Thông số kiểm tra Cường độ tiêu chuẩn Cường độ thực tế
Be9 > 2000 2939 In115 >40000 45320 U238 ˃ 30000 67840 Background 220 ≤ 1 0,23 CeO156/Ce140 ≤ 0,025 0,021 Ce++70/ Ce140 ≤ 0,03 0,002
Trong đó, độ nhạy của thiết bị phải đáp ứng được cường độ của nguyên tố Indium, tỉ lệ CeO/Ce và Ce++/Ce. Cường độ thực tế của các thông số trên sau mỗi lần kiểm tra hằng ngày có thể thay đổi, nhưng vẫn phải đạt được theo tiêu chuẩn kiểm tra của hãng để đảm bảo độ ổn định, độ nhạy của thiết bị. Ví vậy, việc vệ sinh thường xuyên các hệ cone (Sampler cone, Skimmercone , bộ ICP-Plasma torch, thay thế các đường dẫn mẫu của bơm nhu động, cũng như bảo dưỡng định kỳ thiết bị là cần thiết và phải được kiểm tra hàng ngày.
3.2. Tối ƣu các điều kiện cho hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Hệ thống sắc ký HPLC trong nghiên cứu đóng vai trị chía khóa để tách các dạng thủy ngân trước khi đưa tới hệ thống ICP-MS để định lượng. Các dạng thủy ngân trong mẫu sau khi được chiết tách khỏi nền mẫu và đưa lên cột sắc ký, tại đây các dạng được tách dựa trên tình chất, kìch thước phân tử, ái lực của chúng đối với pha động và pha tĩnh. Những yếu tố quan trọng trong quá trính tách trên HPLC như thời gian lưu, độ phân giải các chất, cường độ tìn hiệu chất phân tìch đã được nghiên cứu trong đề tài này. Trong tự nhiên methyl thủy ngân chiếm tỉ lệ rất cao lên tới > 90% tổng hàm lượng thủy ngân hữu cơ, đứng thứ 2 là ethyl thủy ngân là sản phẩm phụ của q trính chuyển
hóa, ngồi ra ethyl thủy ngân là chất có độ phân cực nhỏ hơn nhiều so với 2 dạng cịn lại nên sẽ có thời gian lưu giữ trên cột C18 lâu hơn nhiều. Do đó, nhóm nghiên cứu đã khảo sát sơ bộ với hỗn hợp 2 dạng thủy ngân tồn tại chủ yếu trong nền mẫu thực tế là Hg2+ và MeHg trong điều kiện pha động có chứa CH3COONH4 20mM, 2- Mercaptoethanol 0,1% [33,46,52]. Khảo sát sơ bộ được thể hiện qua hính 3.1
Hình 3. 1: Kết quả khảo sát của Hg2+, MeHg
Kết quả cho thấy,Hg2+ và MeHg có thời gian lưu khá tương đồng. Qua đó các khảo tiếp theo tập trung chủ yếu tới độ phân giải, tìn hiệu của 2 dạng đó là Hg2+ và MeHg để rút ngắn thời gian khảo sát mà vẫn đảm bảo được các yêu cầu phân tìch.Các khảo sát tiếp theo được thực hiện xoay quanh việc nâng cao được tìn hiệu và độ phân giải của Hg2+ và MeHg nhằm đảm bảo được tình ứng dụng, khả năng đánh giá trên nền mẫu nhưng vẫn đảm bảo được tình khoa học.
3.2.1.Khảo sát dung môi hữu cơ trong pha động
Để tách Hg2+ và MeHg, nhóm nghiên cứu đã sử dụng sắc ký pha đảo với cột C18 (5µm, 150mm x4,6 mm , pha động có chứa CH3COONH4 20mM, 2-Mercaptoethanol 0,1%. Ngồi ra, dung mơi hữu cơ là một trong những yếu tố quan trọng để phân tách sắc ký lỏng, cũng như tăng tìn hiệu của chất phân tích trong phương pháp ICP.Nghiên cứu đã khảo sát sự ảnh hưởng của hai dung môi hữu cơ khác nhau MeOH 2%, Isopropanol 2%). Các kết quả được thể hiện như sau:
Hình 3. 2:Sắc ký đồ hỗn hợp Hg2+ 5ppb, MeHg 10ppb sử dụng MeOH 2%
Hình 3. 3: Sắc ký đồ hỗn hợp Hg2+ 5ppb, MeHg 10ppb sử dụng ISP 2%.
