TỔNG QUAN
Tổng quát chung về thủy ngân, nguồn gốc và dạng tồn tại của thủy ngân trong tự nhiên
Thủy ngân trong tự nhiên được sinh ra từ các quá trình tự nhiên như phong hóa vỏ trái đất, hoạt động núi lửa và các chuyển động của tầng địa chất Nghiên cứu gần đây cho thấy, các nguồn tự nhiên thải ra từ 2,700 đến 6,000 tấn thủy ngân vào môi trường mỗi năm.
Sự ô nhiễm thủy ngân chủ yếu phát sinh từ các hoạt động sản xuất công nghiệp của con người, như sản xuất acetaldehyd, và các hoạt động phát thải gián tiếp như khai thác và đốt nhiên liệu hóa thạch, đặc biệt là than đá Mặc dù thủy ngân chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ trong các loại nhiên liệu này, nhưng việc tiêu thụ một lượng lớn than đã thải ra một lượng đáng kể thủy ngân vào môi trường Theo ước tính, lượng thủy ngân do con người tạo ra khoảng 2,000-3,000 tấn mỗi năm và đang có xu hướng gia tăng Tuy nhiên, việc xác định chính xác các dạng tồn tại của thủy ngân trong tự nhiên là khó khăn, do chúng có hàm lượng và phân bố không đồng đều theo vùng và loài.
Nguồn gốc phát thải thủy ngân từ các ngành công nghiệp:
- Việc sử dụng than làm nhiên liệu thải ra lượng thủy ngân lớn nhất;
- Công nghệ sản xuất clo, thép, phốt phát và vàng;
- Công nghệ sản xuất, sửa chữa thiết bị điện tử;
Ứng dụng y tế, đặc biệt trong sản xuất và bảo quản vắc-xin, đang đối mặt với nguy cơ ô nhiễm thủy ngân tại Việt Nam Nghiên cứu về ô nhiễm này từ các ngành công nghiệp vẫn chưa được chú trọng đúng mức Hiện trạng khai thác vàng tràn lan và thiếu quy hoạch đồng bộ làm gia tăng nguy cơ ô nhiễm thủy ngân trong môi trường và thực phẩm Hơn nữa, việc sử dụng than làm nhiên liệu chủ yếu trong các nhà máy sản xuất xi măng, nhiệt điện, sắt thép và phân bón cũng góp phần không nhỏ vào phát thải thủy ngân từ tiêu thụ nhiên liệu hóa thạch.
Thủy ngân hiện diện trong môi trường dưới nhiều dạng khác nhau và trải qua quá trình chuyển hóa sinh hóa tự nhiên, chủ yếu tích lũy trong thủy hải sản, nguồn thức ăn chính của con người Quá trình chuyển hóa này được minh họa trong hình 1.1.
Hình 1 1: Quá trình chuyển hóa của Thủy ngân trong tự nhiên
Hơi thủy ngân được sinh ra từ mẫu khoáng vật, đất, nước mặt hoặc khì thải núi lửa, cùng các hoạt động của con người
Thủy ngân khi được giải phóng vào khí quyển thường tồn tại ở dạng hơi trong thời gian dài, có thể lên tới một năm Điều này giúp nó có khả năng khuếch tán rộng rãi thông qua các hoạt động của khí quyển như gió và hiện tượng đối lưu.
Hơi thủy ngân trong khí quyển trải qua quá trình oxy hóa và quang hóa, dẫn đến sự hình thành thủy ngân vô cơ Thủy ngân này sau đó kết hợp với hơi nước và trở lại mặt đất thông qua mưa, gây lắng đọng thủy ngân xuống đất và nước mặt.
- Trong nước Hg 2+ chuyển hóa thành sunfua thủy ngân không hòa tan
Biến đổi hóa học và sinh học của thủy ngân diễn ra qua các quá trình trao đổi chất chính, bao gồm methyl hóa, demethyl hóa và khử, dẫn đến hình thành các dạng dễ bay hơi và hòa tan Những quá trình này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tính chất và hành vi của thủy ngân trong môi trường.
Hg 2+ thành Hg đơn nguyên tử và oxy hóa ngược, tác dụng của vi sinh vật đối với việc chuyển Hg 2+ thành các hợp chất hữu cơ khác nhau
- Thủy ngân phát tán trở lại bầu khì quyển hoặc tìch lũy sinh học trong chuỗi thức ăn
Tại Việt Nam, hơi thủy ngân chủ yếu được phát thải vào môi trường qua quá trình đốt cháy nhiên liệu, đặc biệt là than, với hàm lượng thủy ngân khoảng 0,1-0,2 mg/kg tùy loại Khi than được tiêu thụ, thủy ngân sẽ được phát tán vào khí quyển dưới dạng methyl thủy ngân và một phần sẽ tồn tại trong tro bay, xỉ Hơn nữa, methyl thủy ngân cũng được hình thành bởi các vi sinh vật trong môi trường, dẫn đến sự tích lũy sinh học qua chuỗi thức ăn.
Methyl thủy ngân và ethyl thủy ngân
*Nguồn gốc và chuyển hóa của các dạng thủy ngân hữu cơ
Thủy ngân hữu cơ trong tự nhiên tồn tại dưới hai dạng chính là methyl thủy ngân và ethyl thủy ngân, trong đó mỗi dạng bao gồm một hoặc nhiều nhóm methyl (CH3) kết hợp với một nguyên tử thủy ngân Công thức hóa học của thủy ngân hữu cơ là (CH3)nHg+, với ion tích điện dương, cho phép nó tương tác với các anion như Cl-, OH- và NO3-.
