2.2.1.2 Quy trình thu nhận và xử lý vi nấm
Mô tả cách thu nhận mẫu:
Quả cà phê mốc: dùng kẹp vô trùng gắp vài quả cà phê mốc cho vào túi PE có van 1 chiều và khóa kín miệng túi. Tiếp tục lấy mẫu ở 2 vị trí khác trong cùng 1 vườn trồng cà phê. Thời gian thu nhận mẫu vào lúc 10 giờ sáng.
Hình 2.6: Ngun liệu kích thước 1 - 2 mm Hình 2.5: Ngun liệu kích thước 0,5 - 1 mm Hình 2.3: Ngun liệu kích thước < 0,25 mm Hình 2.4: Nguyên liệu kích thước 0,25 - 0,5 mm Xác định độ ẩm Sấy đến độ ẩm 5÷8%
Xay, nghiền nhỏ Rây, sàng
Nguyên liệu cho thí nghiệm Quả cà phê
Rửa sạch Phân loại Tách vỏ
36
Đất trồng cà phê: dùng muỗng lấy mẫu đất ở độ sâu 3-5 cm cho vào túi PE có van 1 chiều và khóa kín miệng túi. Tiếp tục lấy mẫu ở 2 vị trí khác trong cùng 1 vườn trồng cà phê. Thời gian thu nhận mẫu vào lúc 10 giờ sáng.
Cành, lá cây cà phê: dùng kẹp vô trùng gắp cành, lá cà phê cho vào túi PE có van 1 chiều và khóa kín miệng. Tiếp tục lấy mẫu ở 2 vị trí khác trong cùng 1 vườn trồng cà phê. Thời gian thu nhận mẫu vào lúc 10 giờ sáng.
Xử lý mẫu có chứa VSV:
Tất cả các mẫu VSV thu thập được vận chuyển về PTN trong thời gian không quá 24 giờ. Các mẫu chứa VSV đều được bao kín cách ly với mơi trường bên ngồi. Tất cả các thao tác xử lý mẫu đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Cho mẫu chứa VSV vào ống nghiệm có nắp đậy (ống nghiệm đã tiệt trùng) sau đó cho thêm nước muối sinh lý cho ngập mẫu, rồi dùng máy vortex trộn đều mẫu trong 20 phút. Mẫu sau khi được trộn đều sẽ được cấy sang mơi trường thích hợp để ni cấy và phân lập.
2.2.2 Các phương pháp phân tích và đo đạc 2.2.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc 2.2.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc
Cân 10g mẫu nguyên liệu có chứa nấm mốc cho vào erlen 250 mL, thêm vào đó 90 mL nước muối sinh lý, lắc trên máy vortex trong 30 phút. Sau đó pha loãng dung dịch bằng cách lấy 1 mL dung dịch cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cất vô trùng, đồng nhất mẫu bằng cách lắc ống nghiệm nhiều lần. Tiếp tục pha loãng thành các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Dùng micropipet hút 0,1 mL dung dịch ở các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 cho dàn đều vào đĩa petri chứa môi trường PDA, nuôi cấy ở nhiệt độ 30 ± 2°C trong thời gian 72 giờ (Watts et al., 1988). Quan sát trên đĩa petri nếu thấy xuất hiện các khuẩn lạc màu đen, nâu thẫm hoặc xanh nhạt đến xanh lá thì tiến hành cấy truyền vào các đĩa petri khác để tạo độ thuần chủng. Mỗi khuẩn lạc trong đĩa petri được xem là một dòng vi nấm và ghi ký hiệu để lưu trữ và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2.2 Phương pháp định loại dòng nấm mốc
Dựa vào khóa phân loại Trichoderma của Gary J. Samuels (Samuels et al., 2004) và khóa phân loại Asperllius của Klich (2002). Thông qua hai bước cơ bản là định loại hình thái dựa trên đặc điểm khuẩn lạc theo phương thức cấy 3 điểm và định loại vi thể theo đặc điểm bào tử đính.
