BÁO cáo THÍ NGHIỆM VI SINH vật THỰC PHẨM môi TRƯỜNG DINH DƯỠNG các PHƯƠNG PHÁP GIEO cấy VI SINH vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẦM ************* BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT THỰC PHẨM Mã học phần: BF3501 Sinh viên thực : Trần Thị Thu Giang MSSV : 20190442 Lớp : KTTP.02 – K64 GVHD : Đặng Minh Hiếu HÀ NỘI 2021 - 2022 Lê Ngọc Diệp_20190430 BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT I Mục đích thí nghiệm  Tìm hiểu mơi trường dinh dưỡng, loại môi trường dinh dưỡng cách tạo môi trường dinh dưỡng (môi trường Czapek)  Thực thao tác gieo cấy vi sinh vật II Nội dung thực  Phương pháp tiến hành: Cân thành phần mơi trường Hịa tan nước Lọc, điều chỉnh pH cần thiết Môi trường lỏng Môi trường đặc Bổ sung chất đông tụ Phân phối vào dụng cụ đựng Đun nông làm tan chất đông tụ Phân phối vào dụng cụ đựng Thanh trùng Để nguội Môi trường lỏng Để nghiêng Môi trường Môi trường thạch đứng thạch nghiêng Lê Ngọc Diệp_20190430 Đổ hộp petri Môi trường hộp petri            Vật liệu: Canh trường chứa vi sinh vật Bình tam giác Ống nghiệm Đĩa petri Que cấy Que trang Đèn cồn Hóa chất pha mơi trường Czapek Cân điện tử Tạo môi trường dinh dưỡng khử trùng Thành phần môi trường Czapek  Saccharose: 30g  NaNO3: 2g  KH2PO4: 1g  MgSO4.7H2O: 0.5g  KCl: 0.5g  FeSO4: 0.01g (do lượng nhỏ nên FeSO4 pha vào nước lấy thể tích tương ứng với nồng độ)  H2O: 1000ml  pH 7.3 ± 0.2  Cách tiến hành:  Cân đong xác theo đơn (chia tỷ lệ cho 250ml nước)  Cho vào bình sấy khơ 1/3 lượng nước cần thiết, hịa tan trước chất có khối lượng nhỏ chất có khối lượng lớn đến dung dịch Dùng lượng nước lại tráng rửa bình, phễu… Thể tích mơi trường nhỏ ½ thể tích dụng cụ chứa  Phân phối 50ml dung dịch lỏng vào ống nghiệm (khơng q ½ thể tích), cịn 200ml cịn lại cho 2% agar vào, đun khuấy bếp điện đến tan hồn tồn, phân phối vào ống thạch đứng (khơng q 1/3 thể tích), ống thạch nghiêng (khơng q ¼ thể tích)  Dùng nút bơng (khơng thấm nước) đậy kín  Ghi tên lên mơi trường đem tiến hành trùng Cách làm nút Lấy lượng bơng vừa đủ, gấp gọn phần rìa xung quanh vào phía bên Nhấn phần đồng thời túm gọn xung quanh lại để hình thon dài phần đầu nút phải dày Tiến hành đậy nút, ý dung lực tương đối Lê Ngọc Diệp_20190430 khơng nên ấn q mạnh làm vỡ bình, lúc ấn kết hợp với xoay để nút vào dễ dàng Nút đậy đạt u cầu rút bơng nghe tiếng kêu Tiến hành gieo cấy vi sinh vật a Dụng cụ gieo cấy  Micropipet  Que trang  Que cấy nhọn  Que cấy vòng  Que cấy móc b Các bước tiến hành gieo cấy:  Lau bề mặt xung quanh khu vưc gieo cấy bơng có tẩm cồn  Thắp đèn cồn để tạo môi trường vô trùng xung quanh, thực thao tác gieo cấy cạnh lửa đèn cồn để đảm bảo môi trường vô trùng  Trước thực cấy phải hơ que cấy lửa để sát khuẩn  Sau sát khuẩn que cấy xong tiến hành thao tác gieo cấy c Cách cấy  Cấy từ đặc sang lỏng: dung que cấy nhọn chấm vào canh trường (sau thực thao tác sát trùng thao tác cấy thực cạnh lửa đèn cồn), hơ miệng ống nghiệm đóng nắp lại Mở nắp ống chứa môi trường lỏng tiến hành chấm bề mặt, hơ miệng ơng lên lửa đóng nắp lại,  Cấy từ canh trường đặc sang môi trường đặc  Cấy ống thạch đứng: tương tự cấy từ canh trường đặc sang môi trường lỏng  Cấy ống thạch nghiêng: dung que cấy vòng a) a) cấy hình chữ chi