Hình 1 2: Cấu tạo phân tử của methyl thủy ngân và ethyl thủy ngân
Thủy ngân có khả năng liên kết mạnh mẽ với các anion chứa lưu huỳnh, đặc biệt là nhóm -SH có trong các axit amin như cysteine và methionine Do đó, các protein chứa cysteine sẽ hình thành liên kết cộng hóa trị bền vững với methyl thủy ngân.
Quá trình chuyển hóa từ thủy ngân vô cơ thành thủy ngân hữu cơ bao gồm ít nhất hai bước: đầu tiên, oxy hóa thủy ngân (Hg) thành ion thủy ngân (Hg 2+), sau đó, methyl hóa ion Hg 2+ để tạo ra methyl thủy ngân.
Hình 1 3: Quá trình hình thành thủy ngân hữu cơ
Methyl thủy ngân là dạng độc hại nhất đối với con người do có độc tính cao và dễ dàng tiếp cận các mô sinh học Nó được hình thành từ thủy ngân vô cơ thông qua hoạt động của vi sinh vật kỵ khí trong môi trường nước như sông, hồ, đầm lầy, trầm tích, đất và đại dương Trong các điều kiện thích hợp, methyl thủy ngân trở thành dạng tồn tại ổn định nhất của thủy ngân, trong khi quá trình demethyl hóa diễn ra rất ít hoặc không xảy ra.
Quá trình demethyl hóa được phát hiện bởi các nhà nghiên cứu trong trầm tích, cho thấy methyl thủy ngân có xu hướng hấp phụ mạnh vào các thành phần trầm tích và bị phân hủy nhanh hơn so với thủy ngân vô cơ Sự giải hấp của methyl thủy ngân từ các mẫu trầm tích cao hơn từ 10 đến 1,000 lần so với thủy ngân vô cơ Quá trình này xảy ra dưới tác động của một số vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn khử sulfat, dẫn đến sự hình thành ramethyl thủy ngân, được sinh vật hấp thụ và tích lũy trong cơ thể thông qua chuỗi thức ăn.
*Tính chất hóa học, sinh học và vật lý của các dạng thủy ngân hữu cơ
Hợp chất thủy ngân chủ yếu bao gồm nguyên tố thủy ngân với trọng lượng nguyên tử 200,59, tạo liên kết cộng hóa trị với ít nhất một nguyên tử carbon Ở nhiệt độ thường, thủy ngân hữu cơ tồn tại dưới dạng tinh thể rắn và có khả năng hòa tan trong các dung môi hữu cơ.
Methyl thủy ngân clorua (MeHg-Cl) có độ hòa tan thấp trong nước, chỉ đạt 0,100g/L ở 21°C Dimethyl thủy ngân, một sản phẩm phụ độc hại từ quá trình tổng hợp methyl thủy ngân, cũng có độ hòa tan tương đối thấp, khoảng 1,20g/L ở 21°C Độ hòa tan trong nước của các hợp chất thủy ngân giảm dần theo thứ tự: Hg2Cl, Hg, CH3Hg-Cl và HgCl2.
Methyl thủy ngân, như CH3Hg-Cl, có nhiệt độ sôi và nóng chảy khác nhau, đồng thời có áp suất hơi tương đối cao ở nhiệt độ phòng Cụ thể, áp suất hơi của CH3Hg-Cl là 1,23 Pa (0,0085 mmHg), cao hơn nhiều so với dimethyl thủy ngân.
* Sự tích lũy methyl thủy ngântrong chuỗi thức ăn
Methyl thủy ngân là một dạng hữu cơ tự nhiên, tích lũy từ các sinh vật đầu tiên và tiếp tục lan truyền qua chuỗi thức ăn, từ động vật ăn cỏ đến động vật ăn thịt và cuối cùng là con người Khi chất độc xâm nhập vào cơ thể động vật và thực vật, một phần sẽ được bài tiết, trong khi phần còn lại được lưu trữ Qua chuỗi thức ăn và quy tắc bắt mồi, độc tố có thể chuyển từ sinh vật này sang sinh vật khác, dẫn đến sự tích lũy với nồng độ độc tố cao hơn ở những cấp độ dinh dưỡng và thời gian sống khác nhau Quá trình này được gọi là tích lũy sinh học, gây khuếch đại chất độc trong quần thể sinh vật.
Các dạng thủy ngân như ethyl thủy ngân có khả năng xâm nhập và tích lũy trong chuỗi thức ăn, nhưng methyl thủy ngân được xem là dạng hấp thụ nhanh nhất và có khả năng khuếch đại sinh học lớn nhất Nó có tốc độ bài tiết rất chậm khỏi cơ thể Khi thủy ngân xâm nhập vào cá, nó tạo liên kết cộng hóa trị với nhóm -SH, dẫn đến việc methyl thủy ngân được "làm giàu" và tích lũy từ cá thể này sang cá thể khác trong chuỗi thức ăn.
