Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme cellulose từ nấm mốc và ứng dụng trong sản xuất ethanol từ vỏ quả cà phê vối (coffea robusta)

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT ETHANOL TỪ VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta) Mã số đề tài IUH VSH1616 Chủ nhiệm đề tài ĐỖ VIẾT PHƯƠNG Đơn vị thực hiện VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên chúng tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hi.

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT ETHANOL TỪ VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta) Mã số đề tài: IUH.VSH16/16 Chủ nhiệm đề tài: ĐỖ VIẾT PHƯƠNG Đơn vị thực hiện: VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2017 LỜI CẢM ƠN Lời xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Cơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh, Phịng Quản lý Khoa học Hợp tác Quốc tế Viện Công nghệ Sinh học - Thực phẩm, trường Đại học Cơng Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện chúng tơi có hội để thực hoàn thành tốt đề tài Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Lê Nguyễn Đoan Duy TS Phạm Văn Tấn, người truyền cho nhiều kiến thức, thật nhiều kinh nghiệm đặc biệt có ý kiến đóng góp, trao đổi thật bổ ích Nó nguồn động lực giúp luôn cố gắng phấn đấu Qua đó, tơi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến cộng PGS.TS Đàm Sao Mai, ThS Đặng Thị Sáu, ThS Lê Hương Thủy, TS Trịnh Ngọc Nam, ThS Bùi Hồng Quân, TS Trần Thị Huyền tất nhân viên Phòng thí nghiệm Viện Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm em sinh viên khóa 8, hỗ trợ nhiệt tình trình thực đề tài Và lời cuối thật muốn cảm ơn, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, chia sẻ hỗ trợ chúng tơi Chúng tơi xin chân thành cảm ơn! TĨM TẮT Nấm mốc nhóm vi sinh vật phát triển mạnh điều kiện khí hậu Việt Nam Đặc biệt phế phụ liệu (giàu cellulose) từ trình trồng trọt chế biến cà phê như: đất, cành lá, thân gỗ mục, vỏ cà phê Nghiên cứu tập trung vào trình phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc Trichoderma asperellum (từ nguồn nêu trên) có khả sinh enzyme cellulase hoạt tính cao Kết nghiên cứu cho thấy rằng, có chủng Trichoderma phân lập từ cà phê Trong số đó, chủng Trichoderma asperellum QT5 có khả sinh tổng hợp cellulase hoạt tính cao đạt 1,17 U/mL (CMCase) sau 48 nuôi cấy môi trường lỏng Q trình tối ưu mơi trường ni cấy chủng nấm T asperellum QT5 lựa chọn sau: Môi trường lên men lỏng, tốc độ lắc 150 vịng/phút; thời gian ni cấy ngày; nhiệt độ ni cấy 350C; pH môi trường 7.0; chất cảm ứng 1% cám gạo; nồng độ dịch chiết khoai tây 100%; khoáng bổ sung KCl 1,5%; nguồn nitơ bổ sung (NH4)2SO4 0,2% Hoạt tính CMCase đạt 13,6 U/mL Sau enzyme thơ tinh sơ ethanol (tỷ lệ enzyme : ethanol : 3,5) Kết tinh sạch: hoạt tính CMCase đạt 21,72 U/mL (49,59 U/mg); hiệu suất thu hồi đạt 89,43%; độ tinh đạt 3,4 lần Vỏ cà phê phế liệu thải từ trình chế biến cà phê nhân ướt Vỏ cà phê tươi chiếm tới 40% trọng lượng toàn cà phê Trong vỏ cà phê hàm lượng chất xơ chiếm là: 25,88% cellulose; 3,6% hemicellulose 20,07% lignin Vỏ cà phê xem nguồn sinh khối lignocellulose lý tưởng việc sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng (đặc biệt sản xuất ethanol sinh học) Trong nghiên cứu này, vỏ cà phê tiền xử lý bới NaOH (0,2 g/g nguyên liệu) 1200C thời gian 20 phút Kết tốt thu được: 71,25% cellulose giữ lại; 46,11% hemicellulose bị loại bỏ; 76,63% lignin bị loại bỏ Sau nguyên liệu tiền xử lý thủy phân enzyme thu nhận từ chủng nấm mốc Trichoderma asperellum QT5 với tỷ lệ enzyme 25 FPU/g 500C thời gian 72 Toàn dịch thủy phân đem lên men với mật độ tế bào nấm men ban đầu 3x108 (tế bào/mL), lên men 350C thời gian 72 Kết thu hàm lượng ethanol đạt 10,06 g/L (tương đương với 7,6 g ethanol/100 g nguyên liệu) Kết rằng, với sản lượng vỏ cà phê dồi nguồn nguyên liệu tiềm cho sản xuất ethanol Việt Nam Từ khóa: Cellulase, vỏ cà phê, Coffea robusta, Trichoderma asperellum, tinh sạch, thu nhận enzyme, cồn sinh học, tiền xử lý, thủy phân, lên men MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH i DANH MỤC BẢNG iii ĐẶT VẤN ĐỀ iv TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI iv Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN v TÍNH KHẢ THI VÀ ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN v MỤC TIÊU TỔNG QUÁT .v MỤC TIÊU CỤ THỂ v CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU CÀ PHÊ 1.1.1 Giới thiệu vỏ cà phê vối 1.1.2 Một số ứng dụng từ vỏ cà phê .2 1.1.2.1 Làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn 1.1.2.2 Sản xuất dịch đạm 1.1.2.3 Chiết xuất caffeine 1.1.2.4 Sản xuất phân bón hữu 1.1.2.5 Sản xuất số sản phẩm khác 1.1.3 Khả kháng vi sinh vật caffeine phenolic có vỏ cà phê 1.1.3.1 Khả kháng khuẩn caffeine 1.1.3.2 Khả kháng khuẩn phenolic 1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME CELLULASE .6 1.2.1 Cấu trúc tính chất enzyme cellulase 1.2.2 Cơ chế xúc tác cellulase 1.2.3 Tính chất cellulase .11 1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP CELLULASE 13 1.3.1 Aspergillus niger 13 1.3.2 Trichoderma 15 1.4 GIỚI THIỆU VỀ ETHANOL SINH HỌC 17 1.4.1 Ethanol sinh học hệ thứ 18 1.4.2 Ethanol sinh học hệ thứ hai 19 1.4.3 Ethanol sinh học hệ thứ ba .19 1.4.4 Tình hình sản xuất ethanol giới 19 1.4.5 Sản xuất nghiên cứu ethanol Việt Nam .22 1.5 TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT LÊN MEN TẠOETHANOL 24 1.5.1 Nấm men 24 1.5.2 Vi khuẩn .25 1.5.3 Vi sinh vật lên men sinh ethanol từ xylose 26 1.6 TỔNG QUAN VỀ CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 26 1.6.1 Một số nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học giới 26 1.6.2 Một số nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học Việt Nam .29 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 32 2.1.1 Nguyên liệu 32 2.1.2 Nguồn phân lập nấm mốc 32 2.1.3 Hóa chất .33 2.1.4 Môi trường 33 2.1.5 Dụng cụ 33 2.1.6 Thiết bị 34 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .34 2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 34 2.2.2 Các phương pháp phân tích đo đạc 36 2.2.3 Phương pháp thu thập xử lý kết 44 2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 45 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc 45 2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng qt q trình sản xuất ethanol từ vỏ cà phê 47 2.3.3 Thí nghiệm 1: Phân lập số dịng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấm Aspergillus Trichoderma 47 2.3.4 Thí nghiệm 2: Định loại dòng nấm vừa phân lập 48 2.3.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả sinh tổng hợp cellulase dòng nấm mốc phân lập .49 2.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian nuôi cấy nấm mốc 49 2.3.7 Thí nghiệm 5: Khảo sát nhiệt độ môi trường nuôi cấy nấm mốc 50 2.3.8 Thí nghiệm 6: Khảo sát pH mơi trường ni cấy nấm mốc 51 2.3.9 Thí nghiệm 7: Khảo sát nồng độ dịch chiết khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy 52 2.3.10 Thí nghiệm 8-9: Khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng bổ sung vào môi trường nuôi cấy 53 2.3.11 Thí nghiệm 10-11: Khảo sát ảnh hưởng nguồn khoáng bổ sung vào môi trường nuôi cấy 54 2.3.12 Thí nghiệm 12-13: Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy 55 2.3.13 Thí nghiệm 14-15: Khảo sát ảnh hưởng (NH4)2SO4 NaCl đến khả kết tủa enzyme cellulase 57 2.3.14 Thí nghiệm 16-17: Khảo sát ảnh hưởng ethanol acetone đến khả kết tủa enzyme cellulase 58 2.3.15 Thí nghiệm 18: Xác định thành phần hóa học vỏ cà phê vối .60 2.3.16 Thí nghiệm 19: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ enzyme đến hàm lượng đường glucose thu sau trình thủy phân .60 2.3.17 Thí nghiệm 20: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thủy phân đến hàm lượng đường glucose đường khử thu 61 2.3.18 Thí nghiệm 21: Khảo sát ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men đến hàm lượng ethanol tạo thành sau trình lên men 62 2.3.19 Thí nghiệm 22: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 66 3.1 Kết phân lập số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấm Aspergillus Trichoderma 66 3.2 Kết định loại dòng vừa phân lập dựa đặc điểm đại thể vi thể .67 3.3 Kết đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme cellulase chủng nấm mốc phân lập .70 3.4 Định danh dòng nấm mốc phân lập 73 3.5 Tối ưu môi trường nuôi cấy T asperellum QT5 76 3.5.1 Kết ảnh hưởng thời gian nhiệt độ nuôi cấy T asperellum QT5 đến hoạt lực CMCase 76 3.5.2 Kết ảnh hưởng pH môi trường nồng độ dịch chiết khoai tây đến hoạt lực CMCase 77 3.5.3 Kết ảnh hưởng chất cảm ứng đến