 31 3.11 Sắc ký đồ mẫu trắng MeOH 33 3.12 Sắc ký đồ dung dịch KETO chuẩn 20 µg/ml 33 3.13 Sắc ký đồ dung dịch KETO thử 20 µg/ml 34 3.14 Sắc ký đồ dung dịch placebo 34 3.15 Đồ thị biểu thị phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic KETO 35 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ TT Viết tắt ACN Acetonitril ADR Adverse Drug Reaction (tác dụng không mong muốn thuốc) AOAC Association of Official Analytical Chemists (hiệp hội nhà hố phân tích thống) dd EtOH Ethanol HPLC High – performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu cao) ICH The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human use (hội nghị Quốc tế Hài hịa hóa Thủ tục đăng ký Dược phẩm sử dụng cho người) KETO LOD Limit of Detection (giới hạn phát ) 10 LOQ Limit of Quantifitation (giới hạn định lượng) 11 Mb 12 MeOH 13 PL 14 RSD 15 USFDA 16 USP Dung dịch Ketoprofen Mobile phase (pha động) Methanol Phụ lục Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tương đối) U.S Food and Drug Administration (cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ) United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) ĐẶT VẤN ĐỀ Ketoprofen dẫn chất acid propionic thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) Hiện nay, ketoprofen thuốc dùng để điều trị viêm xương khớp với nhiều dạng bào chế: viên nén, viên nang, viên nang giải phóng kéo dài, gel, … Tuy nhiên, bệnh nhân dùng liều cao dùng thuốc kéo dài, thuốc gây tác dụng khơng mong muốn Vì vậy, để giảm tác dụng phụ tránh chuyển hóa qua gan lần đầu phương pháp nhà khoa học mong đợi đưa thuốc qua da Tuy nhiên, dược chất tan bị hạn chế khả thấm qua hàng rào bảo vệ da Để cải thiện khả hấp thu tăng cường điều trị hướng đích, trách ảnh hưởng đến mô lành xung quanh, người ta dành quan tâm cho việc thiết kế chế phẩm chứa ketoprofen dạng transferosome Transfersome hệ thống mang thuốc thiết kế đặc biệt để có nhân nước bao bọc lớp kép lipid, với chất diện hoạt Nhân nước bao bọc lớp lipid kép giúp cho cấu trúc Transfersome có tính chất siêu biến dạng nên có khả tự tối ưu hóa tự điều chỉnh hình dạng qua màng Theo đó, transfersome có tính chất đàn hồi dễ dàng biến đổi hình dạng giữ nguyên tính chất co lại qua lỗ chân lơng hẹp chỗ co thắt da có đường kính nhỏ nhiều lần so với kích thước transfersome Tuy nhiên, DĐVN V Dược điển nước chưa có chuyên luận định lượng ketoprofen transferosome Với thực trạng đó, cần xây dựng phương pháp định lượng cụ thể, khoa học, góp phần đánh giá chất lượng thuốc có chứa ketoprofen transferosome thị trường Vì lý trên, đề tài “Nghiên cứu định lượng ketoprofen transferosome kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao” thực nhằm mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen transferosome Thẩm định phương pháp xây dựng theo hướng dẫn ICH Bảng 3.7 Kết khảo sát độ STT Lượng Diện tích chuẩn pic dung Lượng thêm dịch thử chuẩn tìm vào thêm chuẩn thấy (mg) (mg) (µV.s) 3,03 3,03 3,03 5,05 5,05 5,05 7,07 7,07 7,07 1223418 1221967 1221339 1533733 1522856 1529064 1847059 1843469 1845268 3,03 3,02 3,02 5,04 4,97 5,01 7,07 7,04 7,05 % Tìm thấy 100,00 99,69 99,56 99,76 98,37 99,16 99.93 99,61 99,77 Kết Kết SD = 0,23 RSD (%) = 0,23 SD = 0,57 RSD (%) = 0,58 SD = 0,16 RSD (%) = 0,16 RSD (%) = 0,32 Nhận xét: lượng chất chuẩn thu hồi lại mẫu thử thêm chuẩn nằm khoảng 98,37 % đến 100,00 % so với lượng chuẩn thêm vào; RSD = 0,32 % (< 2%) chứng tỏ phương pháp sử dụng có độ cao 3.1.2.