Định loại hình thái: Cấy truyền các dịng nấm đã phân lập sang đĩa petri chứa môi trường CZ. Cấy ba điểm trên mặt mơi trường. Mỗi dịng nấm được cấy sang 3 đĩa petri, ủ ở nhiệt độ 30°C. Quan sát và ghi nhận tất cả 3 đĩa petri của một dòng nấm và xác định các đặc điểm sau ở khuẩn lạc sau thời gian ni cấy 7 ngày bao gồm: Đường kính trung bình của khuẩn lạc; dạng mặt của khuẩn lạc; màu sắc của mặt trên và mặt dưới khuẩn lạc
37
Định loại vi thể theo đặc điểm bào tử đính: Quan sát sợi nấm: có hay khơng vách ngăn, màu sắc, nhẵn hoặc có gai. Bộ máy mang bào tử trần: hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt có gai hay nhẵn của tế bào gốc, giá bào tử đính, túi, cuống thể bình, thể bình. Bào tử đính: hình dạng, kích thước, màu sắc, mặt nhẵn hay có gai, kiểu phát sinh bào tử, dạng tập hợp của bào tử trần (chuỗi song song, chuỗi phân ly, khối cầu, tia tỏa tròn,…)
2.2.2.3 Phương pháp định danh nấm mốc
Các dòng nấm mốc đã phân lập được gửi mẫu định danh tại công ty Nam Khoa. Phương pháp định danh đã dùng: Định danh bằng phương pháp giải trình tự vùng gen ITS (18s). Cặp mồi được sử dụng là ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) và tỷ lệ tương đồng đạt > 99%.
2.2.2.4 Phương pháp định tính khả năng sinh cellulase
Hoạt tính cellulase được xác định tương đối theo phương pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa cơ chất CMC 0,5% (w/v) trong đệm acetate 100 mM pH 5, dày khoảng 0,5 cm được đục lỗ với đường kính 0,5 cm. 50 μl dịch enzyme được bổ sung vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 40C cho enzyme khuếch tán đều xung quanh. Sau khi ủ tiếp 12, 24 và 48 giờ ở 370C, mẫu được nhuộm bằng dung dịch lugol 1% (w/v) và đo đường kính vịng phân giải cơ chất. Hoạt tính tương đối của enzyme tỷ lệ thuận với đường kính vòng phân giải cơ chất (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1976).
Hoạt tính = D - d (với D là đường kính vịng ngồi và d là đường kính lỗ)
2.2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính FPase (FPU)
Dựa trên sự thủy phân giấy lọc bằng dịch cellulase sau đó bất hoạt enzyme và tạo phản ứng màu bằng DNS. Lượng glucose tạo ra được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm (Ghose, 1987).
Ống thử: Cho vào 1 ống nghiệm (25 mL) thủy tinh gồm các chất sau: Giấy lọc Whatman đã cắt nhỏ (khoảng 50 mg), thêm vào đó 1 mL đệm Na-citrate 0,05M, pH 4,8. Sau đó hút 0,5 mL dịch enzyme cần xác định cho vào ống nghiệm rồi nâng nhiệt ống nghiệm lên 500C trong thời gian 60 phút. Tiếp theo cho thêm vào ống nghiệm 3 mL dung dịch DNS, lắc đều rồi tiến hành đun sơi ống nghiệm trong bể cách thủy chính xác trong 5 phút. Làm lạnh ống nghiệm bằng nước đá. Cuối cùng thêm 20 mL nước cất và tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.
Ống blank: Làm tương tự như ống thử nhưng thay vào đó là cho enzyme đã bị bất hoạt trước đó.
