2.3.15 Thí nghiệm 18: Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả cà phê vối
Mục đích: Xác định một số thành phần cơ bản của nguyên liệu vỏ quả cà phê vối,
làm cơ sở cho việc đánh giá khả năng sử dụng vỏ quả cà phê làm nguồn sinh khối lignocellulose để sản xuất ethanol sinh học.
Cách tiến hành: Quả cà phê vối tươi sau khi thu hái được phân loại, làm sạch và
tiến hành bóc tách vỏ quả. Sau đó nghiền mịn mẫu và tiến hành phân tích các thành phần cơ bản trong nguyên liệu. Thí nghiệm tiến hành phân tích 3 lần lặp lại ở mỗi chỉ tiêu khảo sát cho mỗi đợt lấy mẫu, gồm 15 chỉ tiêu đánh giá.
Khối lượng mẫu sử dụng: 15 chỉ tiêu x 3 x 0,05 kg/mẫu = 2,25 kg (tính cho 1 đợt lấy mẫu).
Chỉ tiêu đánh giá: Độ ẩm (%), protein tổng số (%), lipid (%), pectin (%), tinh bột
(%), đường khử (%), đường tổng số (%), tro (%), caffeine (%), phenolic (%), xơ tổng (%), cellulose (%), helicellulose (%), lignin (%) và pH.
Kết quả thu nhận: Xác định được một số thành phần cơ bản trong nguyên liệu vỏ
quả cà phê vối làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.16 Thí nghiệm 19: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng
đường glucose thu được sau q trình thủy phân
Mục đích: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng đường glucose và đường khử sau quá
trình thủy phân dưới sự thay đổi của tỷ lệ enzyme cho vào quá trình thủy phân.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố.
Nhân tố P: Tỷ lệ enzyme cellulase (tính theo hoạt lực FPU/g)
P1: 5 P3: 15 P5: 25 P7: 35
P2: 10 P4: 20 P6: 30
Số nghiệm thức: 7
Số mẫu thí nghiệm: 7 x 3 lần lặp lại = 21 mẫu.
Khối lượng môi trường sử dụng: 21 x 0,1 kg/mẫu = 2,1 kg. Sơ đồ bố trí thí nghiệm :
Xác định hoạt tính enzyme, protein
61
Hình 2.19: Sơ đồ nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân
Cách tiến hành: Tỷ lệ enzyme/dịch thủy phân được thay đổi từ 2 đến 10 (v/w). Nhiệt độ quá trình thủy phân là 500C và sau thời gian 72 giờ thì tiến hành lọc lấy phần dịch đem xác định hàm lượng đường glucose tạo thành sau quá trình thủy phân
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường glucose, đường khử.
Kết quả thu nhận: Tỷ lệ enzyme thích hợp để thu được lượng đường glucose cao
nhất.
2.3.17 Thí nghiệm 20: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân
đến hàm lượng đường glucose và đường khử thu được
Mục đích: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng được glucose và đường khử tạo thành
dưới sự tác động đồng thời của 2 nhân tố nhiệt độ và thời gian thủy phân.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố.
Nhân tố Q: Nhiệt độ thủy phân (0C)
Q1: 35 Q3: 45 Q5: 55 Q7: Control
Q2: 40 Q4: 50 Q6: 60
Nhân tố R: Thời gian thủy phân (ngày)
R1: 1 R3: 3 R5: 5 R7: 7
R2: 2 R4: 4 R6: 6 R8: Control
Xác định hàm lượng đường glucose, đường khử Khử caffeine và phenolic Tiền xử lý P1 P2 P6 P7 Nguyên liệu Thủy phân P3 P5 Chọn được nồng độ enzyme thích hợp P4
62
Số nghiệm thức: 7 + 8 = 15.
Số mẫu thí nghiệm: 15 x 3 lần lặp lại = 45 mẫu.
Khối lượng môi trường sử dụng: 45 x 0,1 kg/mẫu = 4,5 kg.
Cách tiến hành: Tỷ lệ enzyme/dịch thủy phân được lựa chọn từ thí nghiệm 19. Q
trình thủy phân vỏ quả cà phê được tiến hành ở các khoảng nhiệt độ và thời gian khác nhau: nhiệt độ thay đổi từ 40 đến 550C, thời gian từ 48 đến 96 giờ. Sau quá trình thủy phân lọc lấy phần dịch thủy phân đem xác định hàm lượng đường glucose, đường khử tạo thành.
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường glucose, đường khử.
Kết quả thu nhận: Nhiệt độ và thời gian thích hợp để thu được lượng đường glucose
và đường khử cao nhất. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.20: Sơ đồ nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng đường glucose tạo thành
2.3.18 Thí nghiệm 21: Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến hàm
lượng ethanol tạo thành sau quá trình lên men
Mục đích: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng ethanol dưới sự thay đổi của mật độ tế
bào nấm men ban đầu cho vào quá trình lên men.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố.
Xác định hàm lượng đường glucose, đường khử
Tiền xử lý Thủy phân
Khử caffeine và phenolic Nguyên liệu
Chọn được nhiệt độ và thời gian thủy phân thích hợp
Q6 Q5 Q4 Q3 Q2 Q1 Q6 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R6 R6
63
Nhân tố S: Mật độ tế bào nấm men (108 tế bào/ml)
S1: 1 S3: 3 S5: 5
S2: 2 S4: 4 Số nghiệm thức: 5
Số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 lần lặp lại = 15 mẫu.