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Theo kết khảo sát tính tương thích hệ thống sắc ký với mẫu chuẩn KETO nồng độ 20 µg/ml ta có thời gian lưu trung bình mẫu tR = 10,417 phút Trên sắc ký đồ mẫu trắng, đo tín hiệu nhiễu đường khoảng thời gian từ 9,2 đến 11,6 phút thu giá trị chiều cao = 60 µV Kết xác định LOD LOQ phương pháp thể bảng 3.8 37 Bảng 3.8 Kết khảo sát LOD LOQ Chỉ tiêu Chiều cao pic ước lượng (µV) LOD 180 (3 x Ho) LOQ 600 (10 x Ho) Nồng độ chất chuẩn (µg/ml) 0,01 0,015 0,02 0,048 0,05 0,052 Chiều cao pic thực tế đo (µV) 160 189 215 575 623 662 Nhận xét: theo kết bảng trên, phương pháp định lượng xây dựng có LOD = 0,015 µg/ml LOQ = 0,05 µg/ml 3.1.2.6 Độ lặp lại, độ chụm trung gian - Nồng độ làm việc dung dịch thử KETO 20 µg/ml Chạy sắc ký ghi sắc ký đồ dung dịch thử dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn: khối lượng cân mS = 0,02002 g Nồng độ dung dịch mẫu chuẩn: 19,98 µg/ml - Diện tích pic trung bình mẫu chuẩn: SS = 1519235 µV.s Kết khảo sát độ lặp lại trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết khảo sát độ lặp lại STT Diện tích pic (µV.s) Hàm lượng (µg/ml) 1467346 1510577 1511632 1512871 1510116 1513700 1519235 4,82 4,97 4,97 4,97 4,97 4,98 Dung dịch thử KETO (20 µg/ml) Dung dịch chuẩn TB SD RSD (%) 4,95 0,06 1,21 38 Nhận xét: kết thử độ lặp lại phương pháp cho thấy, điều kiện sắc ký chọn, độ lệch chuẩn tương đối kết 1,21 % (< 2%) Như vậy, phương pháp chọn đảm bảo độ lặp lại kết thử nghiệm thực song song Với độ chụm trung gian tiến hành sắc ký theo chương trình chọn thu kết bảng 3.10, 3.11 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ chụm trung gian Diện tích pic (µV.s) Hàm lượng (µg/ml) 1520431 5,00 1489203 4,90 1510901 4,97 1512671 4,97 1502132 4,94 1493700 4,91 STT Dung dịch thử KETO (20 µg/ml) Dung dịch chuẩn 1519235 TB 4,95 SD 0,04 RSD (%) 0,80 39 Bảng 3.11 Hàm lượng KETO xác định ngày STT Ngày Ngày 4,82 5,00 4,97 4,90 4,97 4,97 4,97 4,97 4,97 4,94 4,98 4,91 TB 4,95 4,95 SD ngày: 0,04 RSD ngày: 0,8% Nhận xét: Độ lặp lại kết định lượng ngày cho RSD đạt 1,21%; 0,80% ngày 0,79% nhỏ 2% Như phương pháp cho đảm bảo độ chụm trung gian 3.1.3 Kết định lượng KETO transferosome Trên sở phương pháp xây dựng, áp dụng để định lượng KETO mẫu transferosome ketoprofen mg/ml Kết định lượng tính tốn phương pháp chuẩn ngoại nghĩa so sánh diện tích pic dung dịch thử dung dịch chuẩn điều kiện sắc ký, từ tính hàm lượng KETO chế phẩm so với hàm lượng ghi nhãn theo công thức Mẫu chuẩn: mS = 20,02 mg SS = 1519398 µV.s Kết định lượng KETO transferosome thể bảng 3.12 40 Bảng 3.12 Kết định lượng KETO transferosome Hàm lượng (µV.s) Hàm lượng mẫu thử (mg/ml) 1524673 5,01 100,25 1532870 5,04 100,78 1518229 4,99 99,82 STT Diện tích pic thử TB (%) 100,28 Nhận xét: kết bảng 3.12 cho thấy hàm lượng KETO mẫu nghiên cứu 100,28% so với hàm lượng ghi nhãn Như vậy, mẫu thử đạt yêu cầu hàm lượng KETO 3.2 BÀN LUẬN Phương pháp HPLC phương pháp phân tích đại, sử dụng phổ biến phân tích định lượng dược phẩm Tuy có số nhược điểm giá thành trang thiết bị cao, dung mơi, hóa chất đắt tiền HPLC có nhiều ưu điểm bật tính ổn định, độ chọn lọc, tính xác cao định tính, định lượng đồng thời nhiều hoạt chất mà không cần phân tách Hầu hết hệ thống HPLC sử dụng kỹ thuật sắc ký pha đảo phân tích dược phẩm tiện dụng, nhanh chóng so với sắc ký pha thuận khả phân tích hàng loạt mẫu Do vậy, phương