hoạt lực CMCase 78 3.5.4 Kết ảnh hưởng nguồn nitơ khoáng chất đến hoạt lực CMCase 79 3.6 Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ T asperellum QT5 80 3.6.1 Đánh giá khả kết tủa cellulase từ T asperellum QT5 muối (NH4)2SO4 80 3.6.2 Đánh giá khả kết tủa cellulase từ T asperellum QT5 muối NaCl .81 3.6.3 Đánh giá khả kết tủa cellulase từ T asperellum QT5 dung môi ethanol acetone 82 3.6.4 QUY TRÌNH THU NHẬN ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC T asperellum QT5 .85 3.7 Ứng dụng chủng nấm T asperellum QT5 vào trình sản xuất ethanol từ vỏ cà phê 86 3.7.1 Kết xác định thành phần hóa học vỏ cà phê 86 3.7.2 Kết tiền xử lý nguyên liệu vỏ cà phê kiềm NaOH 88 3.7.3 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme đến trình thủy phân 90 3.7.4 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến trình thủy phân 92 3.7.5 Ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men ban đầu bổ sung vào trình lên men 93 3.7.6 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu 94 3.7.7 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu 95 3.7.8 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ VỎ QUẢ CÀ PHÊ 98 3.7.9 TÍNH SƠ BỘ CHI PHÍ SẢN XUẤT RA 100 mL ETHANOL 99 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 100 4.1 KẾT LUẬN .100 4.2 KIẾN NGHỊ 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO a DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Khả sản xuất số sản phẩm từ vỏ cà phê Hình 1.2: Cơ chế thủy phân cellulose hệ cellulase Hình 1.3: Hình ảnh cấu trúc phân tử số cellulase Hình 1.4: Hình ảnh mơ hình cấu trúc khơng gian (A) trung tâm xúc tác (B) Cel12A từ H grisea .8 Hình 1.5: Cấu trúc vùng CBD Cel12A từ Humicola grisea .9 Hình 1.6: Hai chế xúc tác phức hệ cellulase 10 Hình 1.7: Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) phức hệ cellulose (B) 11 Hình 1.8: Hình thái Aspergillus sp 15 Hình 1.9 Nấm Trichoderma viride 16 Hình 1.10: Một số nguyên liệu sản xuất ethanol hệ thứ 18 Hình 2.1: Quả cà phê vối tươi 32 Hình 2.2: Vỏ cà phê vối tươi 32 Hình 2.6: Nguyên liệu kích thước - mm 35 Hình 2.5: Nguyên liệu kích thước 0,5 - mm 35 Hình 2.3: Ngun liệu kích thước < 0,25 mm 35 Hình 2.4: Ngun liệu kích thước 0,25 - 0,5 mm 35 Hình 2.7: Sơ đồ thu nhận xử lý mẫu 35 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát trình thu nhận cellulase từ nấm mốc 46 Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm q trình sản xuất ethanol từ vỏ cà phê 47 Hình 2.10 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt lực enzyme cellulase 50 Hình 2.11 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt lực enzyme cellulase 51 Hình 2.12 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt lực enzyme cellulase 52 Hình 2.13 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dịch chiết khoai tây đến hoạt lực enzyme cellulase 53 Hình 2.14 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng loại chất cảm ứng đến hoạt lực enzyme cellulase 54 Hình 2.15 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng loại nguồn khoáng bổ sung đến hoạt lực enzyme cellulase 55 Hình 2.16 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng loại nguồn nitơ bổ sung đến hoạt lực enzyme cellulase 56 Hình 2.17 Sơ đồ kết tủa enzyme cellulase muối vô .58 i Hình 2.18 Sơ đồ kết tủa enzyme cellulase dung môi hữu 60 Hình 2.19: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzyme đến trình thủy phân .61 Hình 2.20: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thủy phân đến hàm lượng đường glucose tạo thành .62 Hình 2.21: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men đến trình lên men 63 Hình 2.22: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thủy phân đến hàm lượng ethanol tạo thành 64 Hình 3.1 A niger phân lập từ cành mục, cà phê từ đất trồng 67 Hình 3.2 T viride phân lập từ cành mục, cà phê từ đất trồng 67 Hình 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc thuộc nhóm Aspergillus cấy điểm môi trường CZ 68 Hình 3.4 Đặc điểm khuẩn lạc thuộc nhóm Trichoderma cấy điểm môi trường CZ 68 Hình 3.5 Đặc điểm vi thể khuẩn lạc thuộc nhóm Aspergillus 69 Hình 3.6 Đặc điểm vi thể khuẩn lạc thuộc nhóm Trichoderma 70 Hình 3.7 Đường kính vòng phân giải CMC chủng nấm mốc 73 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt lực CMCase 77 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH nồng độ dịch chiết khoai tây đến hoạt lực CMCase 78 Hình 3.10 Ảnh hưởng chất cảm ứng đến hoạt lực CMCase 78 Hình 3.11 Ảnh hưởng nguồn nitơ khoáng chất đến hoạt lực CMCase 79 Hình 3.12 Hình ảnh chụp bề mặt vỏ cà phê kính hiển vi điện tử (SEM) (A) Nguyên liệu chưa qua tiền xử lý (B) nguyên liệu qua tiền xử lý với 0,2g NaOH/g nguyên liệu 1200C 25 phút 89 Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme cellulase bổ sung vào trình thủy 90 Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử .92 Hình 3.15 Ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men đến hàm lượng ethanol 94 Hình 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu 95 Hình 3.17 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu 96 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần hóa học vỏ cà phê (% theo chất khô) Bảng 1.2: Thành phần khoáng có vỏ cà phê (% theo chất khơ) Bảng 1.3: Thành phần carbohydrate có vỏ cà phê (% theo chất khô) Bảng 1.4: Hiệu trích ly caffeine từ vỏ cà phê Bảng 1.5: Khả sản xuất ethanol từ vài loại lignocellulose 17 Bảng 1.6: Các dạng ethanol sinh học sử dụng phổ biến .18 Bảng 1.7: Trữ lượng ethanol sản xuất từ nguồn sinh khối lignocellulose 19 Bảng 1.8 Dự tính sản lượng ethanol tồn cầu từ năm 2011 đến năm 2016 20 Bảng 3.1 Số dòng nấm mốc phân lập từ số nguồn .66 Bảng 3.2 Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme cellulase 71 Bảng 3.3 Đường kính vịng phân giải hoạt tính CMCase từ dòng nấm mốc 72 Bảng 3.4 Kết định danh chủng nấm mốc phân lập 73 Bảng 3.5 Hiệu tinh cellulase phương pháp kết tủa với muối (NH4)2SO4 .80 Bảng 3.6 Hiệu tinh cellulase phương pháp kết tủa với muối NaCl 81 Bảng 3.7 Hiệu tinh cellulase phương pháp kết tủa với ethanol 82 Bảng 3.8 Hiệu tinh cellulase phương pháp kết tủa với muối acetone 83 Bảng 3.9 So sánh hiệu tinh cellulase tác nhân kết tủa khác 84 Bảng 3.10 Thành phần hóa học vỏ cà phê vối (g/100g chất khô) 87 Bảng 3.11 Thành phần chất xơ có số sinh khối lignocellulose 87 Bảng 3.12 Sự thay đổi thành phần chất xơ vỏ cà phê trước sau tiền xử lý 88 Bảng 3.13 So sánh hiệu thủy phân số nguồn lignocellulose 91 Bảng 3.14 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu 96 Bảng 3.15 So sánh hiệu suất sản xuất ethanol từ số nguồn sinh khối lignocellulose .97 iii Số mẫu thí nghiệm: x lần lặp lại = 18 mẫu Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Chủng nấm mốc Ni cấy mơi trường lỏng C1 C4 C3 C2 C5 C6 Thu nhận dịch enzyme thơ Xác định hoạt tính cellulase Chọn pH mơi trường ni cấy thích hợp Hình 2.12 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt lực enzyme cellulase Cách tiến hành: 200 g khoai tây gọt vỏ, cắt nhỏ, thêm lít nước cất Đun sơi đợi 30 phút Sau lọc lấy dịch lấy 200 ml dịch cho vào erlen 250 ml Đậy nút lại mang hấp khử trùng nhiệt độ 1210C, 30 phút Khi hấp xong lấy làm nguội cấy vào ml dịch nấm mốc đếm với mật độ 7-8x107 CFU/ml Nuôi cấy thời gian xác định thí nghiệm nhiệt độ xác định thí nghiệm pH mơi trường điều chỉnh thay đổi từ đến Ở chế độ pH khác nhau, lấy 14 ml dịch enzyme ly tâm 10.000 v/p ,15 phút, sau lọc qua vải lọc Dịch enzyme thô đem xác định hoạt tính cellulase Dựa vào hoạt tính cellulase để chọn pH mơi trường ni cấy thích hợp Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme cellulase Kết thu nhận: Chọn pH mơi trường ni cấy thích hợp mà hoạt tính cellulase cao 2.3.9 Thí nghiệm 7: Khảo sát nồng độ dịch chiết khoai tây bổ sung vào mơi trường ni cấy Mục đích: Khảo sát thay đổi hoạt tính enzyme cellulase thay đổi nồng độ dịch chiết khoai tây bổ sung vào môi trường ni cấy Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với nhân tố Nhân tố D: Nồng độ dịch chiết khoai tây (%, v/v) D1: 40 D3: 80 D2: 560 D4: 100 D5: 120 52 Số nghiệm thức: Số mẫu thí nghiệm: x lần lặp lại = 15 mẫu Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Chủng nấm mốc Nuôi cấy môi trường lỏng D1 D3 D2 D4 D5 Thu nhận dịch enzyme thô Xác định hoạt tính cellulase Chọn nồng độ dịch chiết khoai tây thích hợp Hình 2.13 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dịch chiết khoai tây đến hoạt lực enzyme cellulase Cách tiến hành: Thời gian nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường xác định theo thí nghiệm 4, 5, Lấy 