CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.3. Các phương pháp xác định thủy ngân hữu cơ
1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
*Nguyên lý sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC về cơ bản là một dạng sắc ký cột được cải tiến. Thay ví dung mơi đi qua pha tĩnh nhỏ giọt dưới tác dụng của trọng lực, nó bị tác động dưới áp suất cao lên tới 400 atm, điều đó làm cho q trính tách xảy ra nhanh và hiệu quả hơn nhiều. Tất cả các phương pháp sắc ký, bao gồm HPLC hoạt động theo cùng một nguyên tắc cơ bản; tách hỗn hơn chất thành các thành phần riêng rẽ do sự khác biệt về ái lực tương tác của các phân tử khác nhau đối với pha động và pha tĩnh được sử dụng trong q trính tách.
Hình 1. 4: Sơ đồ khối hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nguyên lý hoạt động được thể hiện qua hính 1.4, thiết bị HPLC bao gồm hệ thống bơm, kim bơm, cột, detector và bộ tìch hợp hoặc hệ thống thu nhận và hiển thị. Trung tâm của hệ thống là cột tách nơi quá trính tascg chất được diễn ra.
Kênh dung môi: Pha động được chứa trong các chai thủy tinh, thường là hỗn
hợp các thành phần dung môi phân cực hoặc không phân cực có nồng độ tương ứng thay đổi tùy thuộc vào chất phân tìch hoặc nền mẫu cũng như phương pháp sắc ký được lựa chọn.
Bơm: hệ thống bơm hút đưa chất phân tìch, pha động qua hệ thống cột và
detector. Tùy thuộc vào một số yếu tố bao gồm kìch thước cột, kìch thước hạt của pha tĩnh, tốc độ dòng chảy và thành phần của pha động, áp suất vận hành có thể lên tới 42000 kPa khoảng 6000 psi).
Kim bơm mẫu: Kim bơm mẫulà một mũi tiêm đơn hoặc một hệ thống tiêm tự
khoảng 0,1-100µL và đưa vào hệ thống với độ tái lập tốt và dưới áp suất cao lên đến 4000 psi).
Cột: Cột thường được làm bằng thép không gỉ, dài từ 50 đến 300 mm và có
đường kình trong từ 2 đến 5 mm. Cột sắc ký thường chứa đầy pha tĩnh với kìch thước hạt là 3-10µm. Các cột có đường kình trong nhỏ hơn 2 mm thường được gọi là cột microbore. Để vận hành tốt nhất thí nhiệt độ của pha động và cột phải được giữ khơng đổi trong q trính phân tìch.
Detector: nằm ở cuối cột phát hiện chất phân tìch khi chúng rửa giải từ cột sắc
ký. Các detector thường được sử dụng là detector quang phổ UV, huỳnh quang, detector phổ khối và detector điện hóa.
Thiết bị thu thập tín liệu: Tìn hiệu từ detector có thể được thu thập trên thiết bị
ghi biểu đồ hoặc bộ tìch hợp điện tử khác nhau về độ phức tạp và khả năng lưu trữ, xử lý tìn hiệu. Máy tình tìch hợp tìn hiệu của detector với từng chất và hiển thị, diễn dải qua sắc ký đồ.
*Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định methyl thủy ngân
Walter Holak đã sử dung phương pháp HPLC với quy trình xử lý mẫu mẫu đơn giản trên cơ sở hấp thụ nguyên tử hay dựa trên tìn hiệu điện hóa của các các dạng thủy ngân xác định methyl thủy ngân trong cá. Methyl thủy ngânđược chiết từ mẫu cá bằng các dung môi khác nhau nhưchloroform và axit clohidric. Các dạng thủy ngân sau đó được chiết xuất bằng dung dịch natri thiosunfat 0,01 N. Một phần dung dịch này được bơm vào cột ODS Zorbax và rửa giải bằng dung dịch đệm Methanol - ammonium acetate pH 5,5 có chứa 2-mercaptoethanol. Việc xác định chất phân tìch được thực hiện bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với hệ thống tạo hơi thủy ngân. Ngoài ra, có thể sử dụng detector điện hóa được trang bị điện cực giọt thủy ngân treo.[21]
1.3.4 Phương pháp khối phổ plasma cao tần cảm ứng (ICP-MS)
Khối phổ plasma cao tần cảm ứng ICP-MS là một kỹ thuật phân tìch có khả năng xác định đồng thờinhiều nguyên tố với độ chình xác cao. Phương pháp sử dụng
nguồn cao tần cảm ứng ICP với detector khối phổ để phân tìch các ion nguyên tố. Ngọn lửa plasma với nhiệt độ cao 6,000 – 10,000oC, qua đó các nguyên tử nguyên tố được ion hóa trước khi tới hệ thống khối phổ. Các ion theo tỷ lệ khối lượng/điện tìch của từng nguyên tố được tách trong hệ tứ cực, detector khối phổ với độ phân giải cao ghi nhận tìn hiệu theo số khối đặc trưng của từng nguyên tố và khuếch đại qua ống nhân quang điện.