Từ sắc ký đồ ở các hính 3.2-3.3 cho thấy, khi có mặt dung mơi hữu cơ, thời gian rửa giải các chất phân tìch ra sớm hơn, có sự phân tách tốt giữa Hg2+ và MeHg.
Trong pha động sử dụng MeOH có nồng độ 2%, thời gian lưu đã được rút ngắn hơn so với khi khơng có mặt dung mơi hữu cơ nhưng tổng thời gian phân tìch cịn khá dài. Trong khi đó, khi sử dụng Isopropanol 2% vẫn cho độ phân giải tốt giữa các chất phân tìch với thời gian phân tìch ngắn và tìn hiệu các chất phân tìch lớn hơn trong trường hợp dùng MeOH. Do đó, dung mơi Isopropanol được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2.Khảo sát nồng độ dung môi hữu cơ trong pha động
Sau khi đã chọn được dung mơi hữu cơ phù hợp, nhóm nghiên cứu đã khảo sát yếu tố ảnh hưởng lớn đến khả năng tách, thời gian lưu, tìn hiệu cũng như độ ổn định của hệ thống và của cácphép đo tiếp theo đó là nồng độ của dung mơi hữu cơ. Trong phương pháp ICP-MS nồng độ dung môi hữu cơ được khuyến cáo<5% để đảm bảo nguồn ICP hoạt động hiệu quả, do đó nồng độ Ispropanol được nghiên cứu trong khoảng 1-5%.
Hình 3. 4:Sắc ký đồ của hỗn hợp Hg2+, MeHg 5ppb sử dụng pha động với Isp 1%
Hình 3. 6: Sắc ký đồ của hỗn hợp Hg2+, MeHg 5ppb sử dụng pha động với Isp 4%.
Kết quả khảo sát cho thấy, tại nồng độ IsP 4% hính 3.6), Hg2+ và MeHg được rửa giải hồn toàn ra khỏi cột trong 10 phút, đồng thời các chất có độ phân giải tốt, đáp ứng u cầu phân tìch định lượng. Ví vậy nồng độ IsP 4% được giữ cố định cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3.Khảo sát tốc độ dòng pha động
Sau khi cố định thành phần pha động, yếu tố liên quan trực tiếp tới thời gian lưu và độ phân giải của các chất phân tìch được nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát tiếp theo là tốc độ pha động. Khảo sát được tiến hành đồng thời với cả 3 dạng thủy ngân. Tốc độ pha động phải đảm bảo không quá nhỏ giúp giảm thời gian phân tìch nhưng khơng nên vượt q 1,0mL/phút để giữ ổn định áp suất cho cột và hệ thống bơm. Do đó tốc độ dịng được thay đổi từ 0,7-1,0mL/phút trong các phép đo khảo sát. Kết quả được thể hiện trong các hình 3.7-3.10.