Sự dịch chuyển của thủy ngân hữu cơ thông chuỗi thức ăn có thể được tóm tắt như sau:
- Thủy ngân hữu cơ trong trầm tìch và sinh vật phù du
- Cá nhỏ ăn số lượng lớn sinh vật phù du theo thời gian
Cá lớn tiêu thụ cá nhỏ, dẫn đến việc tích lũy thủy ngân trong tế bào và mô của chúng Người tiêu dùng cá và động vật sẽ hấp thụ methyl thủy ngân cùng với ethyl thủy ngân, làm tăng dần lượng thủy ngân trong cơ thể Do đó, những cá thể lớn hơn thường có mức thủy ngân cao hơn.
Thủy ngân hữu cơ nhanh chóng được tích lũy bởi hầu hết các sinh vật dưới nước, đặc biệt là trong mô của cá, với con người là cá thể cuối cùng trong chuỗi thức ăn thủy sản Mức độ tích lũy này chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như loài, tuổi thọ, hoạt động vi sinh vật, và các điều kiện tự nhiên như lũ lụt và dòng chảy theo mùa Do đó, sự tích lũy sinh học của methyl thủy ngân là khó đoán và có thể thay đổi tùy thuộc vào môi trường.
*Độc tính của methyl thủy ngân đối với con người
Methyl thủy ngân là một chất độc đặc biệt nguy hiểm đối với phụ nữ mang thai và trẻ nhỏ do khả năng thẩm thấu dễ dàng qua màng sinh học Chất này xâm nhập vào các tế bào thần kinh, ức chế sự phát triển não bộ của thai nhi, dẫn đến thay đổi hành vi, giảm khả năng nhận thức và có thể gây ra mù, điếc Methyl thủy ngân tấn công tế bào phân chia và tổng hợp protein, gây thiếu năng lượng và rối loạn truyền phản xạ thần kinh Hệ quả là trẻ sinh ra từ bà mẹ nhiễm methyl thủy ngân có nguy cơ bị tổn thương không thể phục hồi hệ thần kinh trung ương, dẫn đến các vấn đề như tâm thần phân liệt, chậm phát triển trí tuệ và co giật Ngoài ra, tiếp xúc với methyl thủy ngân cũng có thể gây tác dụng phụ đối với hệ tim mạch ở trẻ em, biểu hiện qua huyết áp không ổn định, bệnh tim mạch và chậm phát triển.
Ngộ độc methyl thủy ngân gây ra sự phân lập và phá vỡ nhiễm sắc thể, ngăn chặn sự phân chia tế bào, và có thể dẫn đến ung thư Tác động của methyl thủy ngân tăng lên khi nồng độ trong máu vượt quá 0,5 µg/mL, dễ dàng hấp thụ qua đường tiêu hóa và tạo liên kết bền với cysteine, protein và peptide Phức hợp methyl thủy ngân-cysteine được vận chuyển tự do đến não và qua nhau thai, ảnh hưởng đến sự phát triển của thai nhi Thời gian đào thải của methyl thủy ngân trong máu khoảng 50 ngày, và tiếp xúc với liều lượng cao có thể dẫn đến mất phối hợp cơ bắp, tê liệt, suy giảm giác quan, và thậm chí tử vong Các nghiên cứu ở Minamata và Iraq cho thấy các triệu chứng nghiêm trọng do ngộ độc methyl thủy ngân, bao gồm dị ứng, khó giao tiếp, và mù WHO khuyến cáo rằng nồng độ methyl thủy ngân an toàn cho người trưởng thành khoảng 0,48 µg/kg trọng lượng cơ thể, nhưng nồng độ cao hơn có thể gây ra triệu chứng thần kinh Nghiên cứu ở Phần Lan cũng chỉ ra mối liên hệ giữa tiêu thụ cá nhiễm methyl thủy ngân và nguy cơ nhồi máu cơ tim.
1833 cư dân là 2mg/kg và họ ăn trung bính 30g cá mỗi ngày lạilàm tăng nguy cơ đau tim, nhồi máu cơ tim lên 2 hoặc 3 lần[34]
Các dạng thủy ngân có liên quan đến tổn thương thận, với nghiên cứu cho thấy methyl thủy ngân gây ra những tác động tiêu cực lên chức năng thận và dẫn đến thoái hóa ống thận Trong thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu đã điều tra ảnh hưởng của methyl thủy ngân đến chức năng miễn dịch và huyết áp, đặc biệt là trên chuột Một nghiên cứu của Sorosen và cộng sự vào năm 1999 đã phát hiện mối liên hệ giữa methyl thủy ngân và tăng huyết áp ở chuột mới sinh, tương ứng với sự gia tăng nồng độ thủy ngân trong máu.
Các phương pháp xác định thủy ngân hữu cơ
Các phương pháp thường được sử dụng để xác định thủy ngân hữu cơ bao gồm sắc ký và quang phổ kế
Sắc ký khí là phương pháp phân tích dựa trên sự tương tác giữa hai pha: pha tĩnh và pha động Có hai loại sắc ký khí chính là khí-lỏng và khí-rắn Quá trình này diễn ra khi mẫu được bơm vào buồng mẫu với nhiệt độ đủ cao để bay hơi mà không bị phân hủy Khí mang chất phân tích sẽ đưa vào cột tách, nơi mà ái lực tương tác khác nhau giữa các chất và pha tĩnh dẫn đến thời gian lưu khác nhau Kết quả là các chất phân tích sẽ được rửa giải ra khỏi cột và được detector ghi nhận tại các thời điểm khác nhau, hiển thị tín hiệu khi có sự hiện diện của các chất hoặc nhóm chức Phương pháp sắc ký khí (GC) đã được áp dụng để xác định methyl thủy ngân và các loại thủy ngân khác trong mẫu sinh học, sử dụng các detector GC thông thường như detector bắt điện tử (ECD), phương pháp phát hiện chọn lọc nguyên tố dựa trên hấp thụ nguyên tử, và quang phổ huỳnh quang nguyên tử (AFS).
