Yếu tố ảnh hƣởng Điều kiện tối ƣu
Dung môi hữu cơ trong pha động Isopropanol 4% (v/v)
Tốc độ dòng pha động 0,9 mL/phút
Nhiệt độ chiết 60oC
Thời gian chiết 40 phút
Nồng độ 2-Mercaptoethanol 0,2%
Áp dụng cácđiều kiện tối ưu, quy trính xử lý mẫu áp dụng với nền mẫu hải sản như sau:
Sơ đồ 2. Quy trính xử lì mẫu tối ưu
3.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp
3.4.1 Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu của phương pháp được xác định bằng cách phân tìch mẫu trắng 10 lần, mẫu thêm chuẩn ở cùng nồng độ.Kết quả phân tìch được thể hiện qua sắc ký đồ hình 3.18.
Cân 2,5gam mẫu
Thêm 1ml axit clohydric 37%, 0,1ml 2- Mercaptoethanol và 10ml nước deion
Rung siêu âm trong 40 phút ở 600C
Ly tâm, định mức 50ml và lọc qua màng 0,45µm LC-ICP-MS
Hình 3. 18: Sắc ký đồ phân tích lần lượt các mẫu Blank, thêm chuẩn của Hg2+,MeHg, EtHg, hỗn hợp 3 chất
Kết quả cho thấy mẫu trắng không xuất hiện pic sắc ký tại thời gian lưu như trong các mẫu thêm chuẩn, mẫu thêm chuẩn của các chất phân tìch có thời gian lưu trùng với từng chất trong hỗn hợp chuẩn 3 chất phân tìch cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao.
3.4.2 Đường chuẩn
Xây dựng đường chuẩn làm việc bằng cách phân tích dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 1; 2,5; 5; 10; 20 ng/ml đối với Hg2+ và MeHg, dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 2,5; 5; 10; 20; 40 ng/ml đối với EtHg. Đường chuẩn xây dựng
biểu diễn sự phụ thuộc của tỉ lệ cường độ tìn hiệu chất phân tìch vào nồng độ chất phân tìch trong các dung dịch chuẩn. Kết quả thể hiện qua bảng 3.6 và hính 3.19-3.20.
Bảng 3. 6: Mối tương quan giữa nồng độ và cường độ tín hiệu (Cps) của MeHg
Nồng độ chuẩn (ng/ml) Diện tìch pic Hg2+ (cps) Diện tích pic MeHg (cps) Diện tìch pic EtHg (cps) 1 2851 3047 2,5 6023 2,5 7103 7569 5 13087 5 14249 14946 10 26224 10 28471 30044 20 54840 20 56942 60184 40 104281
Hình 3. 19: Đường chuẩn định lượng MeHg
y = 3007,x - 1,970 R² = 1 T ín h iệu (Cp s) Nồng độ (ppb)
Hình 3. 20:Đường chuẩn định lượng Hg2+
Hình 3. 21: Đường chuẩn định lượng EtHg
Phương trính đường chuẩn và hệ số hồi quy tuyến tình đã được tình toán và thể hiện trong bảng 3.7
Bảng 3. 7: Phương trình đường chuẩn
Chất phân tích Phƣơng trình đƣờng chuẩn
Y = a + bx Hệ số tƣơng quan MeHg y = - 1,970 + 3007,x 1,000 EtHg y = 195,7 + 2625,x 0,999 Hg2+ y = 0,068 + 2847,x 1,000 y = 2847.2x + 0.0689 R² = 1 T ín h iệu (Cp s) Nồng độ (ppb) Đường chuẩn Hg y = 2625.5x + 195.73 R² = 0.9991 T ín h iệu (cps) Nồng độ (ppb)
Với các kết quả thu được, hệ số xác định thể hiện sự phụ thuộc của diện tìch pic vào nồng độ chất phân tìch là tốt cho thấy hồn tồn có thể áp dụng định lượng chất phân tìch trong nền mẫu (R2≥ 0,9999).
