Sự kết nối giữa hai hệ thống HPLC và ICP-MS mang lại khả năng phân tách cao, độ đặc hiệu của sắc ký lỏng và độ nhạy rất cao của phương pháp khối phổ plasma cao tần cảm ứng. Do đó, phương pháp này đã được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu xác định các dạng kim loại nặng.
*Xác định các dạng thủy ngânbằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
được ghép nối với phép đo khối phổ plasma cao tần cảm ứng (HPLC-ICP-MS)
Năm 2014, Koplìk R., Klimešová I., Mališová K., Oto Mestek đã ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo ghép nối với hệ thống khối phổ plasma cao tần cảm ứng (LC-ICP-MS) xác định hàm lượng các dạng thủy ngân trong mẫu thực phẩm.
Trong nghiên cứu, tác giả sử dụng cột sắc ký ngn Purospherđ RP-8e, 75ì4 mm,3 Pha với pha động chứa 0,02 mol CH3COONH4 0,2% (v / v) 2-Mercaptoethanol (2- ME) + 1% (v / v) CH3OH. Mẫu được chiết lặp lại bằng axit clohydric/dung dịch 2- Mercaptoethanol (1 mol/l HCl + 0,2% (v/v) 2-Mercaptoethanol cho hiệu quả tốt với hầu hết các nền mẫu thực phẩm cá, động vật có vỏ, nguyên liệu thực vật . Để phân tìch nền mẫu có hàm lượng protein cao, chủ yếu chứa dạng thủy ngân vơ cơ, nên tác giả sử dụng quy trính thủy phân một phần bằng axit clohydric. Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) đối với methyl thủy ngân và thủy ngân vô cơ tương ứng là 0,3 và 2 ng/g. Nhóm tác giả đã xác định các dạng thủy ngân trong nhiều nền mẫu khác nhau như: cá, rau, thảo mộc và các sản phẩm ngũ cốc. [16]
Năm 2009, tác giả Haiting Chenđã đưa ra quy trính xác định các dạng thủy ngân như sau: Các chất phân tìch được tạo phức với natri diethyldithiocarbamate (DDTC) và được làm giàu bởi chất hoạt động bề mặt không ion Triton X-114. Thời gian phân tìch các dạng thủy ngân là tương đối ngắn khoảng 6 phút. Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) lần lượt là 4 và 10 ng/L đối với Hg2+ và MeHg+ . Nghiên cứu phát triển được áp dụng thành công để xác định lượng vết các dạng thủy ngân trong các mẫu môi trường và sinh học. [20]
Tác giả Jairo L.Rodriguesđã xác định methyl thủy ngân và thủy ngân vô cơ trong máu bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với phép đo khối phổ plasma cao tần cảm ứng (LC-ICP-MS qua đó quy trính xử lý mẫu nhanh và có độ chình xác cao. Trước khi phân tìch, máu 250µL được cân chình xác vào các ống ly tâm 15 ml. Sau đó, mẫu được chiết bằng dung dịch chứa mercaptoethanol, L-cysteine và HCl,quá trình chiết diễn ra trong khoảng 15 phút. Thời gian phân tìch các dạng thủy ngân tương đối ngắn khoảng 5 phút trên một mẫu phân tìch. Tác giả sử dụng cột pha đảo C18 với pha động có chứa 0,05% v/v) mercaptoethanol, 0,4% (m/v) L-cysteine, 0,06 mol/L ammonium acetate và 5% (v/v metanol. Giới hạn phát hiện phương pháp lần lượt là 0,25µg/L và 0,1 µg/L đối với thủy ngân vơ cơ và methyl thủy ngân. Độ chình xác của
phương pháp được so sánh trên mẫu chuẩn tham chiếu SRM 966 kim loại nặng trong máu, mẫu được cung cấp bởi Viện tiêu chuẩn và công nghệ quốc gia NIST).Ưu điểm của phương pháp này là thời gian xử lý mẫu trước khi phân tìch trên LC-ICP-MS đã giảm đáng kể. [24]
Nhìn chung, phương pháp LC-ICP-MS là một phương pháp mới tuy nhiên với nhưng ưu điểm như giới hạn phát hiện thấp, độ ổn định, chình xác cao, xử lý mẫu đơn giản và giảm thiểu ảnh hưởng của các nền mẫu phức tạp, thí đây là một phương pháp có tiềm năng rất lớn trong phân tìch dạng kim loại. Do đó, luận văn này đã ưu tiên lựa chọn và nghiên cứu quy trính phân tìch dựa trên phương pháp LC-ICP-MS để xác định hàm lượng các dạng thủy ngân trong một số loài hải sản.
