a. Xử lí sơ bộ và bảo quản mẫu
Các mẫu được thu thập, mã hóa sau đó chúng được đồng nhất và được bảo quản trong đủ đông sâu ở -200C.
b. Xử lí mẫu bằng chiết siêu âm
Cân khoảng 2,5g mẫu vào ống ly tâm 50ml, thêm 1ml axit clohydric 37%, 0,1ml 2-Mercaptoethanol và 10ml nước deion vào mỗi ống. Ống được ngâm trong bể rung siêu âm trong 30 phút tại 600C. Sau đó, để nguội, mẫu được lắc trên máy Vortex trong 2 phút trước khi hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút và định mức 50ml bằng nước deion. Cuối cùng, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45µm trước khi phân tìch trên thiết bị LC-ICP-MS.
2.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp
Phương pháp xác định đồng thời 3 dạng thủy ngân Hg2+, MeHg, EtHg) bằng HPLC-ICP-MS được thẩm định các thơng số tiêu chuẩn nhằm đảm bảo độ chình xác của phép đo.
Đƣờng chuẩn: xây dựng đường chuẩn tuyến tình bằng cách đo dãy dung dịch
chuẩn có nồng độ1; 2,5; 5; 10; 20ppb và ghi nhận tìn hiệu Cps của ion Hg+. Đường chuẩn xây dựng được phải có hệ số xác định R2 ≥ 0,995, và độ chệch thỏa mãn. thường độ chệch yêu cầu ≤ 20% tại mức LOQ)
Giới hạn phát hiện phương pháp (MDL), giới hạn định lượng phương pháp (MQL):
Để xác định MDL, phân tìch lặp lại ở 6 lần mẫu trắng có bổ sung Hg2+, MeHg, EtHg ở nồng độ thấp hơn giới hạn thấp nhất trong đường chuẩn, xác định nồng độ thấp nhất mà tại đó tỷ lệ tìn hiệu/nhiễu bằng 3 S/N = 3).
Giới hạn định lượng (MQL là nồng độ thấp nhất mà tại đó chất phân tìch có thể được phát hiện một cách đáng tin cậy. Nói chung MQLđược xác định là tỷ lệ tìn hiệu/nhiễu S/N bằng 10.
Độ lặp lại:tiến hành thì nghiệm lặp lại 6 lần, do cùng một người thực hiện,
trong khoảng thời gian ngắn. Tình độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tìch. Các cơng thức tình tốn như sau:
Tiến hành thì nghiệm n lần lặp lại. + Giá trị trung bính : n 1 i i x n 1 x
Trong đó x là giá trị trung bính số học của tập hợp các giá trị xi , còn xi là giá trị kết quả của mỗi lần thì nghiệm.
+ Độ lệch chuẩn : 1 n ) x x ( SD 2 n 1 i i
+ Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại:
100 X SD RSDr
Trong nhiều mẫu thực phẩm, hàm lượng chất phân tìch có thể khơng phát hiện được trong mẫu thử nhỏ hơn giới hạn định lượng của phương pháp . Khi đó độ lặp lại có thể được tình dựa trên mẫu thêm chuẩn ở cùng mức nồng độ.
Độ tái lặp: độ tái lặp được tiến hành bằng cách thực hiện thì nghiệm trong
những điều kiện khác nhau như thời gian phân tìch, người thực hiện. Đánh giá độ lệch chuẩn tương đối tái lặp RSDR
Các thông số về độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, và độ lệch chuẩn tương đối tái lặp được tham chiếu với tiêu chuẩn AOAC ở các mức nồng độ tương ứng.
Độ thu hồi: độ thu hồi được xác định dựa trên việc thêm một lượng chất đã biết
của chất phân tìch vào trong nền mẫu thực. Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tìch phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát. Độ thu hồi R% được tình như sau:
100 C C C % R c m c m
Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ trong mẫu
Cc: Nồng độ chuẩn thêm
Các thông số về độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, độ lệch chuẩn tương đối tái lặp, độ thu hồi được tham chiếu với tiêu chuẩn AOAC ở các mức nồng độ tương ứng.
Độ không đảm bảo đo: tình độ không đảm bảo đo dựa trên các kết quả đạt
được khi thẩm định phương pháp độ đúng, độ chụm theo tài liệu ISO 21748:2004.
2.5. Phân tích mẫu, xử lí số liệu, đánh giá kết quả phân tích
Phương pháp sau khi đã xác nhận giá trị sử dụng, được ứng dụng phân tìch các dạng thủy ngân trong các mẫu hải sản thu thập tại các chợ, siêu thị và cửa hàng trên địa bàn thành phố Hà Nội. Xử lì kết quả phân tìch bằng các thuật tốn thống kê sử dụng phần mềm Excel, Minitab.
Hàm lượng các dạng thủy ngân trong các mẫu hải sản được so sánh với mức giới hạn ô nhiễm tối đa Maximum Limit tương ứng theo quy chuẩn hiện hành (QCVN 8-2:2011/BYT).
Đảm bảo kết quả thử nghiệm
Đường chuẩn tuyến tình xây dựng phải có hệ số xác định hồi quy R2 ≥0,995
Tiến hành rửa hệ thống sau bất kỳ mẫu nào phân tìch có hàm lượng Hg tổng cao và trước các mẫu trắng thuốc thử để đảm bảo độ nhạy của phương pháp
Trong cùng một lơ mẫu phải có ìt nhất một mẫu trắng
Cứ mỗi 10 mẫu phân tìch, phải đo lại mẫu trắng và mẫu kiểm soát chất lượng nội bộ IQC - Internal Quality Control). Nếu mẫu IQC không đạt trong khoảng 90-110%, tiến hành rửa hệ thống và dựng lại đường chuẩn trước khi tiếp tục phép phân tích.
Mẫu phân tìch lặp lại có độ chệch ≤20%, nếu lớn hơn phải thực hiện phân tìch lại
Mẫu phân tìch thêm chuẩn có hiệu suất thu hồi phải đáp ứng tiêu chì của AOAC cho mức hàm lượng tương ứng.