*Sắc ký khí - Detector bắt điện tử (GC-ECD)
Detector bắt điện tử ECD hoạt động dựa trên khả năng liên kết các electron tự do trong pha khí, tùy thuộc vào đặc tính của từng chất phân tích Khả năng này phụ thuộc vào cấu trúc của các hợp chất, với mức độ liên kết thấp đối với hydrocarbon bão hòa Ngược lại, các hợp chất chứa halogen, nitơ hoặc các nhóm đa liên kết có khả năng bắt electron cao hơn Do đó, độ nhạy của detector ECD rất đặc trưng cho từng nhóm chất và có phạm vi tuyến tính rộng.
Petr Maršálek và cộng sự đã phát triển một phương pháp mới để xác định nhanh methyl thủy ngân trong cá bằng kỹ thuật GC-ECD Phương pháp này sử dụng môi trường axit hydrochloric và quá trình chiết bằng toluene, cho phép xác định methyl thủy ngân hiệu quả thông qua cột mao quản đặc hiệu DB.
608 Phương phỏp cú giới hạn phỏt hiện (MDL) 13 àg/kg, giới hạn định lượng(MQL)
Nghiên cứu cho thấy nồng độ 22 àg/kg và tuyến tính trong khoảng 0,2 ~ 200 ng/g, với độ tái lập đạt 9,4% và độ thu hồi khoảng 90% Phương pháp này được phát triển và kiểm tra trên mẫu CRM 464, so sánh giữa các phòng thí nghiệm IMEP, cho kết quả tương đồng trên 20 mẫu cá ngừ do Trung tâm Nghiên cứu - Viện Nghiên cứu và Tổ chức Đo lường Bỉ cung cấp.
Nhóm nghiên cứu của Salvatore Chiavarini đã phát triển một quy trình phân tích để xác định methyl thủy ngân trên tóc người bằng phương pháp sắc ký khí mao quản với detector ECD (GC-ECD) Mẫu tóc được thủy phân trong môi trường kiềm/toluene tại 50°C và sau đó xử lý bằng axit chlohydric cùng dung dịch đồng sunfat bão hòa Methyl thủy ngân được chiết xuất trong toluene với sự hỗ trợ của CuSO4 và KBr, sau đó được phân tích bằng GC-ECD với cột mao quản DB17 Phương pháp này có giới hạn phát hiện là 50 ng/g với 100 mg mẫu tóc, và hiệu suất thu hồi cùng độ lặp lại đã được khảo sát Kết quả từ 13 mẫu tóc cho thấy sự tích lũy thủy ngân, đồng thời phương pháp đã được tối ưu hóa để nâng cao độ tin cậy và độ chính xác trong định lượng methyl thủy ngân.
A.M Caricchia và cộng sự đã công bố nghiên cứu xác định methyl thủy ngântrong trầm tìch bằng sắc ký khì với detector ECD Sử dụng cột mao quản SPB-608 với đường kính 0,53 mm Methyl thủy ngân từ trầm tìch được chiết dựa trên quá trính thủy phân môi trường kiềm (KOH/CH3OH) trong bể siêu âm, sau đó được làm sạch nhược điểm lớn, phổ biến đối với các phương pháp sắc ký để xác định methyl thủy ngân là không có chất nội chuẩn để kiểm soát Tuy nhiên,Độ chình xác của phương pháp đã được chứng minh bằng các hoạt động đánh giá liên phòng và mẫu chuẩn chứng nhận methyl thủy ngân trong trầm tìch được trợ bởi tổ chức bởi hiệp hội Tiêu chuẩn, Đo lường và Chương trính thử nghiệm của Liên minh châu Âu và cơ quan năng lượng nguyên tử Quốc tế IAEA [3]
*Sắc ký khí - Phổ khối (GC-MS)
Nhóm nghiên cứu của Syr-song Chen đã phát triển quy trình phân tích methyl thủy ngân và thủy ngân vô cơ trong cá, sử dụng hỗn hợp dung dịch như kiềm tetra methyl ammonium hydroxide, Cu2+, natri tetraethylborate và n-heptane trong quá trình chiết xuất Các dẫn xuất thủy ngân được giải hấp trong ống hóa hơi của sắc ký khí và phân tích bằng khối phổ Thời gian phân tích mỗi mẫu trên thiết bị GC-MS được tối ưu khoảng 8 phút, với thời gian gia nhiệt mẫu lần lượt là 3,5, 2,5 và 1,5 phút Hiệu suất thu hồi của methyl thủy ngân và thủy ngân vô cơ đạt lần lượt 92,3%, 96,1% và 93,6%, 95,5% Phương pháp này đã được áp dụng để phân tích ba mẫu chuẩn đối chứng, bao gồm cá ngừ BCR CRM 464, thịt cá mập NRC DORM-2 và gan cá mập NRC DOLT-2.