Đường chuẩn làm việc của các chất phân tìch đều có hệ số xác địnhR2 ˃0,999, và độ chệch ˂15% tại mức 1ppb, là đáp ứng tốt yêu cầu về định lượng. Khoảng làm việc của đường chuẩn 1-40ppb là đáp ứng được hầu hết nồng độ của chất phân tìch trong đối tượng mẫu nghiên cứu. Với những mẫu có hàm lượng cao hơn cần pha lỗng để thu được tìn hiệu đo các chất phân tìch trong khoảng làm việc, tránh nhiễm bẩn hệ thống. Đường chuẩn làm việc được xây dựng mới hằng ngày trước khi phân tìch.
3.4.3 Giới hạn phát hiện phương pháp (MDL), giới hạn định lượng phương pháp (MQL) (MQL)
Để xác định MDL, phân tìch lặp lại ìt nhất 4 lần mẫu trắng có bổ sung MeHg, EtHg, Hg2+ ở nồng độ thấp hơn giới hạn thấp nhất trong đường chuẩn. xác định nồng độ thấp nhất mà tại đó tỷ lệ tìn hiệu/nhiễu bằng 3 S/N = 3).
Giới hạn định lượng MQL là nồng độ thấp nhất mà tại đó chất phân tìch có thể được phát hiện một cách đáng tin cậy. Nói chung MQL được xác định là tỷ lệ tìn hiệu/nhiễu nền S/N bằng 10.
Bảng 3. 8: Giới hạn phát hiện của 3 dạng thủy ngân
Nền mẫu Chất phân tích Nồng độ (µg/kg) Chiều cao peak (Cps) Nhiễu nền (cps) S/N
Cá MeHg 10 319 95 3,4 EtHg 24 298 3,1 Hg2+ 10 330 3,5
24 µg/kg; Hg2+:10µg/kg đối với nền mẫu cá. Giới hạn định lượng của phương pháp đáp ứng tốt được yêu cầu về giới hạn ô nhiễm thủy ngân trong thực phẩm theo các quy chuẩn hiện hành QCVN 8-2:2011/BYT; quyết định 46/2007/QĐ-BYT)
3.4.4 Độ lặp lại
Đối tượng mẫu thử trong nghiên cứu này chủ yếu là các loại mẫu hải sản đặc biệt là cá. Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp tiến hành phân tìch từng mẫu lặp lại 6 lần, đánh giá độ lệch chuẩn lặp lại tương đối RSD % . Đối với EtHg và Hg2+ do hàm lượng trong mẫu không phát hiện, nên tiến hành thêm chuẩn đánh giá tại mức 1,0 mg/kg chất vào nên mẫu. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.9 và hình 3.22
Bảng 3. 9: Kết quả phân tích lặp lại với nền mẫu cá
n MeHg (mg/kg) EtHg (mg/kg) Hg2+ (mg/kg) 1 1,13 1,06 0,94 2 1,21 1,03 1,01 3 1,16 0,99 0,94 4 1,2 1,07 1,01 5 1,17 1,05 0,92 6 1,32 0,96 0,94 Trung bình 1,20 1,03 0,96 RSD (%) 5,52 4,23 4,03
Bảng 3.9 và hính 3.22 cho thấy hệ số biến đổi CV % của MeHg, EtHg và Hg2+ đều nhỏ hơn giới hạn cho phép của AOAC.2012 là 11%. Do đó, phương pháp cho độ lặp lại tốt.
3.4.5 Độ tái lặp
Tiến hành đánh giá độ tái lặp của phương pháp bằng cách phân tích mẫu cá, mẫu phân tìch thêm 4 lần trong điều kiện có sự thay đổi về thời gian phân tìch.Kết quả được tổng hợp như trong bảng 3.10
Bảng 3. 10: Đánh giá độ tái lặp phương pháp
n MeHg (mg/kg) EtHg (mg/kg) Hg 2+ (mg/kg) 10/12/2018 11/12/2018 10/12/2018 11/12/2018 10/12/2018 11/12/2018 1 1,42 1,29 0,89 0,94 0,94 1,04 2 1,23 1,29 0,94 1,09 0,95 0,93 3 1,21 1,2 0,83 1,03 1,1 0,84 4 1,24 1,33 1,03 1,05 1,07 0,91 5 1,26 0,89 0,96 6 1,19 0,95 1,06 Trung bình 1,26 1,28 0,92 1,03 1,01 0,93 1,27 0,96 0,98 Sr2 0,007 0,003 0,005 0,004 0,005 0,007 MSwithin 0,00988 0,00868 0,0119 MSbetween 0,00019 0,00582 0,0036 %RSDR 7,93 12,49 12,71
Hình 3. 23: Kết quả phân tích độ tái lặp
Theo AOAC, độ lệch chuẩn tương đối tái lặp tại mức nồng độ 1 mg/kg yêu cầu ˂15,9%. Như vậy, độ lệch chuẩn tương đối tái lặp nằm trong khoảng 7,93–12,71% cho hàm lượng các chất trong khoảng 1 mg/kg là đáp ứng tốt yêu cầu của AOAC.