200 g khoai tây gọt vỏ, cắt nhỏ, thêm lít nước cất Đun sôi đợi 30 phút, dịch chiết hấp khử trùng nhiệt độ 1210C, 30 phút Khi hấp xong lấy làm nguội bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy khoảng nồng độ khác từ 40 đến 120% (v/v) Ở chế độ nồng độ khác nhau, lấy 14 ml dịch enzyme ly tâm 10.000 v/p ,15 phút, sau lọc qua vải lọc Dịch enzyme thô đem xác định hoạt tính cellulase Dựa vào hoạt tính cellulase để chọn nồng độ dịch chiết khoai tây bổ sung vào mơi trường ni cấy thích hợp Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme cellulase Kết thu nhận: Chọn nồng độ dịch chiết khoai tây thích hợp mà hoạt tính cellulase cao 2.3.10 Thí nghiệm 8-9: Khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng bổ sung vào mơi trường ni cấy Mục đích: Khảo sát thay đổi hoạt tính enzyme cellulase thay đổi loại chất cảm ứng bổ sung vào mơi trường ni cấy Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với nhân tố Nhân tố E: Cơ chất cảm ứng E1: CMC E3: bã mía E5: bột giấy 53 E2: rơm rạ E4: vỏ cà phê E6: cám gạo Số nghiệm thức: Số mẫu thí nghiệm: x lần lặp lại = 18 mẫu Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Chủng nấm mốc Ni cấy môi trường lỏng Cơ chất cảm ứng E1 E2 E3 E4 E5 E6 Thu nhận dịch enzyme thô Xác định hoạt tính cellulase Chọn chất cảm ứng thích hợp Hình 2.14 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng loại chất cảm ứng đến hoạt lực enzyme cellulase Cách tiến hành: Thời gian nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường nồng độ dịch chiết khoai tây xác định theo thí nghiệm 4, 5, 6, Tiếp tục bổ sung vào môi trường nuôi cấy loại chất cảm ứng khác nhau: CMC, rơm rạ, bã mía, vỏ cà phê, bột giấy cám gạo Sau nuôi cấy thu lấy lịch lọc đem ly tâm 10.000 v/p ,15 phút, sau lọc qua vải lọc Dịch enzyme thơ đem xác định hoạt tính cellulase Dựa vào hoạt tính cellulase để chọn chất cảm ứng phù hợp Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme cellulase Kết thu nhận: Chọn loại chất cảm ứng phù hợp mà hoạt tính cellulase cao 2.3.11 Thí nghiệm 10-11: Khảo sát ảnh hưởng nguồn khoáng bổ sung vào mơi trường ni cấy Mục đích: Khảo sát thay đổi hoạt tính enzyme cellulase thay đổi loại nguồn khống bổ sung vào mơi trường ni cấy Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với nhân tố Nhân tố G: Các loại nguồn khoáng 54 G1: BaCl2 G3: FeSO4 G5: CaCO3 G2: KCl G4: MgSO4 G6: Đối chứng Số nghiệm thức: Số mẫu thí nghiệm: x lần lặp lại = 18 mẫu Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Chủng nấm mốc Ni cấy mơi trường lỏng Khống vi lượng G1 G2 G3 G4 G5 G6 Thu nhận dịch enzyme thô Xác định hoạt tính cellulase Chọn khống chất thích hợp Hình 2.15 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng loại nguồn khoáng bổ sung đến hoạt lực enzyme cellulase Cách tiến hành: Tiến hành tương tự thí nghiệm 8-9 Tiếp tục bổ sung vào môi trường nuôi cấy loại nguồn khoáng khác nhau: KCl, CaCO3, FeSO4, BaCl, MgSO4 mẫu đối chứng khơng có bổ sung thêm nguồn khống Sau ni cấy thu lấy lịch lọc đem ly tâm 10.000 v/p ,15 phút, sau lọc qua vải lọc Dịch enzyme thơ đem xác định hoạt tính cellulase Dựa vào hoạt tính cellulase để chọn nguồn khoáng nồng độ khoáng bổ sung phù hợp Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme cellulase Kết thu nhận: Chọn loại nguồn khoáng bổ sung phù hợp mà hoạt tính cellulase cao 2.3.12 Thí nghiệm 12-13: Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy Mục đích: Khảo sát thay đổi hoạt tính enzyme cellulase thay đổi loại nguồn nitơ bổ sung vào mơi trường ni cấy 55 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với nhân tố Nhân tố I: Các loại nguồn nitơ I1: NH4NO3 I3: (NH4)2SO4 I5: KNO3 I2: Cao thịt I4: NH3 I6: Đối chứng Số nghiệm thức: Số mẫu thí nghiệm: x lần lặp lại = 18 mẫu Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Chủng nấm mốc Ni cấy mơi trường lỏng Nguồn nitơ bổ sung I1 I2 I3 I4 I5 I6 Thu nhận dịch enzyme thô Xác định hoạt tính cellulase Chọn nguồn nitơ thích hợp Hình 2.16 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng loại nguồn nitơ bổ sung đến hoạt lực enzyme cellulase Cách tiến hành: Tiến hành tương tự thí nghiệm 10-11 Tiếp tục bổ sung vào môi trường nuôi cấy loại nguồn nitơ khác nhau: (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4, Cao thịt, NH4NO3 mẫu đối chứng