b) cấy hình vịng xoắn c) cấy song song b) c) Lê Ngọc Diệp_20190430  Cấy hộp pettri: Cấy chấm điểm Cấy chữ chi Cấy cấy song song Vết cấy cạn dần Tạo ống thạch nghiêng - Ống thạch sau trùng có nhiệt độ cao (75-80℃) nên dạng lỏng Đặt ống lên que sắt cao khoảng 1cm cho phần ống tiếp xúc với que sắt cách miệng ống khoảng 1.5cm để yên đến đông lại Thanh trùng nồi hấp - Nguyên tắc: Dựa khả tăng nhiệt độ sôi chất lỏng áp suất tăng Người ta gia nhiệt vật nước bão hòa áp suất lớn áp suất khí Khi áp suất tăng lên nhiệt độ tăng theo Người ta khống chế nhiệt độ trùng thông qua điều khiển áp suất.   Cách vận hành nồi hấp áp lực:  Kiểm tra mức nước thiết bị thông qua mức nước ống thủy, khoảng từ 1/3 đến ½ poongas thủy Nếu thiếu phải bổ sung nước Nước thêm vào phải nước mềm nức cất, nước ngưng nước loại bỏ bớt phần cứng cách đun sôi để nguội  Đặt môi trường, vật cần trùng vào nồi cho nút hướng vào nồi Lưu ý vật liệu cần thah trùng chiếm 2/3 thể tích  Đặt chế dộ trùng  Đóng nắp thiết bị mở van xả đáy đóng cầu giao điện để gia nhiệt thiết bị  Khi thấy nước nồi sơi, nước theo van xả đáy thành luông mạnh đến phút chứng tỏ khơng khí bị loại, nồi cịn nước bão hịa đóng van xả đáy Theo dõi gia tăng áp suất nhiệt độ đông hồ áp kế  Khi kim áp kế đạt chế độ khử trùng bắt đầu tính thời gian trì chế độ suốt thời gian trùng  Sau thời gian khử trùng ngắt cầu giao điện, chờ kim áp kế trở nhiệt độ thiết bị hạ xuống khoảng 70℃ mở van xả đáy mở lắp thiết bị lấy vật liệu khử trùng  Lưu ý:  kiểm tra mức nước trước vận hành thiết bị  tuyệt đối không mở nắp thiết bị kim áp kế chưa - Ưu điểm: Nhiệt độ trùng khơng làm biến tính sản phẩm có bên trong, tốn thời gian hiệu trùng tương đối triệt để Trong phòng Lê Ngọc Diệp_20190430 thí nghiệm tường kết hợp phương pháp với phương pháp tyndal để trùng môi trường dinh dưỡng - Nhược điểm: không tiêu diệt tế bào sinh bào tử III Kết thảo luận  Tạo môi trường dinh dưỡng theo yêu cầu (môi trường Czapek)  Biết thực thao tác cấy nhiên chưa thành thạo: q trình cấy cịn gây xước bề mặt mơi trường hộp petri, đường gieo cấy ngắn nên mật độ vi sinh vật nhỏ  Cách khắc phục: thực thao tác nhiều Lê Ngọc Diệp_20190430 BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT I Mục đích thí nghiệm phương pháp nghiên cứu Mục đích thí ngiệm  Phân lập chủng sinh vật: vi sinh vật hiếu khí nước tương bần, vi khuẩn Lactobacillus mẫu men vi sinh  Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng nước muối sinh lý cho nhóm sau thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu  Sử dụng phương pháp phân lập nuôi cấy môi trường đặc  Với vi sinh vật kị khí: sử dụng phương pháp đổ thạch lớp để nuôi cấy  Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, thao tác dễ thực  Nhược điểm: Chỉ sử dụng cho vi sinh vật yếm khí khơng bắt buộc vi sinh vật chịu nhiệt độ 50-55oC II Dụng cụ thí nghiệm cách thức tiến hành Dụng cụ thí nghiệm  Mẫu vi sinh vật hiếu khí: nước tương bần  Mẫu vi sinh vật kị khí: Lactobacillus men vi sinh  11 ống Eppendorf  Nước muối sinh lý 0,9%  Bình tam giác  Pipet  Agar  hộp petri  Ống đong, cân, NaCl, môi trường MRS,TSA… Cách thức tiến hành Lê Ngọc Diệp_20190430 a Chuẩn bị môi trường dịch thạch đổ lớp cùng, pha nước muối sinh lý 0,9% * Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật kị khí: MRS Agar  Chuẩn bị bình tam giác  Cân bình 10,1g MRS 3g agar  Đổ nước cất định mức đến 150ml  Bọc kín đầu bình đem trùng phương pháp áp suất bão hòa * Chuẩn bị dịch thạch đổ  Chuẩn bị bình tam giác  Cân bình 3g agar  Đổ nước cất định mức đến 150ml  Bọc kín đầu bình đem trùng theo phương pháp áp suất bão hòa * Pha nước muối sinh lý 0,9%  Cân 13,5mg NaCl cho vào bình tam giác  Định mức đến 1500ml bọc lại đem trùng b Phân lập vi sinh vật hiếu khí  Pha loãng dung dịch mẫu  Lấy 1ml nước tương bần cho vào bình tam giác chứa sẵn 99ml nước muối sinh lý 0,9%, ta thu dung dịch pha loãng 10-2, lắc  Tiến hành pha loãng tiếp cách cho 0,9ml nước muối sinh lý vào ống Eppendorf, sau lấy 0,1 ml dung dịch từ bình tam giác cho vào ống Eppendorf sau Votex để thu dung dịch pha lỗng 10-3, đánh dấu ống Lê Ngọc Diệp_20190430  Lấy 0,1ml dung dịch từ ống pha loãng 10-3 cho vào ống Eppendorf chứa nước muối sinh lý, Votex thu dung dịch pha loãng 10-4, đánh dấu ống  Lấy 0,1ml dung dịch từ ống pha loãng 10-4 cho vào ống Eppendorf chứa nước muối sinh lý, Votex thu dung dịch pha loãng 10-5, đánh dấu ống  Lấy 0,1ml dung dịch từ ống pha loãng 10-5 cho vào ống Eppendorf chứa nước muối sinh lý, Votex thu dung dịch pha loãng 10-6, đánh dấu ống  Phân lập vi sinh vật nuôi cấy môi trường đặc  Sử dụng hộp petri vơ trùng có chứa sẵn môi trường dinh dưỡng để tiến hành nuôi cấy  Ghi nồng độ dung dịch 10-4, 10-5, 10-6 đáy hộp  Dùng pipet lấy 0,1 ml dung dịch từ ống Eppendorf 10-4 cho vào hộp petri 10-4, sau dung que chang vơ trùng để chang phần dịch mẫu vi sinh vật lên đầu khắp mặt thạch, vừa chang vừa xoay hộp petri  Sau thấy dung dịch mẫu đợc ria kháp mặt thạch để hộp petri sang bên  Làm tương tự với mẫu pha loãng 10-5, 10-6  Sau cấy xong hộp petri xong, lật ngược lại bọc kín lại giấy báo, ghi tên mẫu, nhóm ngày ni cấy lại, cho lên tủ cấy vi sinh vật, sau hôm tới xem kết nuôi cấy  Lưu ý phân lập vi sinh vật hiếu khí:  Pha lỗng dung dịch mẫu đến nồng độ định để đảm bảo lượng vi sinh vật lấy mẫu để nuôi cấy  Tất lửa trình ni cấy phải đặt gần lửa đèn cồn để vô trùng  Hộp petri cấy không cầm lên mà phải để mặt bàn, mở không mở toang Lê Ngọc Diệp_20190430  Phải đặt ngược hộp petri nuôi cấy tủ nuôi  Mẫu nước tương bần đặc nên khó lấy, cần phải cắt to phần đầu ống pipet, thao tác nhanh dứt khoát c Phân lập vi sinh vật kị khí  Pha lỗng dung dịch mẫu:  Chuẩn bị ống Eppendorf chứa 9ml nước muối sinh lý để giá  Lấy 0,1 ml dung dịch mẫu men vi sinh cho vào ống Eppendorf đầu tiên, sau Votex ta mẫu pha lỗng 10-1, đánh dấu ống  Lấy 0,1 ml dung dịch ống 10-1 cho vào ống Eppendorf, sau đem Votex ta thu mẫu ph loãng 10-2, đánh dấu ống  Tiếp tục làm đến làm xong ống pha loãng 10-7  Phân lâp vi sinh vật kị khí  Chuẩn bị hộp petri vô trùng chứa môi trường MRS  Ghi nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 vào đáy hộp petri  Lấy 0,1 ml dịch mẫu từ ống Eppendorf 10-5 cho vào hộp Petri 10-5, dùng que chang vô trùng ria dung dịch mẫu khắp mặt thạch, vừa chang vừa xoay hộp petri  Sau làm xong với hộp petri 10-5, để hộp sang bên thao tác tương tự với hộp petri 10-6 10-7  Đổ thạch lớp thạch cùng:  Mở nắp hộp petri sau đổ dịch thạh chuẩn bị sẵn, sau nghiêng hộp petri để thạch dàn khắp bề