Như vậy độ hấp thụ A của mẫu thử = độ hấp thụ của ống thử - độ hấp thụ ống blank
38
Pha dung dịch glucose gốc thành dung dịch có nồng độ: 10 mg/mL (gọi là dung dịch glucose gốc)
Tiếp tục pha loãng thành các nồng độ như sau:
Hút 1 mL glucose gốc + 0,5 mL đệm = 1:1,5 = 6,7 mg/mL (3,33 mg/0,5 mL) Hút 1 mL glucose gốc + 1 mL đệm = 1:2 = 5 mg/mL (2,5 mg/0,5 mL)
Hút 1 mL glucose gốc + 2 mL đệm = 1:3 = 3,3 mg/mL (1,67 mg/0,5 mL) Hút 1 mL glucose gốc + 4 mL đệm = 1:5 = 2 mg/mL (1 mg/0,5 mL) Đường chuẩn glucose được lập như sau:
Ống Zero 1 2 3 4
Glucose đã pha loãng (mL) 0 0,5 0,5 0,5 0,5
Đệm (mL) 1,5 1 1 1 1 500C trong 60 phút DNS (mL) 3 3 3 3 3 Đun sôi 5 phút, làm lạnh Nước cất 20 20 20 20 20 Nồng độ glucose trong ống (mg) 0 3,33 2,5 1,67 1 Cơng thức tính: FPU = 0,37
Nồng độ enzyme pha loãng tương tứng với thủy phân tạo ra được 2 mg glucose (U/mL)
2.2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính CMCase
Dựa trên sự thủy phân CMC bằng dịch cellulase sau đó bất hoạt enzyme và tạo phản ứng màu bằng DNS. Lượng glucose tạo ra được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm (Ghose, 1987).
Cho vào 1 ống nghiệm (25 mL) gồm các chất sau: 0,5 mL dung dịch CMC 2% (pha trong đệm Na-citrate 0,05M, pH 4,8). Sau đó hút 0,5 mL dịch enzyme cần xác định cho vào ống nghiệm rồi nâng nhiệt ống nghiệm lên 500C trong thời gian 30 phút. Tiếp theo cho thêm vào ống nghiệm 3 mL dung dịch DNS, lắc đều rồi tiến hành đun sôi ống nghiệm trong bể cách thủy chính xác trong 5 phút. Làm lạnh ống nghiệm bằng nước đá. Cuối cùng thêm 20 mL nước cất và tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.
Ống blank: Làm tương tự như ống thử nhưng thay vào đó là cho enzyme đã bị bất hoạt trước đó.
Như vậy độ hấp thụ A của mẫu thử = độ hấp thụ của ống thử - độ hấp thụ ống blank
39
Pha dung dịch glucose gốc thành dung dịch có nồng độ: 2 mg/mL (gọi là dung dịch glucose gốc)
Tiếp tục pha loãng thành các nồng độ như sau:
Hút 1 mL glucose gốc + 0 mL đệm = 2 mg/mL (1 mg/0,5 mL)
Hút 1 mL glucose gốc + 0,5 mL đệm = 1:1,5 = 1,33 mg/mL (0,67 mg/0,5 mL) Hút 1 mL glucose gốc + 1 mL đệm = 1:2 = 1 mg/mL (0,5 mg/0,5 mL)
Hút 1 mL glucose gốc + 3 mL đệm = 1:4 = 0,5 mg/mL (0,25 mg/0,5 mL) Đường chuẩn glucose được lập như sau:
Ống Zero 1 2 3 4
Glucose đã pha loãng (mL) 0 0,5 0,5 0,5 0,5
Đệm (mL) 0,5 0 0 0 0 500C trong 30 phút DNS (mL) 3 3 3 3 3 Đun sôi 5 phút, làm lạnh Nước cất 20 20 20 20 20 Nồng độ glucose trong ống (mg) 0 1 0,67 0,5 0,25 Cơng thức tính: CMC = 0,185
Nồng độ enzyme pha loãng tương tứng với thủy phân tạo ra được 0,5 mg glucose (U/mL)
2.2.2.7 Phương pháp tách chiết celulase
Tách chiết celulase trong môi trường rắn
Nấm mốc sau khi nuôi trên môi trường lên men bề mặt được bổ sung 75 ml Natriacetate 0,1 M, pH 5,0 vào bình ni cấy. Lắc 200 vòng/phút/300C/1giờ, lấy 3 ml dịch chiết cho vào 2 ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/phút /10 phút, thu lấy 1,5 ml enzyme thô bảo quản trong tủ đá, và tiến hành phân tích hoạt lực celulase theo phương pháp Somogyi - Nelson.