pháp xây dựng có tính thiết thực, nhiều khả áp dụng thực tế phân tích chế phẩm có chứa KETO Việt Nam Khóa luận phát triển từ phương pháp định lượng viên nang KETO giải phóng kéo dài USP 41 [2] Tiến hành chọn phương pháp coi phương pháp thống, có độ tin cậy cao so với báo khoa học So với chuyên luận định lượng KETO viên nang giải phóng kéo dài USP 41, phương pháp định lượng thay đổi điều kiện xử lý mẫu phân tích, bước sóng phân tích, nồng độ làm việc Do đối tượng phân tích USP 41 viên nang giải phóng kéo dài trạng thái rắn nên cần có giai đoạn chiết xuất trước pha loãng pha động đến nồng 41 độ định lượng Tuy nhiên, chế phẩm transferosome KETO trạng thái lỏng nên khơng cần bước hịa tan, dung môi cần phá hủy cấu trúc transferosome để giải phóng KETO thành dung dịch Dung mơi hịa tan mẫu thử sử dụng khóa luận chọn MeOH, tham khảo từ nghiên cứu tác giả Shukla K V Limsuwan T [33, 34] kết thực nghiệm MeOH cho hiệu suất hòa tan cao với tỷ lệ hàm lượng xác định so với hàm lượng nhãn đạt 96,8%, cao hẳn so với kết sử dụng dung môi ACN EtOH 96% 83,4 87,2% Ngoài ra, việc sử dụng dung mơi MeOH an tồn so với ACN, ACN tạo thành cyanid có độc tính cao q trình xử lý mẫu Khóa luận lựa chọn bước sóng phân tích 260 nm tương tự với bước sóng phân tích chế phẩm KETO dạng gel tác giả De Jalón E G cộng [19] Trong nghiên cứu khác, bước sóng phân tích sử dụng cách khơng thống nhất, dao động từ 230 đến 268 nm Trong USP 41 sử dụng bước sóng 254 nm để phát KETO viên nang giải phóng kéo dài Điều giải thích khả hấp thụ khác KETO dung môi khác Khi thực thí nghiệm này, bước sóng phân tích lựa chọn dựa phổ hấp thụ KETO pha động Bước sóng lựa chọn 260 nm khơng có khác biệt lớn so với USP 41 kết nghiên cứu khác Hàm lượng KETO transferosome định lượng nồng độ 20 µg/ml với khoảng tuyến tính từ 10 đến 40 µg/ml Trong nghiên cứu định lượng KETO gel tác giả Ưzlü C cộng sự, khoảng tuyến tính cơng bố 7,5 – 75 µg/ml [14] Mặt khác tác giả Zhou J cộng định lượng KETO viên nang giải phóng kéo dài với khoảng nồng độ tuyến tính 25 - 500 µg/ml [16] Có thể thấy, nồng độ định lượng sử dụng nghiên cứu phù hợp với liệu báo cáo Khoảng tuyến tính khóa luận xây dựng theo hướng dẫn ICH với nồng độ từ 50 đến 150% so với nồng độ định lượng Tuy nhiên, khoảng nồng độ cịn hẹp so với cơng bố tác giả Zhou J cộng (từ 25 đến 500 µg/ml) lại rộng so với nghiên cứu tác giả Koppala S cộng (từ 0,14 đến 0,58 µg/ml) [16, 18] Nguyên nhân dẫn đến khác biệt 42 khác biệt hàm lượng KETO mẫu thử, đặc điểm mẫu thử có hàm lượng hoạt chất dao động lớn Nghiên cứu có khảo sát pha động là: Mb 1: ACN – acid acetic 1% nước (45:55) Mb 2: ACN - đệm phosphat (pH 2,2; 0,01 M) (40:60) Mb 3: ACN - đệm phosphat (pH 1,5; 0,01 M) (60:40) Kết khảo sát lựa chọn pha động hỗn hợp ACN acid acetic 1% nước tỉ lệ 45:55 Pha động có thành phần tương tự pha động sử dụng chuyên luận định lượng KETO viên nang giải phóng kéo dài USP 41 Nhưng phương pháp chuẩn bị đơn giản so với USP 41 Thành phần pha động gồm ACN có ưu điểm độ nhớt thấp acid acetic có vai trị acid hóa dung môi làm tăng độ phân cực cho KETO, dẫn đến chất phân tích rửa giải nhanh khỏi pha tĩnh chân pic nhỏ hơn, hình dạng pic đẹp dễ đạt yêu cầu độ phân giải Ngoài ra, muối acetat so với muối phosphat cịn có ưu điểm dễ tan, dung mơi hữu ACN MeOH nên dễ dàng rửa khỏi cột thời gian ngắn không bị tủa lại cột Tuy nhiên, acid acetic có nhược điểm dễ bay hơi, nên cần ý chuẩn bị bảo quản