Những ưu điểm như độ nhạy và độ chình xác cao, có khả năng định lượng các trong nên mẫu phức tạp nào như thủy hải sản, máu, huyết thanh, nước tiểu, nước, v.v.
Hình 1. 5: Sơ đồ cấu tạo hệ thống ICP-MS
Hệ thống ICP-MS bao gồm các thành phần sau:
- Hệ thống tạo sol khí: bao gồm một hệ tạo sol khì, buồng phun và bộ phẩn
bơm mẫu tự động.
- Torch ICP và cuộn AR: tạo ra ngọn lửa plasma argon, đóng vai trị là nguồn ion của ICP-MS.
-Interface: phân cách nguồn ion ICP áp suất khì quyển với máy quang phổ khối chân không cao.
- Bơm chân không: đảm bảo trạng thái chân không cao cho ion, tứ cực và
detector.
- Buồng động học: nằm trước hệ thống khối phổ, có tác dụng loại bỏ các nhiễu có thể làm giảm các giới hạn phát hiện. Có thể sử dụng hai chế độ: chế độ va chạm KED mode hoặc chế độ phản ứng (DRC mode).
- Thấu khí ion: hướng dịng ion vào tứ cực và đảm bảo rằng các nguyên tử
không mang điện và proton bị loại bỏ khỏi chùm ion.
- Hệ tứ cực: hoạt động như một bộ lọc khối để phân tách các ion theo tỷ lệ khối lượng/điện tìch của chúng m/z).
- Detector: ghi nhận và khuếch đại tìn hiệutừng ion riêng biệt.
- Bộ ghi tín hiệu và bộ điều khiển hệ thống: kiểm sốt tồn bộ hệ thống và
hiển thị dữ liệu, kết quả cuối cùng.
*Xác định thủy ngân tổng bằng phương pháp phổ khối plasma cao tần cảm ứng (ICP-MS)
Sang Hak Lee đã áp dụng phương pháp ICP-MS để xác định tổng hàm lượng thủy ngân trong cá. Phương pháp sử dụng lị vi sóng trong mơi trường HNO3/H2O2 để vơ cơ hóa mẫu. Quy trính để xác định tổng hàm lượng thủy ngân trong mẫu mô cá ngừ bằng ID-ICP-MS như sau: mẫu CRM được thêm chuẩn Hg, sau đó được vơ cơ hóa trong mơi trường axit. Đây là quy trính đơn giản, thời gian phân tìch ngắn, độ chình xác của phương pháp được kiểm chứng qua mẫu cá ngừ CCQM-P39 do IRMM Viện nghiên cứu và đo lường, GEEL, Bỉ cung cấp cho hoạt động đánh giá liên phịng quốc tế.[42]
Nhóm nghiên cứu Ramaswamiđã đưa ra quy trính đơn giản và có độ nhạy cao đối với thủy ngân tổng trong máu và nước tiểu bằng phương pháp quang phổ khối plasma cao tần cảm ứng (ICP-MS . Mẫu bệnh phẩm được chiết trong môi trường axit clohydric 50% (v/v có chứa EDTA và cysteine, ly tâm và được lọc qua cột fritended; dịch lọc được phân tìch trực tiếp bởi ICP-MS. Phương pháp có khoảng tuyến tính rộng từ 2-200 µg/L, giới hạn phát hiện của phương pháp trong mẫu thực(MDL) từ 0,2µg/L. Hàm lượng (µg/L) thủy ngân tổngtrong các mẫu như: máu (n=20)-4,6±0,6 (c.v. 12,3%), 18,3±1,1 (c.v. 6,1%), 56,4±2,8 (c.v. 5,0% ; huyết tương (n = 15) -5,7±1,0 (c.v. 16,8%), 19,7±2,7 (c.v. 13,5%) và 50,1±6,9 c.v. 13,7% ; nước tiểu n = 20 -9,3 ± 1,2 (c.v. 12,9%), 29,6±2,2 c.v. 7,4% . Độ thu hồi thủy ngân hữu cơ và vô cơ từ các mẫu
máu dao động từ 91,6% đến 110,2% cho thấy phương pháp này phù hợp để phân tìch thủy ngân cũng như các dạng vơ cơ hay hữu cơ trong máu và nước tiểu. [30]
1.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phép đo khối phổ plasma cao tần cảm ứng (HPLC-ICP-MS)
HPLC-ICP-MS là hệ thống có sự ghép nối giữa hai hợp phần riêng biệt là hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao và hệ thống khối phổ plasma cao tần cảm ứng. Về nguyên tắc của phương pháp, chất phân tìch được tách trên cột sắc ký, nơi quan trọng nhất trong hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao trước khi được định tình và định lượng bởi hệ thống khối phổ plasma cao tần cảm ứng ICP-MS), các ion được định lượng theo nguyên tắc tỷ lệ khối lượng/điện tìch.