S Mishrađã sử dụng phương pháp sắc ký khì khối phổ để xác định methyl thủy ngân và Hg 2+ trong các mẫu trầm tìch, nước biển từ Mumbai, Ấn Độ Quy trình phân tích đơn giản bao gồm quá trính methyl hóa với Na[B(C6H5)4], quá trính chiết pha rắn, sau đó được phân tìch trên hệ thiết bị GC-MS Phương pháp đã được tối ưu các thông số quan trọng như vật liệu hấp phụ, thời gian chiết, nhiệt độ chiết và pH Sau khi chiết, sợi được đưa vào ống hóa hơi của GC và bắt đầu quá trính giải hấp, để tách và phân tích Giới hạn phát hiện đối với methyl thủy ngânvà thủy ngân vô cơ lần lượt là 0,02 và 0,05 mg/g Tác giả đã sử dụng các mẫu chuẩn để phân tìch kiểm tra phương pháp Tổng hàm lượng thủy ngân trong các mẫu khác nhau được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử kết hợp kỹ thuật hydride hóa[40]
*Sắc ký khí-Quang phổ huỳnh quang nguyên tử
Luis Carrasco đã phát triển một phương pháp hiệu quả để xác định lượng vết của các dạng thủy ngân hữu cơ trong các mẫu sinh học khác nhau Phương pháp này kết hợp kỹ thuật propyl hóa với vi chiết pha rắn Headspeace, mang lại độ chính xác cao trong việc phân tích.
Phương pháp HS-SPME đã được áp dụng để phân tích mẫu trên hệ thống sắc ký khí GC kết hợp với quang phổ huỳnh quang nguyên tử Py-AFS, được tối ưu hóa nhằm nâng cao độ nhạy Kỹ thuật này cho phép xác định tỉ lệ giữa methyl thủy ngân (MeHg) và ethyl thủy ngân.
Quá trình propyl hóa các mẫu EtHg được tối ưu hóa cùng với chất mang và tốc độ dòng khí, với tốc độ thay đổi từ 2 đến 6 ml/phút Nhiệt độ pyrolyser được điều chỉnh tối ưu ở mức 750 °C Giới hạn phát hiện và định lượng đạt được trong điều kiện tối ưu lần lượt là 0,04 ng/g và 0,13 ng/g cho MeHg và EtHg Phương pháp này đã được áp dụng để phân tích mẫu chuẩn DORM-2 và xác định thủy ngân hữu cơ trong cá và trứng cá.
Juan Jose Berzas Nevado và cộng sự đã phát triển một phương pháp nhanh chóng và đơn giản để phân tích thủy ngân vô cơ và monoorganomercury (MMHg) trong mẫu sinh học Quy trình bao gồm chiết thủy ngân bằng vi sóng trong dung dịch kiềm, kết hợp với sắc ký khí mao quản và detector huỳnh quang nguyên tử (CGC-pyro-AFS) sử dụng cột DB-5 Phương pháp này được tối ưu hóa để nâng cao độ nhạy và giảm thời gian phân tích, với giới hạn phát hiện là 2 pg cho MMHg và 1 pg cho thủy ngân vô cơ Đặc biệt, việc sử dụng vi sóng trong chiết xuất và loại bỏ các bước làm sạch trước khi ethyl hóa đã cải thiện đáng kể thời gian phân tích so với các phương pháp tương tự Phương pháp đã được kiểm tra độ tin cậy qua phân tích mẫu chuẩn DORM-2 và DOLT-3, với hiệu suất thu hồi đạt từ 92-105%.
1.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử hơi lạnh(CV-AAS)
Kỹ thuật hấp thụ nguyên tử hơi lạnh được áp dụng để xác định thủy ngân lỏng ở áp suất hơi cao 1,3 x 10^-3 mmHg tại 25°C, hoặc khi thủy ngân tồn tại dưới dạng đơn nguyên tử Phương pháp này sử dụng chất khử mạnh để chuyển đổi Hg2+ thành Hg0, đồng thời sử dụng khí mang để đưa dung dịch hoặc hơi thủy ngân vào ống thạch anh Độ hấp thụ quang của thủy ngân được xác định ở bước sóng 253,7 nm từ đèn HCL, với các loại khí mang như Ar, N2 hoặc không khí sạch.
Vào năm 2012, nhóm nghiên cứu của AQ.Shah đã phát triển phương pháp CV-AAS, một kỹ thuật quang phổ đơn giản và nhanh chóng để xác định hàm lượng methyl thủy ngân (MeHg) và thủy ngân vô cơ (Hg 2+) trong 10 loài cá nước ngọt Phương pháp này sử dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử hơi lạnh sau khi xử lý mẫu ướt bằng kiềm, với việc thêm clorua và natri tetrahydroborate cho MeHg và Hg 2+ Độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua việc xác định hàm lượng MeHg và Hg 2+ trong mẫu chuẩn DORM-2 và các mẫu hải sản, với giới hạn phát hiện lần lượt là 0,117 và 0,133 àg/kg Kết quả cho thấy hàm lượng MeHg và Hg 2+ trong thịt của mười loài cá dao động từ 28,4 đến 56,3 àg/kg và từ 3,01 đến 8,11 àg/kg.