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1.Mục tiêu nghiên cứu 2.1.Mục tiêu nghiên cứu
Tối ưu quy trính phân tìch xác định hàm lượng đồng thời 3 dạng thủy ngân (thủy ngân vô cơ, methyl thủy ngân, ethyl thủy ngân) trong một số loài hải sản bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với phép đo khối phổ plasma cao tần cảm ứng LC-ICP-MS).
Ứng dụng phương phápLC-ICP-MS đã xây dựng để phân tìch một số lồi hải sản trên thị trường, nhằm bước đầu đánh giá mức độ ô nhiễm.
2.2. Đối tƣợng, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu được sử dụng trong nghiên cứu này là các mẫu hải sản, động vật thủy sinh được thu thập trên thị trường để nghiên cứu và đánh giá mức độ ô nhiễm.
2.2.2.Nội dung nghiên cứu
Tối ưu các điều kiện phân tìch đồng thời 3 dạng thủy ngân thủy ngân vô cơ, methyl thủy ngân, ethyl thủy ngân bằng LC-ICP-MS bao gồm: tối ưu các thành phần pha động, tốc độ dòng... trên hệ thống HPLC, tối ưu tốc độ khì va chạm, tối ưu tự động các thông số thiết bị trên hệ thống ICP-MS.
Nghiên cứu quy trính xử lì mẫu bằng phương pháp chiết có sử dụng bể rung siêu âm, tối ưu các thông số như thời gian, nhiệt độ chiết, thành phần dung môi chiết.
Thẩm định xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tìch: giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đường chuẩn, độ lặp lại, độ tái lặp, độ thu hồi, độ không đảm bảo đo.
Phân tìch, đánh giá, biện luận kết quả thu được với các mẫu nghiên cứu và mẫu đối chứng dựa trên việc so sánh và tham chiếu với các quy chuẩn kỹ thuật hiện nay
Đưa ra kết luận ban đầu về mức độ ô nhiễm thủy ngân trong các mẫu hải sản được nghiên cứu.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu
Dựa trên cáctài liệu tham khảo [1,2,6,11,15], có thể thấy hướng nghiên cứu ô nhiễm các kim loại nặng trong thực phẩm hiện nay chủ yếu dựa trên kỹ thuật ICP-MS. Phương pháp ICP – MS ra đời vào đầu những năm 80 của thế kỷ trước và ngày càng chứng tỏ là kỹ thuật phân tìch có ưu điểm vượt trội so với các kỹ thuật phân tìch khác như quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS , quang phổ phát xạ plasma cảm ứng ICP- AES hay ICP-OES …nhờ có độ nhạy, độ lặp lại, độ chình xác cao, và xác định đồng thời được hàng loạt các kim loại trong thời gian phân tìch ngắn. Hơn nữa,khi kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng caovới hiệu quả tách tốt, sự ổn định vào chình xác cao rất phù hợp để ứng dụng phân tìch các dạng tồn tại của kim loại nặng nói chung và dạng thủy ngân nói riêng.
Căn cứ vào điều kiện thực tế của phịng thì nghiệm, nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật LC-ICP-MS, kết hợp phương pháp lấy mẫu, chiết mẫu bằng bể rung siêu âm, nhằm phân tìch, đánh giá mức độ ơ nhiễm của một số loài hải sản trên thị trường
2.3. Thực nghiệm
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất *Thiết bị, dụng cụ *Thiết bị, dụng cụ
+ Thiết bị:
Hệ thống HPLC-ICP-MS Nexion 350X (Perkin Elmer) sử dụng trong nghiên cứu này được trang bị có cả ba chế độ đo chuẩn, va chạm, và động học phản ứng. Nghiên cứu sử dụng cột tách C18 5µm, 150 x 4,6 mm và hệ thống bơm mẫu tự động dùng để đưa mẫu vào bộ phận tạo sol khì hình 2.1).
Hình 2. 1: Hệ thống ICP-MS Nexion 350X (Perkin Elmer)
Bể rung siêu âm Elmer được dùng để chiết các dạng thủy ngân từ nền mẫu. Các mẫu được đồng nhất bằng máy xay mẫu Philips , sau đó được cân bằng cân phân tìch Mettler Toledo có độ chình xác đến 0,0001 g.
*Dụng cụ:
Sử dụng các ống ly tâm loại 15ml, 50ml Falcon để chứa đựng dung dịch mẫu. Màng lọc mẫu 0,45µm Minisart được dùng để lọc mẫu trước khi phân tìch. Các micropipette và đầu tip (Eppendorf) được sử dụng để hút các thể tìch hóa chất chình xác và pha chuẩn. Ngồi ra, các dụng cụ thơng thường khác của phịng thì nghiệm như bộ chia hóa chất tự động Dispenser , bính định mức các loại 25; 50; 100ml IsoLab , giấy lọc băng xanh, túi đựng mẫu các loại cũng được sử dụng.