3.4.6 Độ chính xác * Độ thu hồi * Độ thu hồi
Độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách thêm chuẩn vào nền mẫu trắng tại mức 0,2 mg/kg, thì nghiệm trên 6 mẫu lặp lại. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.11.
Bảng 3. 11: Hiệu suất thu hồi của quy trình MeHg Hàm lƣợng thêm chuẩn (mg/kg) Hàm lƣợng xác định (mg/kg) Độ thu hồi
(%) trung bình Hiệu suất
0,2 0,195 97,60 96,35 0,2 0,194 97,20 0,2 0,196 98,10 0,2 0,184 92,00 0,2 0,195 97,30 0,2 0,192 95,90 EtHg 0,2 0,178 89,10 93,10 0,2 0,184 91,90 0,2 0,183 91,40 0,2 0,195 97,30 0,2 0,183 91,30 0,2 0,195 97,60 Hg2+ 0,2 0,183 91,60 95,17 0,2 0,186 92,90 0,2 0,19 95,10 0,2 0,198 98,90 0,2 0,194 97,20 0,2 0,191 95,30
Từ bảng kết quả, hiệu suất thu hồi của cả 3 dạng thủy ngân đều cao hơn 90% cho thấy phương pháp có độ chình xác cao. Quy trình phân tích đáp ứng các yêu cầu về độ lặp lại và thu hồi để phân tìch hàm lượng 3 dạng thủy ngân trong mẫu cá. Độ thu hồi của chất phân tìch nằm trong khoảng 94,87 - 98,90%. Do đó quy trình này là phù hợp để phân tìch mẫu thủy hải sản.
* Đánh giá mẫu chuẩn được chứng nhận CRM DORM-4
Để kiểm chứng phương pháp, mẫu chuẩn DORM-4 của các kim loại Pb, Cd, As, MeHg… trong nền mẫu cá đã được phân tìch. Mẫu được Hội đồng nghiên cứu Quốc Gia Canada NRC-CNRC sản xuất và được chứng nhận bởi các phịng thì nghiệm uy tìn trên thế giới. Kết quả phân tìch được thể hiện trong bảng 3, được đánh giá thông qua kiểm định t-student nhằm so sánh sự sai khác giữa giá trị phân tìch và giá trị được chấp nhận:
Bảng 3. 12: Kết quả phân tích mẫu chuẩn (CRM) DORM-4
Hàm lƣợng MeHg phân tích (mg/kg) Hàm lƣợng MeHg trung bình (mg/kg) Hàm lƣợng MeHg mẫu CRM DORM-4 (mg/kg) 0,388 0,342 ± 0,037 0,355 ± 0,028 0,355 0,343 0,332
Mẫu CRM được tiến hành phân tìch lặp lại 4 lần.Từ tập số liệu trên tình được giá trị trung bính là 0,342 mg/kg và độ lệch chuẩn SD là 0,0098. Với giá trị được chấp nhận là 0,355 mg/kg thì
ttính = 0,342 0,355 x2
0,024
= 1,08
Vậy ttính<tbảng nên chứng tỏ khơng có sự khác nhau có nghĩa giữa giá trị phân tìch và giá trị thực hay phương pháp khơng mắc sai số hệ thống và có thể dùng để xác định MeHg trong mẫu hải sản.
Kết quả phân tìch mẫu chuẩn DORM-4 cho thấy hàm lượng MeHg đạt yêu cầu, chứng tỏ phương pháp có độ tin cậy tốt, hồn tồn phù hợp để phân tìch các dạng thủy ngân trên nền mẫu hải sản.