Nhóm nghiên cứu của Mustafa Tuzen đã sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử hơi lạnh để xác định thủy ngân vô cơ và methyl thủy ngân trên vi khuẩn Staphylococcus aureus Chất phân tích được tách trên cột Dowex Optipore V-493 micro-colum và quá trình rửa giải được thực hiện với 0,1 mol/L HCl cho methyl thủy ngân và 2 mol/L HCl cho Hg 2+ ở pH 2-6 Các điều kiện phân tích tối ưu bao gồm pH, lượng chất hấp thụ sinh học và khối lượng mẫu, với giới hạn phát hiện là 2,5 ng/L đối với Hg 2+ và 1,7 ng/L đối với methyl thủy ngân Khả năng hấp thụ sinh học cho Hg 2+ và methyl thủy ngân lần lượt là 6,5 và 5,4 mg/g Quy trình đã được áp dụng thành công để xác định Hg 2+ và methyl thủy ngân trong các mẫu cá.
1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
*Nguyên lý sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Tối ưu quy trình phân tích hàm lượng đồng thời ba dạng thủy ngân (thủy ngân vô cơ, methyl thủy ngân, ethyl thủy ngân) trong một số loài hải sản bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với đo khối phổ plasma cao tần cảm ứng (LC-ICP-MS) đã được thực hiện Phương pháp LC-ICP-MS được áp dụng để phân tích các loài hải sản trên thị trường, nhằm đánh giá bước đầu mức độ ô nhiễm thủy ngân trong thực phẩm.
Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu này sử dụng mẫu hải sản và động vật thủy sinh thu thập từ thị trường nhằm đánh giá mức độ ô nhiễm.
Tối ưu hóa điều kiện phân tích đồng thời ba dạng thủy ngân: thủy ngân vô cơ, methyl thủy ngân và ethyl thủy ngân bằng phương pháp LC-ICP-MS bao gồm việc tối ưu các thành phần của pha động, tốc độ dòng chảy trên hệ thống HPLC, cũng như tối ưu tốc độ va chạm và tự động hóa các thông số thiết bị trên hệ thống ICP-MS.
Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết xuất sử dụng bể rung siêu âm nhằm tối ưu hóa các thông số như thời gian chiết, nhiệt độ chiết và thành phần dung môi chiết.
Thẩm định xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích bao gồm các yếu tố quan trọng như giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đường chuẩn, độ lặp lại, độ tái lặp, độ thu hồi và độ không đảm bảo đo Những yếu tố này đóng vai trò then chốt trong việc đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của các kết quả phân tích.
Đánh giá và phân tích kết quả thu được từ các mẫu nghiên cứu và mẫu đối chứng cần dựa trên việc so sánh và tham chiếu với các quy chuẩn kỹ thuật hiện hành Việc này giúp xác định tính chính xác và độ tin cậy của kết quả, đồng thời cung cấp cơ sở để biện luận về sự phù hợp của phương pháp nghiên cứu đã áp dụng.
Đưa ra kết luận ban đầu về mức độ ô nhiễm thủy ngân trong các mẫu hải sản được nghiên cứu
Nghiên cứu ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩm hiện nay chủ yếu sử dụng kỹ thuật ICP-MS, một phương pháp ra đời vào đầu những năm 80 và ngày càng thể hiện ưu điểm vượt trội so với các kỹ thuật phân tích khác như AAS, ICP-AES hay ICP-OES ICP-MS nổi bật với độ nhạy, độ lặp lại và độ chính xác cao, cho phép xác định đồng thời nhiều kim loại trong thời gian ngắn Khi kết hợp với sắc ký lỏng hiệu năng cao, phương pháp này cho thấy hiệu quả tách tốt và độ ổn định cao, rất phù hợp cho việc phân tích các dạng tồn tại của kim loại nặng, đặc biệt là thủy ngân.
Nghiên cứu này áp dụng kỹ thuật LC-ICP-MS kết hợp với phương pháp lấy mẫu và chiết mẫu bằng bể rung siêu âm để phân tích và đánh giá mức độ ô nhiễm của một số loài hải sản trên thị trường, dựa trên điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm.
Thực nghiệm
2.3.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
Hệ thống HPLC-ICP-MS Nexion 350X của Perkin Elmer, được sử dụng trong nghiên cứu này, được trang bị ba chế độ đo: chuẩn, va chạm và động học phản ứng Nghiên cứu áp dụng cột tách C18 5µm với kích thước 150 x 4,6 mm và hệ thống bơm mẫu tự động để đưa mẫu vào bộ phận tạo sol.
Hình 2 1: Hệ thống ICP-MS Nexion 350X (Perkin Elmer)
Bể rung siêu âm Elmer được sử dụng để chiết xuất các dạng thủy ngân từ mẫu nền Các mẫu được đồng nhất bằng máy xay mẫu Philips và sau đó được cân bằng bằng cân phân tích Mettler Toledo với độ chính xác lên tới 0,0001 g.
Để chứa dung dịch mẫu, sử dụng ống ly tâm Falcon loại 15ml và 50ml Mẫu sẽ được lọc qua màng lọc 0,45µm Minisart trước khi phân tích Các micropipette và đầu tip Eppendorf được dùng để hút chính xác thể tích hóa chất và pha chuẩn Ngoài ra, các dụng cụ phòng thí nghiệm thông thường như bộ chia hóa chất tự động Dispenser, bình định mức 25ml, 50ml, 100ml IsoLab, giấy lọc băng xanh và túi đựng mẫu cũng được sử dụng.
