[Kl-Hup] Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Polyphenol Trong Cao Măng Cụt.pdf

Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH MINH XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TRONG CAO MĂNG CỤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÃ NỘI 2022 Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH[.]

Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH MINH XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TRONG CAO MĂNG CỤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÃ NỘI - 2022 Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH MINH Mã sinh viên: 1701372 XÂY DƯNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TRONG CAO MÀNG CỤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hưởng dẫn: PGS TS Nguyễn Thị Thuận ThS Trần Thị Thu Hiền Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa dược - Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày nội dung thuộc đề tài nghiên cứu mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người đà đồng hành, hỗ trợ em suốt thời gian làm nghiên cứu Bộ mơn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Thuận - giảng viên Bộ mơn Hóa dược, trường Đại học Dược Hà Nội, người đà tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện tổi đa suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Đồng thời em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Trần Thị Thu Hiền - Học viện Y Dược học cổ truyền Việt Nam thầy cô, cán kỹ thuật viên mơn Hóa dược quan tâm, hỗ trợ giúp đỡ em suốt thời gian làm nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu nhà trường, thầy cô giảng dạy giúp em trau dồi kiến thức kỹ suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln động viên, cố vũ em Đặc biệt, anh Dương Tiến Anh, chị Trần Thị Huyền Trang, chị Đinh Thị Lý, bạn Bùi Văn Son, bạn Phạm Thị Thu Trang, em Lã Hải Long em Phạm Thúy Hà đà giúp đỡ, hồ trợ em hồn thành khóa luận Trong q trình thực hồn thành khóa luận, việc thiếu sót khơng thể tránh khỏi Em mong nhận lời góp ý dẫn thầy đế khóa luận em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyên Bình Minh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẺ, sơ ĐÒ, ĐÒ THỊ ĐẶT VẤN ĐÈ CHƯƠNG TỐNG QUAN 1.1 Giới thiệu tổng quan măng cụt măng cụt 1.1.1 Nguồn gốc, phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái 1.1.4 Thành phần hóa học 1.2 Tổng quan chất nghiên cứu 1.2.1 Tổng quan nhóm polyphenol 1.2.2 Cấu trúc khung xanthon 1.2.3 Tính chất lý hóa a-mangostin Ỵ-mangostin 1.3 Tác dụng dược lý măng cụt họp chất xanthon 1.3.1 Theo y học cổ truyền 1.3.2 Theo y học đại 1.4 Các phương pháp phân tích bột dược liệu măng cụt hoạt chất mangostin 1.4.1 Phương pháp định tính bột dược liệu măng cụt 1.4.2 Phương pháp định lượng hoạt chất mangostin CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỦƯ .12 2.1 Đôi tượng nghiên cứu 12 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị .12 2.3 Nội dung nghiên cứu 12 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời a-mangostin Ỵ- mangostin cao vỏ măng cụt HPLC 12 2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng 13 2.3.3 ửng dụng định lượng mẫu cao chiết xuất phục vụ xác định điều kiện chiết xuất tối ưu 13 2.4 Phương pháp nghiên cứu 13 2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử .13 2.4.2 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký 14 2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 14 2.4.4 ứng dụng 17 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÃ BÀN LUẬN 18 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời a-mangostin Ỵ-mangostin cao vỏ măng cụt HPLC 18 3.1.