Nếu pha động bị rị rỉ gây hỏng thiết bị tính chất ăn mịn Khóa luận sử dụng thời gian phân tích 15 phút, với thời gian lưu pic KETO khoảng 10,4 phút Kết ngắn so với thời gian lưu công bố nghiên cứu tác giả Koppala S cộng định lượng KETO viên nang (25,73 phút), dài so với thời gian phân tích báo cáo tác giả De Jalón E G cộng định lượng KETO gel (3,72 phút) [18, 19] Sự khác biệt thay đổi tốc độ dịng phân tích thành phần pha động sử dụng sắc ký So với thời gian lưu thu được, thời gian phân tích đủ để pic KETO tách hồn tồn khỏi pic cịn lại Đồng thời thành phần khác rửa giải khỏi cột để chuẩn bị cho lần phân tích Thời gian phân tích phương pháp coi ngắn không vượt 30 phút, ưu điểm bật nghiên cứu Việc tối thiểu hóa thời gian phân tích đảm 43 bảo mục tiêu phân tích nội dung quan trọng tối ưu hóa sắc ký Thời gian phân tích ngắn tiến hành nhiều mẫu nghiên cứu khoảng thời gian tiết kiệm pha động Nhưng thời gian phân tích q ngắn khơng đủ thành phần mẫu tách riêng, đặc biệt tách riêng khỏi pic KETO, khơng đảm bảo yêu cầu phương pháp phân tích Trong nghiên cứu này, độ phân giải pic KETO với pic liền kề 2,1 (>1,50) nên coi tách hoàn toàn khỏi pic khác Thời gian phân tích khơng thể q gần với thời gian lưu pic KETO, mẫu có thành phần phân cực KETO bị rửa giải khỏi cột sau Nếu thành phần nằm cột bị rửa giải lần sắc ký tiếp theo, làm cho lần phân tích không lặp lại pha tĩnh bị bẩn dần, dẫn đến thời gian lưu pic KETO bị thay đổi lần phân tích Mặt khác, thời gian phân tích dài so với thời gian lưu KETO khơng cần thiết, điều làm kéo dài thời gian phân tích khơng làm tăng thêm hiệu phân tích Về thẩm định phương pháp phân tích, nghiên cứu thực thực theo hướng dẫn ICH Theo đó, phương pháp định lượng cần thẩm định độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, tính phù hợp hệ thống, độ đúng, độ chụm (độ lặp lại, độ chụm trung gian) Tuy nhiên, khóa luận kiểm tra giới hạn định lượng giới hạn phát Về độ đặc hiệu, nghiên cứu sử dụng detector PDA nên tính chọn lọc chưa cao Việc xác định pic KETO dựa thời gian lưu cịn chưa hồn tồn đảm bảo tính đặc hiệu chất có tính chất phân cực rửa giải khỏi cột thời gian Trong nghiên cứu thực quét phổ hấp thụ tử ngoại pic đối chiếu với phổ KETO, nhiên thao tác không đủ đặc hiệu để phân biệt với sản phẩm phân hủy có cấu trúc gần với dược chất Để tăng độ đặc hiệu kết nối với detector có độ đặc hiệu cao detector khối phổ Về khoảng tuyến tính, theo gợi ý ICH, khoảng nên thực từ 80% đến 120% so với nồng độ định lượng, nghiên cứu có mở rộng so với yêu cầu từ 50% đến 200% so với nồng độ định lượng Đây ưu điểm đề tài, có khoảng tuyến tính rộng, phù hợp để định lượng mẫu có hàm lượng dao động lớn Mặc dù hệ số 44 tương quan R đường chuẩn đáp ứng yêu cầu, vậy, hệ số ảnh hưởng tính theo tỉ số hệ số tự phương trình đường chuẩn tín hiệu đo nồng độ định lượng cao (8,3%), điều hợp lý việc mở rộng nhiều khoảng tuyến tính Giá trị LOD LOQ nghiên cứu thấp giá trị công bố báo cáo tác giả Özlü C cộng (LOD 0,05 µg/ml, LOQ 0,16 µg/ml) [14], mặt khác lại cao nghiên cứu tác giả De Jalón E G cộng (LOD 0,003 µg/ml, LOQ 0,02 µg/ml) [19] 45 KẾT LUẬN Về xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen transferosome Đã xây dựng phương pháp định lượng KETO transferosome HPLC điều kiện sau: - Hệ thống sắc ký: hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D - Cột sắc ký pha đảo SunFireTM C18 (4,6 ì 250 mm, 5àm) - Detector UV bc súng 