Hình 3. 8 : Sắc ký đồ phân tích hỗn hợp 3 chất với tốc độ dịng 0,8ml/phút
Hình 3. 9:Sắc ký đồ phân tích hỗn hợp 3 chất với tốc độ dịng 0,9ml/phút
Có thể thấy mối quan hệ tương quan giữa tốc độ dòng và thời gian lưu của các chất, khi tốc độ dòng được thay đổi từ 0,7 – 1,0mL/phút với bước nhảy của mỗi khảo sát là 0,1mL/phút cho thấy thời gian lưu được rút ngắn qua từng khảo sát. Tuy nhiên để đảm bảo tình ổn định của cột và hệ thiết bị, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn tốc độ dòng là 0,9mL/phút và giữ cố định cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.2.4.Khảo sát nồng độ 2-Mercaptoethanol trong thành phần pha động
Một thành phần khác trong pha động cũng rất quan trọng đó là chất tạo cặp 2- Mercaptoethanol. Các dạng thủy ngân là những hợp chất có độ phân cực rất lớn, ái lực với cột C18 rất nhỏ do đó muốn phân tìch bằng sắc ký pha đảo cần sử dụng thêm chất tạo cặp trong pha động giúp tăng khả năng tương tác của từng chất phân tìch nhờ đó các chất được tách dễ dàng trên cột. Trong nghiên cứu này nhóm nghiên cứu khảo sát các nồng độ khác nhau của 2-Mercaptoethanol: 0,05%, 0,10%, 0,20%. Kết quả được thể hiện qua hình 3.11-3.13:
Hình 3. 12:Khảo sát nồng độ2-Mercaptoethanol trong pha động, nồng độ 0,1%
Hình 3. 13: Khảo sát nồng độ2-Mercaptoethanol trong pha động, nồng độ 0,2%
Kết quả cho thấy, khi nồng độ chất tạo cặp 2-ME tăng lên, tín hiệu chất phân tìch cũng như độ phân giải của các chất phân tìch tăng nhưng khơng nhiều. Dung mơi 2-ME có khả năng bay hơi mạnh, mùi khó chịu, có thể ảnh hưởng tới sức khỏe người sử dụng. Do đó, nồng độ của 2-ME 0,10% được lựa chọn phù hợp cho các khảo sát tiếp theo.
*Điều kiện tối ưu trên hệ thiết bị HPLC-ICP-MS
Qua quá trính khảo sát và tối ưu, điều kiện phân tìch trên hệ thiết bị HPLC-ICP- MS Nexion 350X của hãng Perkin Elmer được tổng hợp trong bảng 3.4
Bảng 3. 4: Các điều kiện tối ưu phân tích dạng Thủy ngân
LC
Cột C18 (5µm, 150 x 4,6 mm)
Pha động
20mmol/l ammonium acetate + 0,1% (v/v) 2- Mercaptoethanolcaptoethanol + 4%(v/v) isopropanol Thể tìch tiêm mẫu 20µl Tốc độ pha động 0,9 ml/phút ICP-MS Công suất RF 1250 W Tốc độ khì nebulizer 0,8 ml/phút Đồng vị 202Hg Lặp lại 1
Thời gian ghi 20phút
Dịng khì phụ trợ 1,4 ml/phút
Khí plasma 19 L/phút
3.3. Điều kiện xử lý mẫu
Các mẫu hải sản nói chung có hàm lượng protein khá cao, axit hydrochloric với nồng độ thìch hợp 1 mol/L [2, 9, 13] được sử dụng để phá hủy mẫu, nhằm chiết được hoàn toàn các dạng thủy ngân. Các điều kiện cần khảo sát để đạt được hiệu quả xử lý mẫu tốt nhất gồm: nhiệt độ và thời gian chiết, tỷ lệ 2-ME trong dung mơi chiết.
Theo đó quy trính ban đầu được đưa ra để tiến hành khảo sát như sau:
Sơ đồ 1: Quy trình xử lý mẫu dự kiến
3.3.1.Khảo sát nhiệt độ chiết
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới quá trính xử lý mẫu, trong quá trính chiết nhiệt độ quá thấp sẽ làm giảm hiệu suất chiết, chất phân tìch khơng được tách hoàn toàn ra khỏi nền mẫu, gây sai số cho phương pháp. Tuy nhiên, thủy ngân là kim loại dễ bay hơi và các dạng thủy ngân hữu cơ cũng kém bền, có thể chuyển về dạng vơ cơ ở nhiệt độ cao, do đó khoảng nhiệt độ khảo sát không nên quá cao. Trong nghiên cứu này, nhiệt độ khảo sát thay đổi trong khoảng 50†80oC, với giá trị bước khảo sát là 10oC. Kết quả khảo sát được thể hiện trong hình 3.15.