khơng có bổ sung thêm nguồn nitơ Sau nuôi cấy thu lấy lịch lọc đem ly tâm 10.000 v/p ,15 phút, sau lọc qua vải lọc Dịch enzyme thô đem xác định hoạt tính cellulase Dựa vào hoạt tính cellulase để chọn nguồn nitơ nồng độ nitơ bổ sung phù hợp Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme cellulase Kết thu nhận: Chọn loại nguồn nitơ bổ sung phù hợp mà hoạt tính cellulase cao 56 2.3.13 Thí nghiệm 14-15: Khảo sát ảnh hưởng (NH4)2SO4 NaCl đến khả kết tủa enzyme cellulase Mục đích: Tìm loại muối nồng độ muối thích hợp nhằm đạt hiệu kết tủa tốt mà khơng làm biến tính enzyme Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với nhân tố Nhân tố L: Nồng độ muối amoni sulfate (NH4)2SO4 L1: 35 ÷ 45% L3: 55 ÷ 65% L5: 75 ÷ 85% L2: 45 ÷ 55% L4: 65 ÷ 75% L6: 85 ÷ 95% L7: Đối chứng Nhân tố M: Nồng độ muối NaCl (%, w/v) M1: 15 M3: 25 M2: 20 M4: 30 M5: 35 Số nghiệm thức: 12 Số mẫu thí nghiệm: 12 x lần lặp lại = 36 mẫu Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Dung dịch muối (NH4)2SO4 NaCl Làm lạnh 40C ± 0,50C Dịch enzyme thô (40C ± 0,50C) Kết tủa (NH4)2SO4 (%, v/w) L1 L2 L3 L4 L5 NaCl (%, w/v) L6 L7 M1 M2 M3 Lắc nhẹ, ổn định 40C Ly tâm 10000 vòng 20 phút, 40C Thu lấy kết tủa Hòa tan đệm citrate, pH 4,8 57 M4 M5 Xác định hoạt tính enzyme, protein Chọn muối kết tủa nồng độ thích hợp Hình 2.17 Sơ đồ kết tủa enzyme cellulase muối vô Cách tiến hành: Dung dịch enzyme thô làm lạnh đến 40C trước thực trình kết tủa Dịch enzyme thô tiến hành kết tủa phân đoạn muối ammonium sulfate bão hòa bắt đầu từ 45% đến 95% sodium chloride bão hòa từ 15% đến 35% Đầu tiên, cho thể tích xác định dịch enzyme thô làm lạnh vào ống ly tâm Từ bảng tra nồng độ bão hòa muối (NH4)2SO4, NaCl, tính tốn khối lượng muối cần thiết phải cho vào dung dịch để đạt nồng độ bão hòa tương ứng Cho muối từ từ vào dung dịch enzyme lắc muối tan hoàn toàn Q trình kết tủa thực vịng 4°C, kết tủa tách máy ly tâm 10000 vòng/phút 20 phút 4ºC Sau trình ly tâm, kết tủa tách phần dung dịch lại đem xác định thể tích tiến hành tính tốn xác định lượng muối cần thiết cho vào để đạt nồng độ bão hòa Các bước thực lúc đầu nồng độ bão hịa cuối Sau đó, kết tủa thu phân đoạn muối bão hòa khác hòa tan trở lại dung dịch đệm citrate (pH 4,8) với thể tích vừa đủ Tiếp theo, phần kết tủa hòa tan đem thẩm tích dung dịch đệm citrate (pH 4,8) màng cellophane vòng 12 Sau cùng, ứng với từng phân đoạn muối bão hịa xác định hoạt tính, hàm lượng protein cellulase tính tốn hiệu tinh enzyme Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme cellulase, hàm lượng protein Kết thu nhận: Chọn loại muối kết tủa nồng độ thích hợp mà hoạt tính cellulase cao độ tinh cao 2.3.14 Thí nghiệm 16-17: Khảo sát ảnh hưởng ethanol acetone đến khả kết tủa enzyme cellulase Mục đích: Tìm loại dung mơi hữu nồng độ dung mơi thích hợp nhằm đạt hiệu kết tủa tốt mà không làm biến tính enzyme Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với nhân tố Nhân tố N: Tỷ lệ ethanol/enzyme thô (v/v) N1: 1,5/1 N3: 2,5/1 N5: 3,5/1 N2: 2/1 N4: 3/1 N6: 4/1 Nhân tố O: Tỷ lệ acetone/enzyme thô (v/v) O1: 1/1 O3: 2/1 58 O2: 1,5/1 O4: 2,5/1 Số nghiệm thức: 10 Số mẫu thí nghiệm: 10 x lần lặp lại = 30 mẫu Cách tiến hành: Dung dịch enzyme thô làm lạnh đến 40C trước thực trình kết tủa Tiến hành làm lạnh dung môi hữu trước đến nhiệt độ đạt ± 0,5°C, cho từ từ vào ống nghiệm chứa enzyme thô theo tỷ lệ bố trí, lắc nhẹ để ổn định 4°C Sau kết tủa, hỗn hợp ly tâm 4°C, 10000 vòng/phút 15 phút thu phần kết tủa Phần kết tủa hòa tan dung dịch đệm citrate (pH 4,8) Xác định hoạt tính cellulase, đo hàm lượng protein tính tốn hiệu tinh enzyme Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme cellulase, hàm lượng protein Kết thu nhận: Chọn dung mơi hữu nồng độ thích hợp mà hoạt tính cellulase cao độ tinh cao Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Dung môi hữu Làm lạnh 40C ± 0,50C Dịch enzyme thô (40C ± 0,50C) Kết tủa Ethanol (v/v) N1 N2 Acetone (v/v) N3 N4 N5 N6 O1 O2 Lắc nhẹ, ổn định 40C Ly tâm 10000 vòng 20 phút, 40C Thu lấy kết tủa Hòa tan đệm citrate, pH 4,8 59 O3 O4 Xác định hoạt tính enzyme, protein Chọn dung mơi hữu nồng độ thích hợp Hình 2.18 Sơ đồ kết tủa enzyme cellulase dung môi hữu 2.3.15 Thí nghiệm 18: Xác định thành phần hóa học vỏ cà phê vối Mục đích: Xác định số thành phần