CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5 TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT LÊN MEN TẠOETHANOL
Trong tự nhiên, rất nhiều vi sinh vật có thể sử dụng đường 5 và đường 6 carbon làm nguồn dinh dưỡng, do đó nó có thể lên men chuyển hóa các đường này thành ethanol. Một số vi sinh vật lên men ethanol phổ biến như nấm men Saccharomyces cerevisiae; Zymmomonas mobilis; E. coli… Để sàng lọc và lựa chọn chủng vi sinh vật có thể sử dụng trong sản xuất cơng nghiệp, các vi sinh vật phải đáp ứng một số tiêu chí nhất định: Có thể sử dụng dải cơ chất rộng; Có khả năng phát triển và lên men với hiệu suất cao; Sản phẩm phụ tạo thành trong q trình lên men tối thiểu; Có khả năng chịu độ cồn cao, pH thấp và nhiệt độ cao, khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường rẻ tiền (Đỗ Huy Định, 2003).
1.5.1 Nấm men
Nấm men là đối tượng được quan tâm trước hết trong lên men ethanol, đặc biệt là nấm men S. cerevisiae. Chúng là dạng nấm men đơn bào mang nhiều đặc điểm phong phú về sinh trưởng và phát triển, tế bào dạng hình cầu, bầu dục, elip, hoặc hơi dài, với kích thước 3 - 7 x 4 – 12 cm, khuẩn lạc nhẵn bóng, trịn, màu kem. Nấm men S. cerevisiae có đặc điểm sinh trưởng kị khí khơng bắt buộc, chúng vừa có khả năng hơ hấp và lên men ethanol. Sinh trưởng kị khí nghiêm ngặt ở S. cerevisiae chỉ xảy ra qua một vài thế hệ, vì sự tổng hợp sterol cần cho cấu trúc màng tế bào địi hỏi phải có khí O2.
Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh sản, phát triển nấm men, tốc độ lên men và chất lượng ethanol. Nấm men có thể chịu được nhiệt độ từ 4 – 450C, nhưng nhiệt độ phù hợp cho sự sinh sản và phát triển của nấm men là 24 – 300C. Ngoài ra, nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao đều làm cho quá trình lên men bị dừng trong khi hàm lượng đường trong dung dịch lên men còn cao, làm ảnh hưởng không tốt tới chất lượng ethanol. Nhiệt độ phù hợp cho quá trình lên men rượu truyền thống từ gạo là 24 – 280C và việc duy trì nhiệt độ ổn định trong suốt quá trình lên men là rất cần thiết (Nguyễn Thành Đạt,
1999).
Nấm men có thể sinh sản và phát triển trong mơi trường có pH từ 2,5 – 7,5, nhưng pH phù hợp nhất với sinh sản và phát triển của nấm men là 4,0 – 6,0. Vì vậy, để hạn chế quá trình lây nhiễm và phát triển của nhiều loại vi khuẩn, phù hợp với sinh trưởng của nấm men và pH tự nhiên của dịch lên men, trong nhân giống và sản xuất pH ln được duy trì ở mức 5,0 – 6,0.
25
Nấm men S. cerevisiae có thể lên men nhiều đường đơn như glucose, galactose, đường đôi như sucrose hoặc đường ba như raffinose. Nấm men đạt tốc độ sinh trưởng nhanh nhất khi hàm lượng đường trong dịch lên men là 1 – 2 %. Hàm lượng đường phù hợp cho quá trình lên men rượu là 16 – 20 %, hàm lượng đường 28 % sẽ ức chế quá trình lên men. Tỷ lệ các loại đường trong dịch lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men (Kockova-Kratochvilova, 2006). Ngồi ra nấm men này có khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao, ở 38 % đường tế bào nấm men không bị phá vỡ.
Nồng độ oxy hòa tan là điều kiện quan trọng cho giai đoạn sinh sản và phát triển của nấm men, quyết định đến hiệu suất và chất lượng rượu. Hàm lượng oxy hòa tan phù hợp cho sinh sản và phát triển của nấm men thường là: 0,65 – 0,70 mg/l. Khi mơi trường có đầy đủ oxy nấm men sẽ sử dụng đường làm nguồn năng lượng tăng sinh khối. Ngược lại khi môi trường thiếu oxy, nấm men lên men và chuyển hóa đường thành rượu. Vì vậy khi lên men rượu để có được hiệu suất lên men cao nhất, đồng thời hạn chế quá trình tạo aldehyl, rượu bậc cao, axeton... có trong rượu thành phẩm, cần phải hạn chế tối đa sự có mặt của oxy có trong dịch lên men (Kockova-Kratochvilova, 2006).
Mỗi chủng nấm men có khả năng chịu được nồng độ cồn khác nhau, một số chủng chỉ chịu được cồn ở nồng độ thấp như: Hansenula, Alanama.... Nhưng nấm men S. cerevisiae lại có khả năng chịu cồn tới 18 - 20 %. Trong quá trình lên men rượu, nồng độ cồn tăng dần sẽ ức chế không chỉ các hoạt động của nấm men mà cịn kìm hãm hoạt động của nhiều loại enzyme chuyển hóa đường thành rượu (Kockova-Kratochvilova,
2006). Các chủng này thường lên men ethanol với độ cồn đạt được từ 10 – 15 % ở pH
3,5 - 4,0 trong dải nhiệt độ từ 32 - 38 ºC. Với năng lực lên men cao và là đối tượng được tìm hiểu kỹ nhất, nấm men S. cerevisiae là ứng cử viên tiềm năng nhất cho cơng đoạn chuyển hóa glucose thành ethanol trong sản xuất cồn nhiên liệu từ sinh khối.