Tách chiết celulase trong môi trường lỏng
Lấy 2 ml dịch nuôi cấy 18 ml dung dịch đệm lắc 200 vòng/phút/300C/1giờ, hút 3 ml dịch chiết cho vào 2 ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/phút/10 phút. Sau đó thu lấy 1,5 ml enzyme thơ bảo quản trong tủ đá, và tiến hành phân tích hoạt lực celulase theo phương pháp Somogyi - Nelson.
40
Kết tủa bằng muối trung tính: Dịch enzyme (15 ml) sau khi ly tâm ở 10000 rpm trong 10 phút được tủa với 90% (6,675 g) ammonium sulfate bão hòa và để ở 40C qua đêm. Sau khi ly tâm 12500 rpm, ở 40C. Tủa được hòa với đệm acetate 100 mM pH 4,8 và thẩm tích loại muối. Dịch tủa sau khi loại muối (8 ml) được đưa qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G75 (2,6 x 60 cm) đã được cân bằng với đệm acetate 50 mM, pH 4,8. Tốc độ chảy là 25 ml/giờ. Thể tích mỗi phân đoạn là 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn, sau đó điện di trên gel 12,5% polyacrylamide để kiểm tra độ tinh sạch.
Kết tủa bằng dung môi hữu cơ: Cho từ từ ethanol lạnh vào dịch enzym thô đã ở - 200C, khuấy đều đến khi đạt được nồng độ cuối thích hợp. Sau khi cho hết ethanol, khuấy tiếp 20 phút để kết tủa hoàn toàn enzym. Để dịch enzym đã kết tủa ở 40C sau 30 phút (đối với kết tủa cồn). Lọc hút chân không thu kết tủa, bổ sung các chất ổn định, sấy đông khô ở nhiệt độ -700C ÷ -800C, áp suất chân khơng 550 – 450 mmHg hoặc chân khơng ở nhiệt độ 40 ÷ 450C. Đánh giá hiệu quả thu hồi enzym. Thu chế phẩm, bảo quản ở 40C và -200C, định kì thời gian mẫu được lấy đi xác định hoạt độ.
2.2.2.9 Cơng thức tính tốn, đánh giá hiệu quả tinh sạch enzyme
Hiệu suất thu hồi CMCase, Y(%) = 𝐴1.𝑉1
𝐴0.𝑉0 x 100 (Ngo et al., 2008)
A0, A1: hoạt tính CMCase có trong mẫu thơ và mẫu sau tinh sạch (U/mL) V0, V1: thể tích enzyme có trong mẫu thơ và mẫu sau tinh sạch (mL) Hoạt tính riêng S (U/mg protein) = 𝐴
𝐶𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 (Ngo et al., 2008) A: hoạt tính CMCase có trong mẫu tương ứng (U/mL); Cprotein: nồng độ protein trong mẫu tương ứng (mg/mL) Độ tinh sạch P (lần) = 𝑆1
𝑆0 (Ngo et al., 2008)
S1 và S0: hoạt tính riêng của CMCase sau tinh sạch và trong mẫu thô (U/mg)
2.2.2.10 Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradford
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford (Bradford, 1976). Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò.
2.2.2.11 Xác định hàm lượng đường tổng bằng phương pháp PSA (DuBois et
al., 1956; Krishnaveni et al., 1984)
❖ Hóa chất
- Phenol 5%
41
- Acid hydrochloride (HCl) 2,5N
- Sodium carbonate anhydrous (Na2CO3)
- Dung dịch glucose chuẩn 1000ppm: Hòa tan 0,1 g glucose trong 100 mL nước cất.
- Dung dịch glucose mẫu 100ppm: hút 10 mL dung dịch glucose chuẩn 1000ppm, thêm nước cất định mức thành 100 mL
❖ Cách tiến hành
Cân 100 mg mẫu vào ống nghiệm. Tiến hành đun cách thủy với 5 mL dung dịch HCl 2,5N trong vòng 3 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phịng.
