Cách tiến hành: Dung dịch enzyme thô được làm lạnh đến 40C trước khi thực hiện quá trình kết tủa.
Dịch enzyme thô được tiến hành kết tủa phân đoạn bằng muối ammonium sulfate bão hòa bắt đầu từ 45% đến 95% hoặc sodium chloride bão hòa từ 15% đến 35%. Đầu tiên, cho một thể tích xác định của dịch enzyme thơ đã làm lạnh vào trong ống ly tâm. Từ bảng tra nồng độ bão hòa muối (NH4)2SO4, NaCl, tính tốn được khối lượng muối cần thiết phải cho vào dung dịch để đạt được nồng độ bão hòa tương ứng. Cho muối từ từ vào dung dịch enzyme và lắc đều cho đến khi muối tan hoàn tồn. Q trình kết tủa được thực hiện trong vịng 2 giờ ở 4°C, tiếp theo kết tủa được tách ra bằng máy ly tâm 10000 vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC. Sau quá trình ly tâm, kết tủa được tách ra và phần dung dịch cịn lại được đem đi xác định thể tích và tiến hành tính tốn xác định lượng muối cần thiết cho vào để đạt được nồng độ bão hòa kế tiếp. Các bước tiếp theo cũng được thực hiện như lúc đầu và cho đến nồng độ bão hịa cuối cùng. Sau đó, kết tủa thu được ở các phân đoạn muối bão hòa khác nhau sẽ được hòa tan trở lại bằng dung dịch đệm citrate (pH 4,8) với thể tích vừa đủ. Tiếp theo, phần kết tủa được hòa tan sẽ đem đi thẩm tích trong dung dịch đệm citrate (pH 4,8) bằng màng cellophane trong vòng 12 giờ. Sau cùng, ứng với từng phân đoạn muối bão hịa xác định hoạt tính, hàm lượng protein của cellulase và tính tốn hiệu quả tinh sạch enzyme.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme cellulase, hàm lượng protein
Kết quả thu nhận: Chọn được loại muối kết tủa và nồng độ thích hợp mà tại đó
hoạt tính cellulase là cao nhất hoặc độ tinh sạch cao nhất.
2.3.14 Thí nghiệm 16-17: Khảo sát ảnh hưởng của ethanol và acetone đến khả năng kết tủa enzyme cellulase
Mục đích: Tìm ra loại dung mơi hữu cơ và nồng độ dung mơi thích hợp nhằm đạt
hiệu quả kết tủa tốt nhất mà khơng làm biến tính enzyme.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố.
Nhân tố N: Tỷ lệ ethanol/enzyme thô (v/v) N1: 1,5/1 N3: 2,5/1 N5: 3,5/1 N2: 2/1 N4: 3/1 N6: 4/1 Nhân tố O: Tỷ lệ acetone/enzyme thô (v/v)
O1: 1/1 O3: 2/1
Xác định hoạt tính enzyme, protein
59
O2: 1,5/1 O4: 2,5/1 Số nghiệm thức: 10
Số mẫu thí nghiệm: 10 x 3 lần lặp lại = 30 mẫu.
Cách tiến hành: Dung dịch enzyme thô được làm lạnh đến 40C trước khi thực hiện quá trình kết tủa.
Tiến hành làm lạnh dung môi hữu cơ trước đến nhiệt độ đạt 4 ± 0,5°C, cho từ từ vào các ống nghiệm chứa enzyme thô theo các tỷ lệ như đã bố trí, lắc nhẹ và để ổn định 2 giờ ở 4°C. Sau khi kết tủa, hỗn hợp được ly tâm ở 4°C, 10000 vòng/phút trong 15 phút thu được phần kết tủa. Phần kết tủa được hòa tan bằng dung dịch đệm citrate (pH 4,8). Xác định hoạt tính cellulase, đo hàm lượng protein và tính tốn hiệu quả tinh sạch enzyme.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme cellulase, hàm lượng protein
Kết quả thu nhận: Chọn được dung mơi hữu cơ và nồng độ thích hợp mà tại đó
hoạt tính cellulase là cao nhất hoặc độ tinh sạch cao nhất. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Dung mơi hữu cơ Làm lạnh 40C ± 0,50C Dịch enzyme thô (40C ± 0,50C) Kết tủa Acetone (v/v) Ethanol (v/v) O4 O3 O2 O1 N6 N5 N4 N3 N2 N1 Lắc nhẹ, ổn định 2 giờ ở 40C Ly tâm 10000 vòng trong 20 phút, 40C
Thu lấy kết tủa
60