1.5.2 Vi khuẩn
Một loại vi khuẩn gram âm khá đặc biệt cũng nhận được nhiều sự quan tâm là Zymomonas mobilis. Loại vi khuẩn này có khả năng lên men đồng hình sinh ethanol và chịu được độ nồng độ cồn tới 120 g/l. Vi khuẩn Zymomonas là loại vi sinh vật duy nhất sử dụng glucose trong điều kiện yếm khí theo con đường Entner-Doudoroff (ED) trong khi đa số vi sinh vật khác sử dụng con đường Embden-Meyerhof (EM). Con đường ED tạo ra lượng ATP chỉ bằng một nửa so với EM trên cùng một lượng glucose, và do vậy Zymomonas tạo ra ít sinh khối hơn và lượng glucose chuyển trực tiếp thành ethanol cũng cao hơn. Hiệu suất sinh ethanol của Zymomonas khoảng 5 – 10 % cao hơn so với S. cerevisiae trên cùng một lượng glucose lên men. Vi khuẩn Z. mobilis là loại vi sinh vật không gây độc hại cho con người và khơng địi hỏi những điều kiện ni cấy ngặt nghèo như nhiều vi khuẩn khác. Trong những năm 1970-1980 một số nhà khoa học còn cho rằng Z. mobilis ưu việt hơn so với S. cerevisiae trong sản xuất cồn. Tuy nhiên, trong thực tế sản xuất S. cerevisiae vẫn là vi sinh vật được lựa chọn (da Silva Filho et al., 2005; Krishnan et al., 2000; Larsson et al., 2001; Lawford and Rousseau, 2003).
26
1.5.3 Vi sinh vật lên men sinh ethanol từ xylose
Một trong những khó khăn khi lên men dịch thủy phân sinh khối thực vật là rất ít vi sinh vật có khả năng lên men xylose (chiếm 20 – 30 % lượng đường tạo ra). Cả nấm men S. cerevisiae và vi khuẩn Z. mobilis đều khơng có khả năng này. Trong số hơn một nghìn lồi nấm men được biết chỉ có 4 lồi có khả năng lên men xylose ở các mức độ khác nhau. Hiện nay nấm men Pachysolen tannophilus đang được sử dụng trong lên men dịch thủy phân hemicellulose (sản phẩm chủ yếu là xylose) để tạo ethanol. Tuy nhiên nấm men P. tannophilus khơng tích lũy được quá 2 % ethanol trong canh trường và điều này là hạn chế rất lớn trong sản xuất. Chính vì những lý do đó hiện nay có nhiều nhóm nghiên cứu đang tập trung vào cải thiện đặc tính chủng giống theo hướng chuyển các gene cần thiết cho khả năng lên men xylose vào S. cerevisiae.
Đã có một số thành tựu nhất định đạt được trong lĩnh vực này, tuy nhiên để tiếp cận được với sản xuất công nghiệp những chủng giống này cịn phải có được cải thiện nhiều hơn nữa. Một trong những hướng nghiên cứu cũng được thực hiện khá tích cực là tạo những chủng E. coli có khả năng lên men đồng thời nhiều loại đường và phát triển được trên những mơi trường có thành phần đơn giản hơn. Nhiều kết quả khả quan đã đạt được tuy nhiên việc ứng dụng các chủng E. coli tái tổ hợp cịn vấp phải những khó khăn như dải pH hoạt động rất hẹp và ở vùng trung tính (pH 6 - 8), độ an tồn của E.coli đối với con người và môi trường, cũng như khả năng sử dụng sinh khối của E. coli sau khi lên men ít được nghiên cứu. Tương tự như vậy cũng có nhiều nghiên cứu trong việc chuyển các operon mã hóa khả năng đồng hóa xylose và các enzyme trong con đường pentozophosphate sang Z. mobilis. Những chủng Z. mobilis tái tổ hợp có khả năng chuyển hóa cả glucose và xylose ở trạng thái hỗn hợp sang ethanol và điều này rất có ý nghĩa trong lên men dịch thủy phân. Z. mobilis cũng có chung nhược điểm như E.coli là hoạt động ở pH trung tính và điều này gây cản trở trong việc ngăn chặn dịch lên men khỏi các vi sinh vật khác. Với S. cerevisiae việc đảm bảo chống nhiễm trùng sẽ dễ dàng hơn do nấm men này hoạt động ở pH mang tính axit. Một số loại vi sinh vật khác cũng được nghiên cứu nhằm ứng dụng trong lên men sinh ethanol như Clostridium thermocellum, Neurospora crassa, Zygosaccharomyces rouxii…tuy nhiên những vi sinh vật này có hạn chế là khả năng tích lũy ethanol rất thấp (Dien, 2003; Sedlak and Ho,
2004; Zaldivar, 2005).