Trung hịa nó với Na2CO3 cho đến khi hết sủi bọt khí. Định mức thành 100 mL. Lập đường chuẩn với các dung dịch glucoza chuẩn 100ppm và tiến hành tạo phức màu theo mẫu trong bảng:
Đường chuẩn xác định đường tổng được xây dựng như sau:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 M Chuẩn glucoza 100ppm 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dịch xác định (mL) 0,2 Nước cất (mL) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,8 Phenol (mL) 1 1 1 1 1 1 1 H2SO4 đậm đặc (mL) 5 5 5 5 5 5 5
Hàm lượng glucose chuẩn (mg) 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
Lắc đều trong 10 phút, sau đó ngâm trong nước khoảng 25-30oC trong 20 phút rồi đo quang ở bước sóng 490 nm
Xây dựng đồ thị đường chuẩn trong đó, trục hồnh là nồng độ chất chuẩn, trục tung là độ hấp thu. Lập phương trình đường chuẩn y=ax.
❖ Tính kết quả
Hàm lượng đường tổng (%) = C x 𝑉đ𝑚
𝑉𝑥đ x 100
𝐺 x K Trong đó:
K: Hệ số pha lỗng mẫu
100: Hệ số chuyển đổi sang đơn vị phần trăm
C: lượng glucose được suy ra từ đồ thị đường chuẩn (mg) Vđm: thể tích định mức dịch mẫu (mL)
Vxđ: thể tích dịch mẫu hút đem đi phản ứng với thuốc thử (mL) G = (100−𝑊) x 𝑚
100 : trọng lượng theo chất khô của mẫu đem đi phân tích (mg) m: khối lượng mẫu đem đi phân tích (mg)
42
2.2.2.12 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS (Miller,
1972)
❖ Hóa chất
- DNS:1g, 0,2 g phenol, 0,05 g Na2SO3 pha trong 100 mL NaOH 1%, ở 4oC - Phenol: 0,2 g
- Sodium sulfite anhydrous (Na2SO3): 0,05 g - Sodium hydroxide (NaOH) 1%
- Dung dịch glucose
- Potassium sodium tartrate (C4H4O6KNa) 40% - Ethanol 80o
- Dung dịch glucose chuẩn 1000ppm: Hòa tan 0,1 g glucose trong 100 mL nước cất.
❖ Cách tiến hành
Cân 0,1 g mẫu, trích ly đường bằng ethanol 80o nóng 2 lần (mỗi lần 5 mL). Đem đun cách thủy ở 80oC. Thêm 10 mL nước để hòa tan đường.
Lập đường chuẩn với các dung dịch glucose chuẩn 300ppm và tiến hành tạo phức màu theo mẫu trong bảng:
Đường chuẩn xác định đường khử được xây dựng như sau:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 M
Chuẩn glucose 300ppm 0 0,2 0,4 0,6 0,8
Dịch xác định (mL) 1
Nước cất (mL) 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2
DD DNS (mL) 3 3 3 3 3 3
Đun sơi trong 5 phút, sau đó làm lạnh
Potassium sodium tartrate 1 1 1 1 1 1
Hàm lượng glucose chuẩn (mg) 0 0,2 0,4 0,6 0,8
Xây dựng đồ thị đường chuẩn trong đó, trục hồnh là nồng độ chất chuẩn, trục tung là độ hấp thu. Lập phương trình đường chuẩn y=ax.
❖ Tính kết quả
Hàm lượng đường khử (%) = C x 𝑉đ𝑚
𝑉𝑥đ x 100
𝐺 x K Trong đó:
K: Hệ số pha lỗng mẫu
100: Hệ số chuyển đổi sang đơn vị phần trăm
C: lượng glucose được suy ra từ đồ thị đường chuẩn (mg) Vđm: thể tích định mức dịch mẫu (mL)
Vxđ: thể tích dịch mẫu hút đem đi phản ứng với thuốc thử (mL) G = (100−𝑊) x 𝑚
100 : trọng lượng theo chất khơ của mẫu đem đi phân tích (mg) m: khối lượng mẫu đem đi phân tích (mg)
43
2.2.2.13 Xác định hàm lượng đường glucose
Đường glucose được xác định bằng thiết bị đo đường huyết Clever Check (model