nguyên liệu vỏ cà phê vối, làm sở cho việc đánh giá khả sử dụng vỏ cà phê làm nguồn sinh khối lignocellulose để sản xuất ethanol sinh học Cách tiến hành: Quả cà phê vối tươi sau thu hái phân loại, làm tiến hành bóc tách vỏ Sau nghiền mịn mẫu tiến hành phân tích thành phần nguyên liệu Thí nghiệm tiến hành phân tích lần lặp lại tiêu khảo sát cho đợt lấy mẫu, gồm 15 tiêu đánh giá Khối lượng mẫu sử dụng: 15 tiêu x x 0,05 kg/mẫu = 2,25 kg (tính cho đợt lấy mẫu) Chỉ tiêu đánh giá: Độ ẩm (%), protein tổng số (%), lipid (%), pectin (%), tinh bột (%), đường khử (%), đường tổng số (%), tro (%), caffeine (%), phenolic (%), xơ tổng (%), cellulose (%), helicellulose (%), lignin (%) pH Kết thu nhận: Xác định số thành phần nguyên liệu vỏ cà phê vối làm sở cho thí nghiệm 2.3.16 Thí nghiệm 19: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ enzyme đến hàm lượng đường glucose thu sau trình thủy phân Mục đích: Khảo sát thay đổi hàm lượng đường glucose đường khử sau trình thủy phân thay đổi tỷ lệ enzyme cho vào trình thủy phân Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với nhân tố Nhân tố P: Tỷ lệ enzyme cellulase (tính theo hoạt lực FPU/g) P1: P3: 15 P5: 25 P2: 10 P4: 20 P6: 30 Số nghiệm thức: Số mẫu thí nghiệm: x lần lặp lại = 21 mẫu Khối lượng môi trường sử dụng: 21 x 0,1 kg/mẫu = 2,1 kg Sơ đồ bố trí thí nghiệm : 60 P7: 35 Nguyên liệu Khử caffeine phenolic Tiền xử lý Thủy phân P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 Xác định hàm lượng đường glucose, đường khử Chọn nồng độ enzyme thích hợp Hình 2.19: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzyme đến trình thủy phân Cách tiến hành: Tỷ lệ enzyme/dịch thủy phân thay đổi từ đến 10 (v/w) Nhiệt độ trình thủy phân 500C sau thời gian 72 tiến hành lọc lấy phần dịch đem xác định hàm lượng đường glucose tạo thành sau trình thủy phân Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường glucose, đường khử Kết thu nhận: Tỷ lệ enzyme thích hợp để thu lượng đường glucose cao 2.3.17 Thí nghiệm 20: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thủy phân đến hàm lượng đường glucose đường khử thu Mục đích: Khảo sát thay đổi hàm lượng glucose đường khử tạo thành tác động đồng thời nhân tố nhiệt độ thời gian thủy phân Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với nhân tố Nhân tố Q: Nhiệt độ thủy phân (0C) Q1: 35 Q3: 45 Q5: 55 Q2: 40 Q4: 50 Q6: 60 Q7: Control Nhân tố R: Thời gian thủy phân (ngày) R1: R3: R5: R7: R2: R4: R6: R8: Control 61 Số nghiệm thức: + = 15 Số mẫu thí nghiệm: 15 x lần lặp lại = 45 mẫu Khối lượng môi trường sử dụng: 45 x 0,1 kg/mẫu = 4,5 kg Cách tiến hành: Tỷ lệ enzyme/dịch thủy phân lựa chọn từ thí nghiệm 19 Q trình thủy phân vỏ cà phê tiến hành khoảng nhiệt độ thời gian khác nhau: nhiệt độ thay đổi từ 40 đến 550C, thời gian từ 48 đến 96 Sau trình thủy phân lọc lấy phần dịch thủy phân đem xác định hàm lượng đường glucose, đường khử tạo thành Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường glucose, đường khử Kết thu nhận: Nhiệt độ thời gian thích hợp để thu lượng đường glucose đường khử cao Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Nguyên liệu Khử caffeine phenolic Tiền xử lý Thủy phân Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 Q6 Q6 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R6 R6 Xác định hàm lượng đường glucose, đường khử Chọn nhiệt độ thời gian thủy phân thích hợp Hình 2.20: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thủy phân đến hàm lượng đường glucose tạo thành 2.3.18 Thí nghiệm 21: Khảo sát ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men đến hàm lượng ethanol tạo thành sau q trình lên men Mục đích: Khảo sát thay đổi hàm lượng ethanol thay đổi mật độ tế bào nấm men ban đầu cho vào q trình lên men Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với nhân tố 62 Nhân tố S: Mật độ tế bào nấm men (108 tế bào/ml) S1: S3: S2: S4: S5: Số nghiệm thức: Số mẫu thí nghiệm: x lần lặp lại = 15 mẫu Khối lượng môi trường sử dụng: 15 x 0,1 kg/mẫu = 1,5 kg Sơ đồ bố trí thí nghiệm : Nguyên liệu Khử caffeine phenolic Tiền xử lý Thủy phân Bổ sung mật độ tế bào nấm men S1 S2 S3 S4 S5 Xác định hàm lượng ethanol Chọn mật độ tế bào nấm men thích hợp Hình 2.21: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men đến trình lên men Cách tiến