Cân 2,5gam mẫu
Thêm 1ml axit clohydric 37%, 0,1ml 2- Mercaptoethanol và 10ml nước deion
Rung siêu âm trong 30 phút ở 600C
Ly tâm với tốc độ 6000 vịng/phút trong 5 phút, lọc LC-ICP-MS
Hình 3. 15:Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ thu hồi của MeHg
Kết quả khảo sát cho thấy, hàm lượng của chất phân tìch tăng lên khi nhiệt độ tăng từ 50oC đến 60oC. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng lên 70oC, 80oC thì hàm lượng MeHg có xu hướng giảm đáng kể. Do đó, nhiệt độ chiết mẫu 60oC được lựa chọn. Do đó nhiệt độ chiết mẫu được chọn là 60oC cho khảo sát tiếp theo.
3.3.2.Ảnh hưởng của thời gian chiết
Một điều kiện khác cũng được khảo sát để có được điều kiện tốt nhất cho q trính chiết là thời gian chiết. Thời gian chiết được nghiên cứu là 20, 30, 40, 50 và 60 phút. Kết quả khảo sát được thể hiện trong hình 3.16.
Kết quả cho thấy, khi nhiệt độ tăng từ 20đến 40 phút, hàm lượng MeHg tăng và đạt mức tối đa tại 40 phút sau đó khơng có sự thay đổi đáng kể khi tăng thời gian chiết. Do đó, thời gian chiết 40phút được lựa chọn là điều kiện chiết tối ưu cho quy trính xử lý mẫu.
3.3.3.Ảnh hưởng của 2-Mercaptoethanol
Trong q trình chiết, dung mơi được chọn có chứa 2-Mercaptoethanol, hợp chất có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chiết. Do đó, nồng độ của 2-Mercaptoethanol đã được nghiên cứu thông qua đánh giá độ thu hồi của methyl thủy ngân, kết quả được thể hiện trong hình 3.17.
Hình 3. 17: Ảnh hưởng của nồng độ 2-Mercaptoethanol trong quá trình chiết
Kết quả cho thấy các giá trị thu được của chất phân tìch đại diện là MeHg tăng nhanh khi tăng nồng độ 2-ME từ 0 đến 0,2%, tuy nhiên khơng có thay đổi đáng kể của MeHg khi nồng độ 2-ME thay đổi từ 0,2 đến 0,4%. Điều này cho thấy lượng methyl thủy ngân đã được chiết hoàn toàn. Hơn nữa, 2-Mercaptoethanol có mùi khó chịu, bay hơi nhanh và rất độc đối với sức khỏe. Do đó, 0,2% 2-Mercaptoethanol là nồng độ tối ưu nhất trong khảo sát.
Bảng 3. 5: Các yếu tố ảnh hưởng và điều kiện đã tối ưu
Yếu tố ảnh hƣởng Điều kiện tối ƣu
Dung môi hữu cơ trong pha động Isopropanol 4% (v/v)
Tốc độ dòng pha động 0,9 mL/phút
Nhiệt độ chiết 60oC
Thời gian chiết 40 phút
Nồng độ 2-Mercaptoethanol 0,2%
Áp dụng cácđiều kiện tối ưu, quy trính xử lý mẫu áp dụng với nền mẫu hải sản như sau:
Sơ đồ 2. Quy trính xử lì mẫu tối ưu
3.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp
3.4.1 Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu của phương pháp được xác định bằng cách phân tìch mẫu trắng 10 lần, mẫu thêm chuẩn ở cùng nồng độ.Kết quả phân tìch được thể hiện qua sắc ký đồ hình 3.18.