Dưới đây là hính ảnh hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được ghép nối với phép đo khối phổ plasma cao tần cảm ứng.
Hình 1. 6: Sơ đồ khối hệ thống HPLC-ICP-MS
Sự kết nối giữa hai hệ thống HPLC và ICP-MS mang lại khả năng phân tách cao, độ đặc hiệu của sắc ký lỏng và độ nhạy rất cao của phương pháp khối phổ plasma cao tần cảm ứng. Do đó, phương pháp này đã được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu xác định các dạng kim loại nặng.
*Xác định các dạng thủy ngânbằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
được ghép nối với phép đo khối phổ plasma cao tần cảm ứng (HPLC-ICP-MS)
Năm 2014, Koplìk R., Klimešová I., Mališová K., Oto Mestek đã ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo ghép nối với hệ thống khối phổ plasma cao tần cảm ứng (LC-ICP-MS) xác định hàm lượng các dạng thủy ngân trong mẫu thực phẩm.
Trong nghiên cứu, tác giả sử dụng cột sắc ký ngn Purospherđ RP-8e, 75ì4 mm,3 Pha với pha động chứa 0,02 mol CH3COONH4 0,2% (v / v) 2-Mercaptoethanol (2- ME) + 1% (v / v) CH3OH. Mẫu được chiết lặp lại bằng axit clohydric/dung dịch 2- Mercaptoethanol (1 mol/l HCl + 0,2% (v/v) 2-Mercaptoethanol cho hiệu quả tốt với hầu hết các nền mẫu thực phẩm cá, động vật có vỏ, nguyên liệu thực vật . Để phân tìch nền mẫu có hàm lượng protein cao, chủ yếu chứa dạng thủy ngân vô cơ, nên tác giả sử dụng quy trính thủy phân một phần bằng axit clohydric. Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) đối với methyl thủy ngân và thủy ngân vô cơ tương ứng là 0,3 và 2 ng/g. Nhóm tác giả đã xác định các dạng thủy ngân trong nhiều nền mẫu khác nhau như: cá, rau, thảo mộc và các sản phẩm ngũ cốc. [16]
Năm 2009, tác giả Haiting Chenđã đưa ra quy trính xác định các dạng thủy ngân như sau: Các chất phân tìch được tạo phức với natri diethyldithiocarbamate (DDTC) và được làm giàu bởi chất hoạt động bề mặt khơng ion Triton X-114. Thời gian phân tìch các dạng thủy ngân là tương đối ngắn khoảng 6 phút. Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) lần lượt là 4 và 10 ng/L đối với Hg2+ và MeHg+ . Nghiên cứu phát triển được áp dụng thành công để xác định lượng vết các dạng thủy ngân trong các mẫu môi trường và sinh học. [20]
Tác giả Jairo L.Rodriguesđã xác định methyl thủy ngân và thủy ngân vô cơ trong máu bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với phép đo khối phổ plasma cao tần cảm ứng (LC-ICP-MS qua đó quy trính xử lý mẫu nhanh và có độ chình xác cao. Trước khi phân tìch, máu 250µL được cân chình xác vào các ống ly tâm 15 ml. Sau đó, mẫu được chiết bằng dung dịch chứa mercaptoethanol, L-cysteine và HCl,quá trình chiết diễn ra trong khoảng 15 phút. Thời gian phân tìch các dạng thủy ngân tương đối ngắn khoảng 5 phút trên một mẫu phân tìch. Tác giả sử dụng cột pha đảo C18 với pha động có chứa 0,05% v/v) mercaptoethanol, 0,4% (m/v) L-cysteine, 0,06 mol/L ammonium acetate và 5% (v/v metanol. Giới hạn phát hiện phương pháp lần lượt là 0,25µg/L và 0,1 µg/L đối với thủy ngân vơ cơ và methyl thủy ngân. Độ chình xác của
phương pháp được so sánh trên mẫu chuẩn tham chiếu SRM 966 kim loại nặng trong máu, mẫu được cung cấp bởi Viện tiêu chuẩn và công nghệ quốc gia NIST).Ưu điểm của phương pháp này là thời gian xử lý mẫu trước khi phân tìch trên LC-ICP-MS đã giảm đáng kể. [24]
Nhìn chung, phương pháp LC-ICP-MS là một phương pháp mới tuy nhiên với nhưng ưu điểm như giới hạn phát hiện thấp, độ ổn định, chình xác cao, xử lý mẫu đơn giản và giảm thiểu ảnh hưởng của các nền mẫu phức tạp, thí đây là một phương pháp có tiềm năng rất lớn trong phân tìch dạng kim loại. Do đó, luận văn này đã ưu tiên lựa chọn và nghiên cứu quy trính phân tìch dựa trên phương pháp LC-ICP-MS để xác định hàm lượng các dạng thủy ngân trong một số loài hải sản.