260 nm - Pha động: acetonitril : acid acetic 1% nước tỉ lệ 45:55 - Thể tích tiêm: 20µl - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Nhiệt độ: nhiệt độ phịng (25-26°C) - Dung mơi hịa tan mẫu: MeOH Về thẩm định phương pháp xây dựng theo hướng dẫn ICH Đã thẩm định phương pháp xây dựng tiêu sau: - Tính phù hợp hệ thống sắc ký: hệ thống sử dụng phù hợp đảm bảo tính ổn định cho phương pháp định lượng KETO - Độ đặc hiệu: chất khác có mặt mẫu thử khơng ảnh hưởng đến việc định lượng KETO - Xây dựng đường chuẩn KETO khoảng nồng độ từ 10-40 µg/ml có phương trình hồi quy Y= 71071X + 126947, hệ số R² = 0,9996, độ chệch điểm nồng độ nằm khoảng ±15% - Độ đúng: độ thu hồi đạt từ 98,37-100,00% giới hạn cho phép - Độ lặp lại, độ chụm trung gian: Cho giá trị RSD < 2% - LOD = 0,015 µg/ml LOQ = 0,05 µg/ml - Đã xác định hàm lượng KETO chế phẩm transferosome ketoprofen mg/ml nghiên cứu đạt 100,28% so với hàm lượng ghi nhãn 46 KIẾN NGHỊ Trong phạm vi khóa luận tốt nghiệp, tiến hành nghiên cứu xây dựng áp dụng phương pháp định lượng trực tiếp ketoprofen HPLC chế phẩm transferosome ketoprofen mg/ml bước đầu thu kết khả quan Xin đưa số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện phương pháp để ứng dụng định lượng ketoprofen chế phẩm khác áp dụng điều kiện sở kiểm tra chất lượng, phòng kiểm nghiệm khác - Tiến hành nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng thời KETO omeprazol chế phẩm kết hợp hai hoạt chất 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO The Merck Index CD (2002) Monographs: Ketoprofen USP 41 (2018) Monographs: Ketoprofen Capsules, ketoprofen extendedrelease capsules, Chapter 621: Chromatography Clarke's Analysis of Drugs and Poisons Third Edition (2005) Monographs: Ketoprofen Tsume Yasuhiro, Mudie Deanna M, Langguth Peter, et al (2014) The Biopharmaceutics Classification System: subclasses for in vivo predictive dissolution (IPD) methodology and IVIVC, European Journal of Pharmaceutical Sciences 57 152-163 doi: Henry D., Lim L L., Garcia R L A et al (1996) Variability in risk of gastrointestinal complications with individual non-steroidal anti- inflammatory drugs: results of a collaborative meta-analysis Bmj., 312 (7046): 1563-1566 Loftsson T., Hreinsdôttir D (2006) Determination of aqueous solubility by heating and equilibration: a technical note Aaps Pharmscitech., 7(1): E29E32 Sheng J (2007) In vitro release of ketoprofen from proprietary and extemporaneously manufactured gels The University of Michigan, Ann Arbor, Michigan Drug Bank Database Drug card for ketoprofen http://www.drugbank.ca/drugs/DB01009, truy cập ngày 20/04/2022 Shohin I E., Kulinich J I., Ramenskaya G V et al (2012) Biowaiver monographs for immediate-release solid oral dosage forms: ketoprofen J Pharm Sci 101(10): 3593-3603 10 Liversidge G G (1981) Ketoprofen Analytical profiles of drug substances, Elsevier: 443-471 11 Bộ Y Tế (2018) ketoprofen, Phụ lục V, Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, pp 541 - 543 12 Nciri N., Kwon W., Chung D S (2019), Rapid determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs by single-drop microextraction combined in-line with capillary electrophoresis 13 Yang F., Jin D (2017), Quantitative Analysis of Ketoprofen Enantiomers by Liquid Chromatography/Electrospray Ionization-Mass Spectrometry 14 Özlü C., Basan H., Şatana E et al (2005) Quantitative determination of ketoprofen in