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát 18 3.1.2 Khảo sát chương trình pha động 18 3.1.3 Khảo sát nhiệt độ cột 21 3.1.4 Điều kiện sẳc ký lựa chọn 22 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng HPLC 22 3.2.1 Độ thích họp hệ thống 22 3.2.2 Độ chọn lọc, đặc hiệu phương pháp 23 3.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 24 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 25 3.2.5 Độ 26 3.2.6 Độ xác (độ lặp lại độ xác trung gian) 27 3.3 ú’ng dụng 29 3.4 Bàn luận 32 3.4.1 xây dựng phương pháp định lượng 32 3.4.2 phương pháp phân tích thấm định phương pháp phân tích 33 3.4.3 mẫu định lượng 34 3.4.4 cao chiết cao chuẩn 34 CHƯƠNG KÉT LUẬN VÃ ĐÈ XUẤT 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Đề xuất 36 TÃI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ ACN Acetonitril AcOH Acid acetic AMG a-mangostin Tiếng Việt Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa Chemists học phân tích thức AOAC C18 Octadecylsilane DAD Diod Array Detector EtOH Ethanol GMG y-mangostin Detector mảng diod High Performance Liquid sẳc ký lỏng hiệu Chromatography cao HPLC 10 LOD Limit Of Detection Giới hạn phát 11 LOQ Limit Of Quantification Giới hạn định lượng 12 MeOH Methanol 13 N Number of the theory plates Số đĩa lý thuyết 14 Rf Retention Factor Hệ số lưu giữ Reverse Phase High Performance Sắc ký lỏng hiệu Liquid Chromatography cao pha đảo 15 RP-HPLC 16 Rs Resolution Độ phân giải 17 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Tín hiệu/nhiễu đường 18 S/N Signal/Noise 19 Tf Tailing factor Hệ số kéo đuôi 20 tR Retention time Thời gian lưu 21 ưv Ultraviolet Visible Quang phổ tử ngoại khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng AMG giới Bảng 2.1 Dày dung dịch chuẩn cần chuẩn bị 15 Bảng 2.2 Danh mục mẫu thử định lượng 17 Bảng 3.1 Chương trình gradient pha động lựa chọn 20 Bảng 3.2 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp 22 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ tuyến tính 24 Bảng 3.4 Kết xác định LOD, LOQ phương pháp 25 Bảng 3.5 Kết thẩm định độ GMG 26 Bảng 3.6 Kết thấm định độ AMG 26 Bảng 3.7 Kêt độ lặp lại độ xác trung gian ngày phân tích khác GMG AMG 27 Bảng 3.8 Kết độ xác trung gian khác người phân tích GMG AMG28 Bảng 3.9 Kết khảo sát dung môi chiêt xuất 29 Bảng 3.10 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 30 Bảng 3.11 Kết khảo sát thời gian chiết xuất 30 Bảng 3.12 Kết khảo sát tỷ lệ dược liệu/dungmôi 31 Bảng 3.13 Các thông số pic sắc ký khảo sát nhiệt độ cột 33 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, sơ ĐỊ, ĐỊ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh măng cụt Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất xanthon vó măng cụt Hình 1.3 Sơ đồ phân loại nhóm polyphenol Hình 1.4 Cấu trúc khung xanthon Hình 1.5 Cấu trúc hóa học AMG Hình 1.6 Cấu trúc hóa học GMG Hình 3.1 Phổ hấp thụ GMG (a) AMG (b) 18 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn khảo sát theo pha động (a) pha