*Hóa chất
Trong nghiên cứu này, chuẩn được sử dụng làchuẩn đơn Hg2+ 1000 ppm (Merck), MeHg (Sigma-Aldrich,> 99,8%), EtHg (TRC, > 99.9%), axit HCl 37% (Merck),mẫu chuẩn chứng nhận DORM-4 (Canada).Các dung dịch Methanol (MeOH), Isopropanol (IsP), 2-Mercaptoethanol (2-ME) độ tinh khiết > 99,9%, Sigma , muối Amonium acetate (Merck, > 99%). Nước được sử dụng là deion. Khí argon có độ tinh
khiết 99,999% Messer . Ngoài ra các dung dịch chuẩn hóa thiết bị của hãng Perkin Elmer và dung dịch làm mát (cho Chiller cũng được sử dụng.
2.3.2. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất, chất chuẩn
Dung dịch HCl 1%: Hút chình xác 1,35 ml HCl 37% vào bính định mức 50 ml chứa một ìt nước deion. Định mức bằng nước deion và lắc đều có dung dịch đồng nhất.
*Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trung gian:
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian 1 hỗn hợp nồng độ 10ppm chứa đồng thời 3 dạng thủy ngân Hg2+, MeHg, EtHg). Hút chình xác 0,25 ml các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ 1000 ppm vào bính định mức 25 ml và định mức bằng nước deion. Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sử dụng được trong 3 tháng.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian 250 ppb từ dung dịch trung gian 1: Hút chính xác 0,625 ml dung dịch trung gian 1 vào bính định mức 25 ml và định mức bằng nước deion.
*Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc:
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 1; 2.5; 5; 10; 20ppb: hút chính xác lần lượt 0.1; 0.25; 0.5; 1 và 2 ml dung dịch chuẩn trung gian 2 vào các bìnhđịnh mức 25ml và định mức tới vạch bằng dung dịch axit HCl1%, lắc đều. Dãy dung dịch chuẩn được pha mới hằng ngày trước khi sử dụng.
*Lấy mẫu và bảo quản:
Các mẫu được thu thập, mã hóa, sau đó được đồng nhất và được bảo quản trong tủ lạnh đông sâu. Các mẫu cá được lấy từ các chợ, siêu thị, cửa hàng trên địa bàn thành phố Hà Nội.
2.3.3. Tối ưu hóa điều kiện phân tích Thủy ngân trên ICP-MS
Thủy ngân được lựa chọn số khối sao cho đồng vị của nó là phổ biến và ìt bị ảnh hưởng bởi các đa nguyên tố khác. Các yếu tố khác của thiết bị có ảnh hưởng độ nhạy của phép đo như lưu lượng khì mang, cơng suất tạo plasma, thế thấu kình ion, độ sâu
plasma,.. được tối ưu hóa tự động sử dụng dung dịch chuẩn hóa thiết bị Nexion setup solution) theo hướng dẫn vận hành thiết bị của hãng Perkin Elmer.
Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ hay được sử dụng trong phịng thì nghiệm như isopropanol, methanol cũng được nghiên cứu để làm tăng cường tìn hiệu và giảm thời gian lưu của chất phân tìch. Ngồi ra thời gian bơm, rửa mẫu cũng được khảo sát để vừa tiết kiệm được thời gian phân tìch, vừa tránh nhiễm chéo giữa các lần đo mẫu.
2.3.4.Xử lí mẫu bằng chiết siêu âm a. Xử lí sơ bộ và bảo quản mẫu a. Xử lí sơ bộ và bảo quản mẫu
Các mẫu được thu thập, mã hóa sau đó chúng được đồng nhất và được bảo quản trong đủ đơng sâu ở -200C.
b. Xử lí mẫu bằng chiết siêu âm
Cân khoảng 2,5g mẫu vào ống ly tâm 50ml, thêm 1ml axit clohydric 37%, 0,1ml 2-Mercaptoethanol và 10ml nước deion vào mỗi ống. Ống được ngâm trong bể rung siêu âm trong 30 phút tại 600C. Sau đó, để nguội, mẫu được lắc trên máy Vortex trong 2 phút trước khi hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút và định mức 50ml bằng nước deion. Cuối cùng, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45µm trước khi phân tìch trên thiết bị LC-ICP-MS.
2.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp
Phương pháp xác định đồng thời 3 dạng thủy ngân Hg2+, MeHg, EtHg) bằng HPLC-ICP-MS được thẩm định các thông số tiêu chuẩn nhằm đảm bảo độ chình xác của phép đo.