Hình 3. 25: Sắc ký đồ phân tích mẫu chuẩn CRM DORM-4
3.5. Phân tích mẫu thực tế
Các mẫu lựa chọn để phân tìch được lấy ngẫu nhiên trên địa bàn Hà Nội gồm hơn 30 mẫu với12loại thủyhải sản. Các mẫu nghiên cứu có cả lồi ăn thịt có nguy cơ tìch lũy hàm lượng thủy ngân cao cá mút đá, cá ngừ,.. và loại ăn thực vật và vi sinh vật phù du nhỏ có mức độ tìch lũy thủy ngân thấp hơn cá trắm, cá chép,.. . Hàm lượng trung bính củaba dạng thủy ngân trong các mẫu khảo sát và một số sắc đồ minh họa được thể hiện trong bảng 3.13 hình 3.26 – 3.27. Kết quả được so sánh với giới hạn cho phép của MeHg trong QCVN 8-2:2011/BYT của bộ Y tế.
Bảng 3. 13: Kết quả phân tích mẫu hải sản
Lồi/số lượng n MeHg (mg/kg) EtHg (mg/kg) Hg2+ (mg/kg) Cá mút đá n=3 0,61 ± 0,07 - 0,052 ± 0,08 Mực nang n=3 0,10 ± 0,011 - <0,03 Cá ngừ (n=2) 0,23 ± 0,025 - - Cá trứng (n=3) <0,03 - - Cá hồi n=3 <0,03 - - Cá thu (n=4) <0,03 - - Cá basa (n=3) <0,03 - - Cá hồng n=2 <0,03 - <0,03 Cá nục n=3 <0,03 - - Cá trắm cỏ n=2 - - - Cá chép (n=1) - - - Tôm càng xanh (n=1) - - -
Ghi chú (- : Mẫu có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện của phương pháp
Hình 3. 27: Kết quả phân tích hàm lượng methyl thủy ngân so sánh với QCVN 8-2:2011/BYT
Các kết quả cho thấy, tất cả các mẫu đều không phát hiện hàm lượng EtHg, trong khi hàm lượng MeHg chiếm tới khoảng 90% so với hàm lượng thủy ngân tổng số trong các mẫu hải sản có phát hiện. Các lồi ăn thịt có hàm lượng methyl thủy ngân cao hơn các loài chủ yếu ăn thực vật và sinh vật phù du nhỏ là phù hợp với quy luật tìch lũy thủy ngân trong tự nhiên. Tuy nhiên tất cả các mẫu đều có hàm lượng MeHg nằm trong giới hạn cho phép của Bộ y tế QCVN 8-2: 2011/BYT : ≤ 1 mg/kg đối với cá thịt, ≤ 0,5 mg/kg với tất cả các lồi cá khơng bao gồm cá cho thịt [1]. Như vậy, bước đầu có thể nhận thấy mức độ ô nhiễm thủy ngân trong hải sản ở nước ta vẫn trong mức an tồn, tuy nhiên, cần có những nghiên cứu sâu hơn nhằm có kết quả tồn diện hơn để ngăn ngừa nguy cơ ô nhiễm thủy ngân đối với người tiêu dùng.
KẾT LUẬN
Đề tài „Nghiên cứu quy trính phân tìch hàm lượng các dạng thủy ngân trong một số loài hải sản bằng phương pháp khối phổ Plasma cao tần cảm ứng ghép nối sắc ký LC-ICP-MS‟ đã thực hiện được các nội dung nghiên cứu sau:
-Khảo sát các điều kiện nhằm tối ưu quy trính phân tìch đồng thời 3 dạng thủy ngân trong hải sảnbằng LC-ICP-MS.Ngồi các thơng số của thiết bị có thể tối ưu tự động, kết quả khảo sát cho tốc độ pha động 0,9 ml/phút, tỉ lệ Isopropanol là 4%, tối ưu các điều kiện xử lý mẫu, nhiệt độ chiết là 60oC, thời gian chiết là 40 phút.
-Thẩm định xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tìch với các thơng số như: đường chuẩn xác định các dạng thủy ngân có hệ số xác định R2≥0,999; giới hạn phát hiện MDL trong khoảng 0,01-0,024 mg/kg đáp ứng được các yêu cầu về mứcô nhiễm thủy ngân theo các quy chuẩn hiện hành; độ lệch chuẩn tương đối lặp lại trong khoảng 4,03 - 5,52%, độ lệch chuẩn tương đối tái lặp 7,93 – 12,71%; độ thu hồi 93,10 - 96,35% ; là đáp ứng tốt các yêu cầu theo AOAC.