động (b) 19 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn khảo sát theo pha động (a) pha động (b) 19 Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khảo sát theo pha động xuất tạp 20 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu chuẩn chạy chương trình gradient nhiệt độ phịng 20 Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch tiêm tự động theo gradient 21 Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát mẫu chuấn chạy chương trình gradient hai nhiệt độ: nhiệt độ phòng (a) 35 °C (b) 21 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn chạy chương trình gradient nhiệt độ 35 °C 21 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch 23 Hình 3.10 Kết chồng phổ ƯV AMG (a) GMG (b) 23 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ GMG (a) AMG (b) 24 Hình 3.12 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ GMG 25 Hình 3.13 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ AMG 25 Hình 3.14 Biểu đồ kết khảo sát dung môi chiết xuất 29 Hình 3.15 Biểu đồ kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 30 Hình 3.16 Biểu đồ kết khảo sát thời gian chiết xuất 31 Hình 3.17 Biểu đồ kết khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Măng cụt (tên khoa học Garcinia mangostana L [3]) loại nhiệt đới trồng phổ biến Đông Nam Á Việt Nam, Malaysia, Indonesia Không biết đến loại trái thơm ngon, bổ dường mà măng cụt ứng dụng nhiều lĩnh vực y khoa, đặc biệt Từ xa xưa, vỏ đà sử dụng loại thuốc cổ truyền để điều trị đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, vết thương nhiễm khuẩn loét mãn tính [10] Thành phần vỏ đa dạng, gồm nhiều nhóm chất có hoạt tính xanthon, flavonoid, tri terpenoid, tanin [5] Trong thành phần xanthon thành phần coi hoạt chất quý Chất thuộc vào nhóm chất chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật gọi polyphenol Trong số hợp chất xanthon tìm thấy từ vỏ măng cụt, hoạt chất a- mangostin y-mangostin nghiên cứu nhiều quan tâm nhiều Với khung xanthon, a-mangostin khơng có tác dụng chống oxy hóa mạnh mà cịn có tác dụng kháng nấm, kháng dị ứng, kích thích hệ thống miễn dịch ức chế tế bào ung thư [25] Có thể nói, hợp chất tiềm thu hút nhiều quan tâm nhà nghiên cứu Hiện nay, có nhiều nghiên cứu báo tập trung đến chiết xuất polyphenol, song phương pháp định lượng hai thành phần cao vỏ măng cụt chưa trọng nghiên cứu sâu Xuất phát từ thực tế đó, khóa luận “Xây dựng phương pháp định lương polyphenol cao măng cụt” thực với mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời Ỵ-mangostin amangostin cao măng cụt - ứng dụng định lượng mẫu cao chiết xuất phục vụ xác định điều kiện chiết xuất tối ưu CHƯƠNG TƠNG QUAN 1.1 Giói thiệu tổng quan măng cụt vỏ măng cụt 1.1.1 Nguồn gốc, phân bố - Tên khoa học: Garcinia mangostana L - Họ: Bứa - Clusiaceae (Guttiferae) Hình 1.1 Hình ảnh măng cụt - Tên khác: Sơn trúc tử (Trung Quốc), Mangosteen, Brindonia tallow tree, Kokambutter tree (Anh), Mangoustan cultivé, Mangoustanier, Garcinic mangoustan (Pháp), Mangkhut (Thái Lan) [3, 6], - Phân bố, nguồn gốc: Garcỉnỉa L chi lớn gồm phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới, trừ châu Mỹ Ở Việt Nam, chi có 25 lồi, gỗ lớn Măng cụt có nguồn gốc từ Đơng Nam Á Nguời ta cho măng cụt nguồn gốc đảo Malaysia, Indonesia sau nhà truyền giáo đạo Gia tô