Đƣờng chuẩn: xây dựng đường chuẩn tuyến tình bằng cách đo dãy dung dịch
chuẩn có nồng độ1; 2,5; 5; 10; 20ppb và ghi nhận tìn hiệu Cps của ion Hg+. Đường chuẩn xây dựng được phải có hệ số xác định R2 ≥ 0,995, và độ chệch thỏa mãn. thường độ chệch yêu cầu ≤ 20% tại mức LOQ)
Giới hạn phát hiện phương pháp (MDL), giới hạn định lượng phương pháp (MQL):
Để xác định MDL, phân tìch lặp lại ở 6 lần mẫu trắng có bổ sung Hg2+, MeHg, EtHg ở nồng độ thấp hơn giới hạn thấp nhất trong đường chuẩn, xác định nồng độ thấp nhất mà tại đó tỷ lệ tìn hiệu/nhiễu bằng 3 S/N = 3).
Giới hạn định lượng (MQL là nồng độ thấp nhất mà tại đó chất phân tìch có thể được phát hiện một cách đáng tin cậy. Nói chung MQLđược xác định là tỷ lệ tìn hiệu/nhiễu S/N bằng 10.
Độ lặp lại:tiến hành thì nghiệm lặp lại 6 lần, do cùng một người thực hiện,
trong khoảng thời gian ngắn. Tình độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tìch. Các cơng thức tình tốn như sau:
Tiến hành thì nghiệm n lần lặp lại. + Giá trị trung bính : n 1 i i x n 1 x
Trong đó x là giá trị trung bính số học của tập hợp các giá trị xi , còn xi là giá trị kết quả của mỗi lần thì nghiệm.
+ Độ lệch chuẩn : 1 n ) x x ( SD 2 n 1 i i
+ Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại:
100 X SD RSDr
Trong nhiều mẫu thực phẩm, hàm lượng chất phân tìch có thể khơng phát hiện được trong mẫu thử nhỏ hơn giới hạn định lượng của phương pháp . Khi đó độ lặp lại có thể được tình dựa trên mẫu thêm chuẩn ở cùng mức nồng độ.
Độ tái lặp: độ tái lặp được tiến hành bằng cách thực hiện thì nghiệm trong
những điều kiện khác nhau như thời gian phân tìch, người thực hiện. Đánh giá độ lệch chuẩn tương đối tái lặp RSDR
Các thông số về độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, và độ lệch chuẩn tương đối tái lặp được tham chiếu với tiêu chuẩn AOAC ở các mức nồng độ tương ứng.
Độ thu hồi: độ thu hồi được xác định dựa trên việc thêm một lượng chất đã biết
của chất phân tìch vào trong nền mẫu thực. Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tìch phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát. Độ thu hồi R% được tình như sau:
100 C C C % R c m c m
Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ trong mẫu
Cc: Nồng độ chuẩn thêm
Các thông số về độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, độ lệch chuẩn tương đối tái lặp, độ thu hồi được tham chiếu với tiêu chuẩn AOAC ở các mức nồng độ tương ứng.
Độ khơng đảm bảo đo: tình độ không đảm bảo đo dựa trên các kết quả đạt
được khi thẩm định phương pháp độ đúng, độ chụm theo tài liệu ISO 21748:2004.
2.5. Phân tích mẫu, xử lí số liệu, đánh giá kết quả phân tích
Phương pháp sau khi đã xác nhận giá trị sử dụng, được ứng dụng phân tìch các dạng thủy ngân trong các mẫu hải sản thu thập tại các chợ, siêu thị và cửa hàng trên địa bàn thành phố Hà Nội. Xử lì kết quả phân tìch bằng các thuật tốn thống kê sử dụng phần mềm Excel, Minitab.
Hàm lượng các dạng thủy ngân trong các mẫu hải sản được so sánh với mức giới hạn ô nhiễm tối đa Maximum Limit tương ứng theo quy chuẩn hiện hành (QCVN 8-2:2011/BYT).
Đảm bảo kết quả thử nghiệm
Đường chuẩn tuyến tình xây dựng phải có hệ số xác định hồi quy R2 ≥0,995
Tiến hành rửa hệ thống sau bất kỳ mẫu nào phân tìch có hàm lượng Hg tổng cao và trước các mẫu trắng thuốc thử để đảm bảo độ nhạy của phương pháp
Trong cùng một lơ mẫu phải có ìt nhất một mẫu trắng
Cứ mỗi 10 mẫu phân tìch, phải đo lại mẫu trắng và mẫu kiểm soát chất lượng nội bộ IQC - Internal Quality Control). Nếu mẫu IQC không đạt trong khoảng 90-110%, tiến hành rửa hệ thống và dựng lại đường chuẩn trước khi tiếp tục phép phân tích.
Mẫu phân tìch lặp lại có độ chệch ≤20%, nếu lớn hơn phải thực hiện phân tìch lại
Mẫu phân tìch thêm chuẩn có hiệu suất thu hồi phải đáp ứng tiêu chì của AOAC