gels and ampules by using flow-injection UV spectrophotometry and HPLC, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 39 (3-4) 606-611 15 Andraws G., Trefi S (2020) Ionisable substances chromatography: A new approach for the determination of Ketoprofen, Etoricoxib, and Diclofenac sodium in pharmaceuticals using ion–pair HPLC, Heliyon (8) 16 Zhou J., Zheng X., Liu Q et al (2013) Chiral Separation and Quantitative Determination of Ketoprofen on New Cellulose Bonded Chiral Stationary Phase by HPLC, Advances in Biomedical Engineering Research (4) 75-81 17 Tsvetkova B., Peikova L (2013) HPLC determination of ketoprofen in tablet dosage forms, Trakia Journal of Sciences 11 (1) 55 18 Koppala S., Ranga R V., Anireddy J S (2016) Development and Validation of a Novel Stability-Indicating RP-HPLC Method for the Simultaneous Determination of Related Substances of Ketoprofen and Omeprazole in Combined Capsule Dosage Form, Journal of Chromatographic Science 54 (5) 765-775 19 De Jalón E G., Josa M., Campanero M A et al (2000) Determination by high-performance liquid chromatography of ketoprofen in vitro in rat skin permeation samples, Journal of Chromatography A 870 (1-2) 143-149 20 Bộ Y tế (2015) Dược thư quốc gia Việt Nam Nhà xuất Y học, pp 1982-1990 21 Martindale The Complete Drug Reference (2014) Thirty-eighth Edition 1522-1526 22 Đặng Văn Hòa, Vĩnh Định (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đại học), Nhà xuất giáo dục Việt Nam, pp 135-184 23 Charde Manoj S., Welankiwar A S., and Kumar Jitendra (2014) Method development by liquid chromatography with validation, International Journal of Pharmaceutical Chemistry (1) 06-10 doi: 10.7439/ijpc.v4i1.65 24 Sabir Azim Md, Moloy Mitra, and Bhasin Parminder S (2013) HPLC method development and validation: A review, Int Res J Pharm (4) 39-46 25 Center for Drug Evaluation and Research (CDER FDA) (1994), Validation of Chromatographic Methods, Reviewer Guidance 26 Bộ Y Tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm (sách dùng đào tạo dược sĩ đại học), Nhà xuất Y học, pp 104 - 110 27 Kataoka Hiroyuki and Lord Heather L (2002) Chapter 23 Sampling and sample preparation for clinical and pharmaceutical analysis, Comprehensive Analytical Chemistry 37 779-836 doi: 28 Satinder Ahuja Michael Dong (2005), Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, ed 1st, United States of America 29 Đoàn Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội 30 The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human use (2022) Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R2) 31 The European Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea 7th Edition vol 2, pp 2056 - 2057 32 Chu Hà My (2021) Bước đầu nghiên cứu bào chế transferosome ketoprofen Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Học viện Quân Y ... chống định 1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.2 Các thơng số đặc trưng q trình sắc ký 1.2.3 Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao ... QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng hiệu cao kỹ thuật phân tích dựa sở phân tách chất pha tĩnh chứa cột, nhờ dòng di chuyển pha động chất lỏng áp... trên, đề tài ? ?Nghiên cứu định lượng ketoprofen transferosome kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao? ?? thực nhằm mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen transferosome Thẩm định phương pháp