di thực vào miền Nam Việt Nam Hiện trồng rộng rài Nam Bộ Tây Ninh, Thủ Dầu Một Cây trồng Philippin, Ân Độ, Sri Lanka, Mianmar, vùng Trung Mỹ Australia Ớ Việt Nam, măng cụt trồng miền Nam, đặc biệt tỉnh miền Tây miền Đơng Nam Bộ Cây ưa khí hậu nhiệt đới điển hình Ờ ngưỡng 20 °C 38 °C, sinh trưởng Cây trồng tỉnh miền Tây cho từ 2002000 Tùy theo giống măng cụt mà cho số lượng sản lượng khác [3, 6] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây to, cao tới 20-25m, có tán hình tháp Thân phân cành thấp mọc ngang, vỏ ngồi màu đen, có chất nhựa mủ màu vàng Lá mọc đối, phiến dày, hình thuẫn hình bầu dục, dài 12-20 cm, rộng 5-7 cm, gốc tròn, đầu thn nhọn, mặt màu lục sẫm, khơng có kèm, cuống dày Lá non màu tía Hoa đực hoa lưỡng tính, mọc đơn đơi, gốc Cụm hoa đực có 39 hoa, dài, tràng dày, có thùy, mặt ngồi màu vàng đỏ, mặt màu đỏ lục nhạt, nhị ngắn, đài 4, cánh hoa 4, nhị nhiều (16-17 nhị), bầu 5-8 Hoa lường tính có PHỤ LỤC SẢC KÝ ĐÔ CẤC MÂU ĐƯỜNG CHUẢN SMIMADZU LabSolutions Analysis Report «Sample lnformatĩon> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial# Injection Volume Date Acquired Date Processed : : : : : : : : : chuan d chuan c1 chuan c1Jcd XU ly ket qua.lcm tham dinh l.lcb 1-2 20 uL 09/06/2021 16:00:21 14/35/2021 10:15:17 Sample Type : Unknown Acquired by Pro-cessed by : System Administrator : System Administrator «ChromatOQram> mAU «Peak Tables* PDA Ch1 243nm Peak# Ret Time 7.614 16.138 Tota Area 18186 370643 397829 Height 1142 13874 15016 Cone 4.571 95.429 Unit Mark Sắc ký đồ chuẩn Cl PL-5 Name SMIMADZU LabSolutions Analysis Report «Sample Information > Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial# Injection Volume Date Acquired Date Processed : : : : : : : : : chuan c2 chuan c2 chuan c2.lcd XU ly ket qua.lorn tham dinh 1.lcb 1-3 20 uL 09/06/2021 16:29:58 14/06/2021 10:27:43 Sample Type : Unknown Acquired by Pro-cessed by : System Administrator : System Administrator «Chromatogram> mAU «Peak Tables* PDACK1 243nm Peak# Ret Tim e 7.615 16.128 Tcta Area 36084 765988 802073 Height 2240 27492 29731 Cone 4.499 95.501 Unii Mark Sắc ký đồ chuẩn C2 PL-6 Name SMIMADZU LabSolutlons Analysis Report «Sample Information > Sample Kame Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : : : : : : : : : chuan c3.7 chuan c3.7 chuan c3.7.lcd XU ly ke: qua.lcm tham dinh l.lcb 1-4 20 uL C0/36/2C21 10:28:25 14/06X2021 10:24:4® Sample Type : Unknown Acquired by Pro-cessed by : System Administrator : System Administrator «Chromatogram> mAU «Peak Tables* PDA Ch1 243nm Peak# Ret Time 7.591 16.1Ũ-2 Tota Area 95139 1944741 23398B0 Height 5753 66336 72C8Ỡ Cone 4.564 95.336 Unit Mark Sắc ký đồ chuẩn C3 PL-7 Name SMIMADZU LabSolutlons Analysis Report «Sample lnformation> Sample Name : chuan c4 Sample ID : chuan c4 Data Filename : chuan c4Jcd Method Filename : XU ly ket qua lcm : tham dinh l.lcb Batch Filename Vial # : 1-5 Injection Volume : 20 uL Date Acquired : C9/3&Í2C21 15:50:35 Date Processed : CS/3&CC21 17:3S:42 Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator «ChromatOQram> «Peak Table> PDACK1 243nm Peak# Ret Time 7.530 16.127 Tota Area 148810 3053758 3202388 Height 0023 99926 108053 Cone 4.641 35.359 Unit Mark Sắc ký đồ chuẩn C4 PL-8 Name Labsolutions Analysis Report Sample Name :chuan c5 Sample ID :chuan