Khối lượng môi trường sử dụng: 15 x 0,1 kg/mẫu = 1,5 kg. Sơ đồ bố trí thí nghiệm :
Hình 2.21: Sơ đồ nghiên cứu sự ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến quá trình lên men
Cách tiến hành: Nấm men sau khi nhân giống cấp 1, rồi cấp 2. Tiến hành đếm số
tế bào nấm men trong nhân giống cấp 2 rồi bổ sung vào dịch thủy phân với mật độ tế bào nấm men ban đầu thay đổi từ 2.108 đến 5.108 tế bào/mL. Sau đó điều chỉnh pH = 5 rồi tiến hành lên men trong điều kiện nhiệt độ 300C, lắc 120 vòng/phút, thời gian 72 giờ. Sau khi kết thúc quá trình lên men, dịch sau lên men đem đi xác định hàm lượng đường glucose, ethanol để tính hiệu suất lên men.
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng ethnaol tạo thành
Kết quả thu nhận: Mật độ tế bào nấm men ban đầu thích hợp để thu được lượng
ethanol cao nhất. Khử caffeine và phenolic Tiền xử lý S1 S2 Nguyên liệu Xác định hàm lượng ethanol Thủy phân S3 S4 Bổ sung mật độ tế bào nấm men
Chọn được mật độ tế bào nấm men thích hợp
64
2.3.19 Thí nghiệm 22: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men
đến hàm lượng ethanol thu được
Mục đích: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng ethanol tạo thành dưới sự tác động đồng
thời của 2 nhân tố nhiệt độ và thời gian lên men.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố.
Nhân tố T: Nhiệt độ lên men (0C)
T1: 25 T3: 35 T5: 45
T2: 30 T4: 40 T6: 50
Nhân tố U: Thời gian lên men (giờ)
U1: 24 U3: 72 U5: 120
U2: 48 U4: 96 U6: Control
Số nghiệm thức: 6 + 6 = 12.
Số mẫu thí nghiệm: 12 x 3 lần lặp lại = 36 mẫu.
Khối lượng môi trường sử dụng: 36 x 0,1 kg/mẫu = 3,6 kg. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.22: Sơ đồ nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng ethanol tạo thành
Lên men
Xác định hàm lượng ethanol Tiền xử lý
Thủy phân Nguyên liệu
Chọn được nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp
T6 T5 T4 T3 T2 T1 U1 U2 U3 U4 U5 U6
65
Cách tiến hành: Mật độ tế bào nấm men được lựa chọn từ thí nghiệm 21. Q trình
lên men được tiến hành ở các khoảng nhiệt độ và thời gian khác nhau: nhiệt độ thay đổi từ 25 đến 400C, thời gian từ 24 đến 96 giờ. Sau khi kết thúc quá trình lên men, dịch sau lên men đem đi xác định hàm lượng đường glucose, ethanol để tính hiệu suất lên men.
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng ethnaol tạo thành
Kết quả thu nhận: Nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp để thu được lượng
66
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Kết quả phân lập một số dịng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm
nấm Aspergillus và Trichoderma
Các mẫu nguyên liệu có chứa vi sinh vật cần phân lập sau khi vortex với nước muối sinh lý sẽ được cấy sang đĩa petri với môi trường nuôi cấy PGA ở 300C. Việc ni cấy và tách rịng, thu nhận các dòng nấm mốc đã phát triển trên mơi trường PDA có bổ sung cơ chất cảm ứng là 1% CMC được thực hiện, dựa theo mô tả của Klich (2002) và Samuels (2004).
Kết quả quan sát hình thái cho thấy có một số khuẩn lạc màu trắng phát triển nhanh sau 24 giờ ủ. Nếu theo dõi thêm sau 48 giờ và 72 giờ thì nhận thấy chúng chuyển sang màu nâu rồi nâu đen hoặc đen. Đồng thời cũng quan sát thấy có một số khuẩn lạc trong 24 giờ đầu của q trình ủ thì có màu trắng và sau 48 giờ thì có màu xanh lục rồi đến 72 giờ thì có màu xanh đậm. Điều này cũng phù hợp với mơ tả đặc tính hình thái của một số dịng nấm thuộc nhóm nấm Aspergillus và Trichoderma của của Klich (2002) và
Samuels (2004).
Bảng 3.1. Số dòng nấm mốc phân lập được từ một số nguồn TT Nguồn phân lập Số dòng nấm TT Nguồn phân lập Số dòng nấm Aspergillus Ký hiệu mẫu Số dòng nấm Trichoderma Ký hiệu mẫu 1 Đất trồng cà phê 2 DA1, DA2 2 DT1, DT2
2 Quả cà phê 6 QA1 …
QA6 5 QT1 … QT5 3 Cành lá mục 5 CA1 … CA5 4 CT1 … CT4 Tổng số 13 11
Trong nghiên cứu phân lập và nhận diện dòng A. niger có khả năng sinh tổng hợp protopectinase, Xia et al. (2009) cũng đã xác nhận, sự phát triển của dịng nấm mốc A.
niger trên mơi trường PDA thể hiện ở sự hình thành khuẩn lạc màu trắng trong 12 ÷ 24
giờ ngay sau khi ủ, sau đó phát triển nhanh chóng theo dạng tỏa trịn ở 48 ÷ 72 giờ tùy thuộc đặc điểm từng dòng. Nghiên cứu gần đây của Gupta et al. (2012), sự phát triển của nấm mốc A. niger bắt đầu với sự hình thành chấm màu kem trên bề mặt mơi trường từ ngày thứ hai sau khi ủ trên môi trường PDA ở 300C, sau đó tăng trưởng theo dạng xoắn ốc trịn trên bề mặt một cách nhanh chóng trong vịng 6 giờ. Khi kích thước khuẩn lạc khoảng 2,5 ÷ 3 cm, có sự hình thành một đốm giống như bột đen trên bề mặt môi trường và chuyển sang màu đen hoàn toàn sau 72 giờ ni cấy.