-Áp dụng quy trính phân tìch đánh giá hàm lượng 3 dạng thủy ngân trong một số loài hải sản.
-Bước đầu đánh giá được mức độ ô nhiễm các dạng thủy ngân đặc biệt là methyl thủy ngân) trong nhóm đối tượng khảo sát. Nghiên cứu cũng chỉ ra mức độ, hàm lượng ô nhiễm trong một số loài loài khác nhau.
Nghiên cứu của đề tài đã góp phần làm rõ mức độ ơ nhiễm hiện nay của thủy ngân trong hải sản ở Việt Nam, góp phần quan trọng trong cơng tác y tế dự phòng. Tuy nhiên cần thực hiện những nghiên cứu sâu hơn, đặc biệt trên các loại thủy hải sản ở những vùng có mức độ ơ nhiễm môi trường cao, nhằm đưa ra những khuyến nghị, cảnh bảo cần thiết cho chình quyền và người tiêu dùng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Phạm Tiến Đức, Phạm Luận 2010 , “Xác định đồng thời lượng vết kim loại nặng trong thực phẩm bằng phương pháp ICP-MS”, Kỷ yếu hội nghị an toàn thực phẩm.
2. Trần Tứ Hiếu, Lê Hồng Minh, Nguyễn Viết Thức 2008 ,“Xác định lượng vết kim loại nặng trong các loài trai ốc Hồ Tây – Hà Nội bằng phương pháp ICP – MS”,Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, Tập 13, số 2, trang 111 - 115.
Tài liệu tiếng nƣớc ngoài
3. A.M. Caricchia, G. Minervini, P. Soldati, S. Chiavarini, C. Ubaldi, R. Morabito (1997), " GC-ECD determination of methylmercury in sediment samples using a SPB-608 capillary column after alkaline digestion", Microchem J., No 55(1),
44–55.
4. A.Q.Shaha, T.G Kazia,*, J.A. Baiga,1, H.IAfridia, M.B Arainb. (2012). "Simultaneously determination of methyl and inorganic mercury in fish species by cold vapour generation atomic absorption spectrometry." Food Chemistry,
No. 134, 2345-2349.
5. A.S.Lino, D.Kasper, Y.S.Guida, J.R.Thomaz, O.Malma 2019 , “Total and methyl mercury distribution in water, sediment, plankton and fish along the Tapajós River basin in the Brazilian Amazon”, Chemosphere, Volume 235,
November 2019, Pages 690-700.
6. Aberg, B., L. Ekman, R .Falk, U. Greitz, G. Persson, and J.O. Snihs (1969). "Meltabolism of methyl mercury (203Hg) compound in man",Arch. Environ.
Health, No 19(4), 478-484.
7. Alpers. C.N., a. H., M.P (2000). "Mercury contaminanation from historic gold mining in California”, U.S Geological Survey, Fact Sheet 061-00.
8. Al-Saleem (1976). "Levels of mercury and pathologic changes in patients with organomercury poisoning ",WHO Bulletin (Supplement), No 11, pp. 99-104. 9. Andren, A., and Harriss, R.C (1973). "Methyl mercury in estuarine
10. Antonio Camacho, Carlos Rochera, RaphaëlleHennebelle 2015 , “Total mercury and methyl-mercury contents and accumulation in polar microbial mats”, Science of The Total Environment, Volumes 509–510, Pages 145-153. 11. Ash, R. K. a. K. O. (1992). "A Simple ICP-MS Procedure for the
Determination of Total Mercury in Whole Blood and Urine.", Journal of
Clinical Laboratory Analysis, 6: pp. 190-193.
12. Beatriz Ballesteros, R. R., María de la Menta, Ballesteros (March 2016). "Heavy metals and nutritional elements analysis on food by Inductively Coupled Plasma-Mass, Spectrometry (ICP-MS).",Biosaia, No. 5, p.p 139-142.
13. C.L.S.Wiseman, A.Parnia, D.Chakravartty, J.Archbold, R.Copes, D.Cole 2019 , “Total, methyl and inorganic mercury concentrations in blood and environmental exposure sources in newcomer women in Toronto, Canada”,