c5 Data Filename : chuan c5.lcd Method Filename : XU ly ke: qua.lcm Batch Filename : tham dinh l.lcb Vial # : 1-Ô Injection Volume : 20 uL Date Acquired : C9/0&Í2C21 17:29:11 Date ProceE-sed : 1VC6/2Ũ21 10:22:33 Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator Chromatograms- PDA Ch1 243nm Peak# Ret Time 7.57B 16.063 Tota Area 18370S 37615S9 3045368 Height 11114 122464 133573 Cone 4.653 95.342 Unit Mark Sắc ký đồ chuẩn C5 PL-9 Name SMIMADZU (.absolutions Analysis Report Sample Name :chuan CỠ Sample ID :chuan CỠ Data Filename : chuan -tfi.lcd Method Filename : XU ly ket qua.lcm Batch Filename : tham dinh Jeb Vial # : 1-7 Injection Volume : 20 uL Date Acquired : C9/3&2C21 17:&B:48 Date Processed : 1Ũ/D&Í2C21 13:34:28 Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : SyslBm Admin istra:or «Peak Table> PDAChl 243nm Peak# Re: Time 7.576 16.091 Tota Area 210919 4526830 4746719 Height 13520 143513 157033 Cone 4.633 95.367 Unit Mark Sắc ký đồ chuẩn C6 PL-10 Name PHỤ LỤC SÃC KÝ ĐÔ CÁC MÂU THÊM CHƯÂN, MÂU THỨ SMNADZU LabSolutlons Analysis Report «Sample Information > Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial# Injection Volume Date Acquired Date Prcces-sed LQC LQC LQC 3.lcd XU ly ket qua.lcm tham dinh Ucb 1-18 20 uL 10/05/2021 00:23:49 10/06/2021 13:5-8:34 Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU «Peak Table> PDA Ch1 243nm Peak# Ret Time 7.545 15.951 Tota Area 47712 978153 1025856 Height 3029 349-38 37937 Cone 4.551 95.349 Unit Mark Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn nồng độ thấp PL-11 Name SMIMADZU LabSolutions Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial# Injection Volume Date Acquired Date Processed : : : : : : : : : MQC Mac MQC led XU ly ke< qua Jem tham dinh 1.1cb 1-24 20 UL 10/06/2021 03:51:03 1Ũ/Ũ&2C-21 14:13:42 Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU PDACh! 243nm Peak# Ret Time 7.571 16.073 Tota Area 94653 1934837 2029499 Height 5896 64632 70528 Cone 4.564 95.336 Unit Mark Name Săc ký mâu thêm chn nơng độ trung bình PL-12 SMIMADZU LabSolutions Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial# Injection Volume Date Acquired Date Processed : : : : : : : : : HQC HQC HQC 3.lcd XU ly ket qua.lorn tham dinh 1.lcb 1-30 20 uL 10/06/2021 07:13:24 10/06/2021 13:46:14 Sample Type : Unknown Acquired by Pro-cessed by : System Administrator : System Administrator mAU PDAChl 243nm Peak# Ret Time 7.537 15.079 Tota Area 111422 2334720 2445142 Height 7016 76932 33947 Cone 4.555 95.445 Unit Mark Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn nồng độ cao PL-13 Name Labsolutions Analysis Rsport Sample Name : thu Sample ID : thu Data Filename :thu Jed Method Filename : XU ly ket qua.lcm : tham dinh l.lcb Batch Fiename Vial # : 1-9 Injection Volume : 20 uL Date Acquired : C9/36/2C21 15:27:39 Date Processed : 10AJ&2021 14:2 :C9 Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU PDACh! 243nm Peak# Ret Time 7.5&1 16.053 Tota Area 190801 2151658 2346459 Height 11602 71370 83172 Cone 8.380 91.620' Unit Mark Sắc ký đồ mẫu thử PL-14 Name PHỤ LỤC SẢC KÝ Đõ CẢC MÀU ĐỊNH LƯỢNG rrAU 12 10 DM1 (EtOH 50%) PDAChỊ 243nm Peak# Ret Time 7.433 16.565 Tota Area 103128 411938 Height 5553 13584 515065 19137 Cone 20.022 79.978 Unit Mark M Name Mầu thử DM1 (EtOH 50%)