Trong nghiên cứu này, các chuẩn được sử dụng bao gồm chuẩn đơn Hg 2+ 1000 ppm (Merck), MeHg (Sigma-Aldrich, > 99,8%), EtHg (TRC, > 99.9%), axit HCl 37% (Merck) và mẫu chuẩn chứng nhận DORM-4 (Canada) Các dung dịch như Methanol (MeOH), Isopropanol (IsP) và 2-Mercaptoethanol (2-ME) có độ tinh khiết > 99,9% được cung cấp bởi Sigma, cùng với muối Ammonium acetate (Merck, > 99%) Nước sử dụng trong nghiên cứu là nước deion và khí argon có độ tinh khiết 99,999% từ Messer Ngoài ra, các dung dịch chuẩn hóa thiết bị của hãng Perkin Elmer và dung dịch làm mát cho Chiller cũng được sử dụng.
2.3.2 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất, chất chuẩn
Để chuẩn bị dung dịch HCl 1%, hãy hút chính xác 1,35 ml HCl 37% vào bình định mức 50 ml đã chứa một ít nước deion Sau đó, định mức bằng nước deion và lắc đều để có được dung dịch đồng nhất.
*Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trung gian :
Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian 10ppm chứa đồng thời 3 dạng thủy ngân (Hg²⁺, MeHg, EtHg) bằng cách hút chính xác 0,25 ml từ các dung dịch chuẩn đơn 1000 ppm vào bình định mức 25 ml và định mức bằng nước deion Dung dịch này cần được bảo quản ở nhiệt độ phòng và có thể sử dụng trong vòng 3 tháng.
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian 250 ppb từ dung dịch trung gian 1, cần hút chính xác 0,625 ml dung dịch trung gian 1 vào bình định mức 25 ml và sau đó định mức bằng nước deion.
* Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc:
Để chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn làm việc với nồng độ 1; 2.5; 5; 10; 20ppb, cần hút chính xác 0.1; 0.25; 0.5; 1 và 2 ml dung dịch chuẩn trung gian 2 vào các bình định mức 25ml, sau đó định mức tới vạch bằng dung dịch axit HCl 1% và lắc đều Dãy dung dịch chuẩn này nên được pha mới hàng ngày trước khi sử dụng.
*Lấy mẫu và bảo quản:
Các mẫu cá được thu thập từ các chợ, siêu thị và cửa hàng tại Hà Nội, sau đó được mã hóa và đồng nhất trước khi được bảo quản trong tủ lạnh đông sâu.
2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện phân tích Thủy ngân trên ICP-MS
Thủy ngân được lựa chọn với số khối phù hợp để đảm bảo đồng vị phổ biến và ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác Độ nhạy của phép đo bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như lưu lượng khí mang, công suất tạo plasma, thế thấu kính ion và độ sâu plasma, và những yếu tố này được tối ưu hóa tự động thông qua dung dịch chuẩn hóa thiết bị Nexion theo hướng dẫn của Perkin Elmer Nghiên cứu cũng xem xét ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ như isopropanol và methanol nhằm tăng cường tín hiệu và giảm thời gian lưu của chất phân tích Thêm vào đó, thời gian bơm và rửa mẫu được khảo sát để tiết kiệm thời gian phân tích và tránh nhiễm chéo giữa các lần đo mẫu.
2.3.4.Xử lí mẫu bằng chiết siêu âm a Xử lí sơ bộ và bảo quản mẫu
Các mẫu được thu thập, mã hóa sau đó chúng được đồng nhất và được bảo quản trong đủ đông sâu ở -20 0 C b Xử lí mẫu bằng chiết siêu âm
Cân 2,5g mẫu vào ống ly tâm 50ml, sau đó thêm 1ml axit clohydric 37%, 0,1ml 2-Mercaptoethanol và 10ml nước deion Ngâm ống trong bể rung siêu âm ở 60°C trong 30 phút, sau đó để nguội Lắc mẫu trên máy Vortex trong 2 phút, rồi ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút Định mức dung dịch lên 50ml bằng nước deion và lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi phân tích bằng thiết bị LC-ICP-MS.
Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
Phương pháp xác định đồng thời ba dạng thủy ngân (Hg²⁺, MeHg, EtHg) bằng HPLC-ICP-MS đã được thẩm định các thông số tiêu chuẩn để đảm bảo độ chính xác của phép đo Đường chuẩn được xây dựng bằng cách đo dãy dung dịch chuẩn với nồng độ 1, 2,5, 5, 10, và 20 ppb, ghi nhận tín hiệu Cps của ion Hg⁺ Đường chuẩn phải có hệ số xác định R² ≥ 0,995 và độ chệch thỏa mãn yêu cầu, với độ chệch tối đa ≤ 20% tại mức LOQ.
Giới hạn phát hiện phương pháp (MDL) và giới hạn định lượng phương pháp (MQL) được xác định thông qua việc phân tích lặp lại 6 lần mẫu trắng có bổ sung Hg 2+, MeHg và EtHg ở nồng độ thấp hơn giới hạn thấp nhất trong đường chuẩn MDL là nồng độ thấp nhất mà tại đó tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu đạt 3, tức là S/N = 3.