Cân 2,5gam mẫu
Thêm 1ml axit clohydric 37%, 0,1ml 2- Mercaptoethanol và 10ml nước deion
Rung siêu âm trong 40 phút ở 600C
Ly tâm, định mức 50ml và lọc qua màng 0,45µm LC-ICP-MS
Hình 3. 18: Sắc ký đồ phân tích lần lượt các mẫu Blank, thêm chuẩn của Hg2+,MeHg, EtHg, hỗn hợp 3 chất
Kết quả cho thấy mẫu trắng không xuất hiện pic sắc ký tại thời gian lưu như trong các mẫu thêm chuẩn, mẫu thêm chuẩn của các chất phân tìch có thời gian lưu trùng với từng chất trong hỗn hợp chuẩn 3 chất phân tìch cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao.
3.4.2 Đường chuẩn
Xây dựng đường chuẩn làm việc bằng cách phân tích dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 1; 2,5; 5; 10; 20 ng/ml đối với Hg2+ và MeHg, dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 2,5; 5; 10; 20; 40 ng/ml đối với EtHg. Đường chuẩn xây dựng
biểu diễn sự phụ thuộc của tỉ lệ cường độ tìn hiệu chất phân tìch vào nồng độ chất phân tìch trong các dung dịch chuẩn. Kết quả thể hiện qua bảng 3.6 và hính 3.19-3.20.
Bảng 3. 6: Mối tương quan giữa nồng độ và cường độ tín hiệu (Cps) của MeHg
Nồng độ chuẩn (ng/ml) Diện tìch pic Hg2+ (cps) Diện tích pic MeHg (cps) Diện tìch pic EtHg (cps) 1 2851 3047 2,5 6023 2,5 7103 7569 5 13087 5 14249 14946 10 26224 10 28471 30044 20 54840 20 56942 60184 40 104281
Hình 3. 19: Đường chuẩn định lượng MeHg
y = 3007,x - 1,970 R² = 1 T ín h iệu (Cp s) Nồng độ (ppb)
Hình 3. 20:Đường chuẩn định lượng Hg2+
Hình 3. 21: Đường chuẩn định lượng EtHg
Phương trính đường chuẩn và hệ số hồi quy tuyến tình đã được tình tốn và thể hiện trong bảng 3.7
Bảng 3. 7: Phương trình đường chuẩn
Chất phân tích Phƣơng trình đƣờng chuẩn
Y = a + bx Hệ số tƣơng quan MeHg y = - 1,970 + 3007,x 1,000 EtHg y = 195,7 + 2625,x 0,999 Hg2+ y = 0,068 + 2847,x 1,000 y = 2847.2x + 0.0689 R² = 1 T ín h iệu (Cp s) Nồng độ (ppb) Đường chuẩn Hg y = 2625.5x + 195.73 R² = 0.9991 T ín h iệu (cps) Nồng độ (ppb)
Với các kết quả thu được, hệ số xác định thể hiện sự phụ thuộc của diện tìch pic vào nồng độ chất phân tìch là tốt cho thấy hồn tồn có thể áp dụng định lượng chất phân tìch trong nền mẫu (R2≥ 0,9999).
Đường chuẩn làm việc của các chất phân tìch đều có hệ số xác địnhR2 ˃0,999, và độ chệch ˂15% tại mức 1ppb, là đáp ứng tốt yêu cầu về định lượng. Khoảng làm việc của đường chuẩn 1-40ppb là đáp ứng được hầu hết nồng độ của chất phân tìch trong đối tượng mẫu nghiên cứu. Với những mẫu có hàm lượng cao hơn cần pha lỗng để thu được tìn hiệu đo các chất phân tìch trong khoảng làm việc, tránh nhiễm bẩn hệ thống. Đường chuẩn làm việc được xây dựng mới hằng ngày trước khi phân tìch.
3.4.3 Giới hạn phát hiện phương pháp (MDL), giới hạn định lượng phương pháp (MQL) (MQL)
Để xác định MDL, phân tìch lặp lại ìt nhất 4 lần mẫu trắng có bổ sung MeHg, EtHg, Hg2+ ở nồng độ thấp hơn giới hạn thấp nhất trong đường chuẩn. xác định nồng độ thấp nhất mà tại đó tỷ lệ tìn hiệu/nhiễu bằng 3 S/N = 3).