hành: Nấm men sau nhân giống cấp 1, cấp Tiến hành đếm số tế bào nấm men nhân giống cấp bổ sung vào dịch thủy phân với mật độ tế bào nấm men ban đầu thay đổi từ 2.108 đến 5.108 tế bào/mL Sau điều chỉnh pH = tiến hành lên men điều kiện nhiệt độ 300C, lắc 120 vòng/phút, thời gian 72 Sau kết thúc trình lên men, dịch sau lên men đem xác định hàm lượng đường glucose, ethanol để tính hiệu suất lên men Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng ethnaol tạo thành Kết thu nhận: Mật độ tế bào nấm men ban đầu thích hợp để thu lượng ethanol cao 63 2.3.19 Thí nghiệm 22: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu Mục đích: Khảo sát thay đổi hàm lượng ethanol tạo thành tác động đồng thời nhân tố nhiệt độ thời gian lên men Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với nhân tố Nhân tố T: Nhiệt độ lên men (0C) T1: 25 T3: 35 T5: 45 T2: 30 T4: 40 T6: 50 Nhân tố U: Thời gian lên men (giờ) U1: 24 U3: 72 U5: 120 U2: 48 U4: 96 Số nghiệm thức: + = 12 U6: Control Số mẫu thí nghiệm: 12 x lần lặp lại = 36 mẫu Khối lượng môi trường sử dụng: 36 x 0,1 kg/mẫu = 3,6 kg Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Nguyên liệu Tiền xử lý Thủy phân Lên men T1 T2 T3 T4 T5 U1 T6 U2 U3 U4 U5 U6 Xác định hàm lượng ethanol Chọn nhiệt độ thời gian lên men thích hợp Hình 2.22: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thủy phân đến hàm lượng ethanol tạo thành 64 Cách tiến hành: Mật độ tế bào nấm men lựa chọn từ thí nghiệm 21 Quá trình lên men tiến hành khoảng nhiệt độ thời gian khác nhau: nhiệt độ thay đổi từ 25 đến 400C, thời gian từ 24 đến 96 Sau kết thúc trình lên men, dịch sau lên men đem xác định hàm lượng đường glucose, ethanol để tính hiệu suất lên men Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng ethnaol tạo thành Kết thu nhận: Nhiệt độ thời gian lên men thích hợp để thu lượng ethanol cao 65 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết phân lập số dịng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấm Aspergillus Trichoderma Các mẫu nguyên liệu có chứa vi sinh vật cần phân lập sau vortex với nước muối sinh lý cấy sang đĩa petri với môi trường nuôi cấy PGA 300C Việc ni cấy tách rịng, thu nhận dịng nấm mốc phát triển mơi trường PDA có bổ sung chất cảm ứng 1% CMC thực hiện, dựa theo mô tả Klich (2002) Samuels (2004) Kết quan sát hình thái cho thấy có số khuẩn lạc màu trắng phát triển nhanh sau 24 ủ Nếu theo dõi thêm sau 48 72 nhận thấy chúng chuyển sang màu nâu nâu đen đen Đồng thời quan sát thấy có số khuẩn lạc 24 đầu q trình ủ có màu trắng sau 48 có màu xanh lục đến 72 có màu xanh đậm Điều phù hợp với mơ tả đặc tính hình thái số dịng nấm thuộc nhóm nấm Aspergillus Trichoderma của Klich (2002) Samuels (2004) Bảng 3.1 Số dòng nấm mốc phân lập từ số nguồn TT Nguồn phân lập Số dòng nấm Ký hiệu Số dòng nấm Aspergillus mẫu Trichoderma Đất trồng cà phê DA1, DA2 Quả cà phê QA1 … QA6 Cành mục CA1 … CA5 Tổng số 13 11 Ký hiệu mẫu DT1, DT2 QT1 … QT5 CT1 … CT4 Trong nghiên cứu phân lập nhận diện dòng A niger có khả sinh tổng hợp protopectinase, Xia et al (2009) xác nhận, phát triển dòng nấm mốc A niger môi trường PDA thể hình thành khuẩn lạc màu trắng 12 ÷ 24 sau ủ, sau phát triển nhanh chóng theo dạng tỏa trịn 48 ÷ 72 tùy thuộc đặc điểm từng dòng Nghiên cứu gần Gupta et al (2012), phát triển nấm mốc A niger bắt đầu với hình thành chấm màu kem bề mặt môi trường từ ngày thứ hai sau ủ môi trường PDA 300C, sau tăng trưởng theo dạng xoắn ốc trịn bề mặt cách nhanh chóng vịng Khi kích thước khuẩn lạc khoảng 2,5 ÷ cm, có hình thành đốm giống bột đen bề mặt môi trường chuyển sang màu đen hồn tồn sau 72 ni cấy 66 ... dần cạn kiệt, hướng nghiên cứu ? ?Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ nấm mốc ứng dụng sản xuất ethanol từ vỏ cà phê? ?? mở giải pháp tốt cho vấn đề iv Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN... men sinh ethanol từ xylose 26 1.6 TỔNG QUAN VỀ CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 26 1.6.1 Một số nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học giới 26 1.6.2 Một số nghiên cứu sản xuất ethanol. .. vi nấm Mô tả cách thu nhận mẫu: Quả cà phê mốc: dùng kẹp vô trùng gắp vài cà phê mốc cho vào túi PE có van chiều khóa kín miệng túi Tiếp tục lấy mẫu vị trí khác vườn trồng cà phê Thời gian thu