Giới hạn định lượng (MQL) là nồng độ tối thiểu mà tại đó chất phân tích có thể được phát hiện một cách đáng tin cậy, thường được xác định với tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10 Để đảm bảo độ chính xác, quá trình thử nghiệm cần được thực hiện lặp lại 6 lần bởi cùng một người trong khoảng thời gian ngắn, và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của hàm lượng chất phân tích sẽ được tính toán.
Tiến hành thì nghiệm n lần lặp lại
Trong đó x là giá trị trung bính số học của tập hợp các giá trị xi , còn xi là giá trị kết quả của mỗi lần thì nghiệm
+ Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại:
Trong nhiều loại thực phẩm, hàm lượng chất phân tích có thể không được phát hiện trong mẫu thử nhỏ hơn giới hạn định lượng của phương pháp Khi đó, độ lặp lại có thể được xác định thông qua mẫu thêm chuẩn ở cùng mức nồng độ Độ tái lặp được thực hiện bằng cách tiến hành thí nghiệm trong những điều kiện khác nhau, bao gồm thời gian phân tích và người thực hiện Đánh giá độ lệch chuẩn tương đối tái lặp (RSDR) là một phần quan trọng trong quá trình này.
Các thông số về độ lệch chuẩn tương đối lặp lại và độ lệch chuẩn tương đối tái lặp được tham chiếu theo tiêu chuẩn AOAC tại các mức nồng độ tương ứng Độ thu hồi được xác định bằng cách thêm một lượng chất đã biết vào mẫu thực, với nồng độ của chất nghiên cứu sau khi thêm chuẩn phải nằm trong khoảng đã khảo sát Độ thu hồi R% được tính toán dựa trên tỷ lệ giữa lượng chất thu hồi được và lượng chất đã thêm vào mẫu.
Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn
Cm: Nồng độ trong mẫu
Cc: Nồng độ chuẩn thêm
Các thông số như độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, độ lệch chuẩn tương đối tái lặp và độ thu hồi được tham chiếu theo tiêu chuẩn AOAC ở các mức nồng độ tương ứng Độ không đảm bảo đo được xác định dựa trên các kết quả đạt được trong quá trình thẩm định phương pháp độ đúng và độ chụm theo tài liệu ISO 21748:2004.
2.5 Phân tích mẫu, xử lí số liệu, đánh giá kết quả phân tích
Sau khi xác định giá trị sử dụng, phương pháp này được áp dụng để phân tích các dạng thủy ngân trong mẫu hải sản thu thập từ các chợ, siêu thị và cửa hàng tại thành phố Hà Nội Kết quả phân tích được xử lý bằng các thuật toán thống kê thông qua phần mềm Excel và Minitab.
Hàm lượng thủy ngân trong các mẫu hải sản được so sánh với mức giới hạn ô nhiễm tối đa theo quy chuẩn QCVN 8-2:2011/BYT, nhằm đảm bảo kết quả thử nghiệm đạt yêu cầu.
Đường chuẩn tuyến tình xây dựng phải có hệ số xác định hồi quy R 2 ≥0,995
Để đảm bảo độ nhạy của phương pháp phân tích, cần tiến hành rửa hệ thống sau mỗi mẫu có hàm lượng thủy ngân (Hg) tổng cao và trước khi phân tích các mẫu trắng thuốc thử.
Trong cùng một lô mẫu phải có ìt nhất một mẫu trắng
Mỗi 10 mẫu phân tích, cần phải đo lại mẫu trắng và mẫu kiểm soát chất lượng nội bộ (IQC) Nếu mẫu IQC không nằm trong khoảng 90-110%, cần rửa hệ thống và thiết lập lại đường chuẩn trước khi tiếp tục phân tích.
Mẫu phân tìch lặp lại có độ chệch ≤20%, nếu lớn hơn phải thực hiện phân tìch lại
Mẫu phân tìch thêm chuẩn có hiệu suất thu hồi phải đáp ứng tiêu chì của AOAC cho mức hàm lượng tương ứng.
Phân tìch mẫu, xử lì số liệu, đánh giá kết quả phân tìch
3.1 Điều kiện phân tích trên ICP-MS
3.1.1 Lựa chọn số khối, chế độ phân tích các nguyên tố
Việc lựa chọn số khối của các nguyên tố dựa trên những nguyên tắc cơ bản:
+ Phải là một trong những đồng vị phổ biến nhất trong tự nhiên
+ Ảnh hưởng bởi sự chèn khối phải không có hoặc bé nhất
+ Sự ảnh hưởng của các mảnh ion oxìt càng ìtcàng tốt
Kết quả lựa chọn số khối của thủy ngânđược thực hiện trong bảng 3.1:
Bảng 3 1: Số khối của thủy ngân
Nguyên tố Đồng vị Thủy ngân
Nguyên tố 202 Hg có số khối tương đối ổn định và ít bị ảnh hưởng bởi sự trùng khối, đồng thời là đồng vị phổ biến nhất trong tự nhiên với tỉ lệ 29,86% Vì vậy, nó có thể được phân tích hiệu quả bằng chế độ chuẩn.
3.1.2 Tối ưu tự động các thông số cho thiết bị ICP-MS
Các thông số như công suất RF, lưu lượng khí mang, độ sâu plasma và thế thấu kính ion ảnh hưởng đến độ chính xác, độ nhạy và độ ổn định của phép phân tích Những thông số này được tối ưu tự động trên hệ thống, trong quá trình sử dụng các dung dịch chuẩn hóa do hãng Perkin Elmer cung cấp Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.2.