mặt hộp petri  Làm tương tự với hộp petri  Đợi thạch đông lại, sau lật ngược hộp petri, gói lại giấy, ghi tên nhóm, mẫu ngày ni cấy sau để lên tủ nuôi, đợi hôm sau đến xem kết  Lưu ý phân lập vi sinh vật kị khí  Phải thao tác thật nhanh tránh để nhiễm oxi vào 10 Lê Ngọc Diệp_20190430 III Thực hành thí nghiệm Nhuộm đơn giản Trong thí nghiệm nhuộm đơn giản ta thực nhuộm mẫu canh trường trực khuẩn cầu khuẩn B1: chuẩn bị hóa chất, canh trường khử trùng vị trí làm việc cồn Làm tiêu mẫu canh trường phiến kính để rút gọn thao tác thí nghiệm Vết bơi mẫu dàn đường kính khoảng 1cm2, khoảng cách vết bơi khoảng 1cm B2: tạo vết bôi B3: làm khô vết bôi B4: cố định vết bôi (Các thao tác làm vết bôi nêu phần sở lý thuyết 1.2) B5: nhuộm (Các thao tác nêu phần sở lý thuyết 2.1) B6: quan sát hình thái, màu sắc vi sinh vật qua kính hiển vi rút nhận xét Nhuộm gram B1: chuẩn bị hóa chất, canh trường khử trùng vị trí làm việc cồn B2: tạo vết bôi B3: làm khô vết bôi B4: cố định vết bôi (Thao tác làm tiêu nêu phần sở lý thuyết 1.2) B5: nhuộm màu (Thao tác nhuộm gram nêu phần sở lý thuyết 2.2) Thứ tự nhuộm màu Gram Gram (+) (-) Nhuộm tím tinh thể Xanh Xanh Tế bào vi khuẩn chết màng tế bào khả chọn lọc thuốc tím tím nhuộm vào tế bào àtế bào có màu thuốc nhuộm Nhuộm bổ sung lugol (I-) làm bền màu thuốc nhuộm Xanh Xanh tím tím Tẩy màu cồn Thời gian khoảng 30s Vi khuẩn gram (-) lớp Xanh Không peptidoglucan mỏng khả giữ màu màu bị tẩy tím màu màu thuốc nhuộm Nhuộm màu thức cấp (Fucshin) Xanh Hồng Do vi khuẩn gram (-) sau tẩy cồn thành khơng màu nên tiếp tím tục bắt màu thuốc nhuộm thứ cấp vi khuẩn có màu thuốc 43 Lê Ngọc Diệp_20190430 nhuộm thứ cấp B6: quan sát hình thái màu sắc vi sinh vật qua kính hiển vi IV Kết thí nghiệm Nhuộm đơn giản Hình Hình Hình 1: mẫu canh trường E3 – trực khuẩn ngắn Quan sát thấy kích thước trực khuẩn ngắn chiều rộng khoảng 1/3 đến 1/2 chiều dài Các tế bào tách rời số lượng tế bào lớn, cần giảm lượng mẫu làm tiêu dàn để tế bào tách dời Hình 2: mẫu canh trường C3 – cầu khuẩn Các tế bào có tách tương đối, nhiên số lượng tế bào lớn chồng chất lên nhau, cần giảm lượng canh trường làm tiêu dàn để tách rời tế bào Nhuộm gram 44 Lê Ngọc Diệp_20190430 Mẫu E3 Mẫu C3 Nhận xét:trực khuẩn dài, vi khuẩn gram (+), sau khí nhuộm có màu xanh tím Các tế tách dời đơi dính lại với nhiều vsv, dễ quan sát kích thước tế bào lớn, số lượng tế bào trực khuẩn dài Theo quan sát ta thấy tiêu có nhiệm tạp thao tác làm thí nghiệm chưa đúng, sử dụng que cấy lấy mẫu canh trường khác khử trùng que cấy không chuẩn ,… V Thảo luận  Các yếu tố ảnh hưởng đến kết nhuộm: - Giai đoạn tẩy màu: coi giai đoạn định - Nếu tẩy màu lâu, màu bị trôi vi khuẩn gram (+), màu cuối vi khuẩn gram (+) có màu thuốc nhuộm thứ cấp vi khuẩn gram (-) không quan sát phân biệt loại vi khuẩn qua màu nhuộm - Nếu thời gian tẩy màu ngắn, màu xanh tím vi khuẩn gram (-) chưa bị rửa trôi hết, màu cuối vi khuẩn gram (-) sau kết thúc q trình nhuộm có màu gần giống vi khuẩn gram (+) không quan sát phân biệt qua màu nhuộm - Xả nước: không xối nước trực tiếp hay xối nước mạnh để tránh rửa trơi vi sinh vật - Q trình tạo vết bơi: + Vết bơi q dày q trình nhuộm rửa xảy phía trên, lớp phía không tiếp cận 45 Lê Ngọc Diệp_20190430 + Quá trình dàn khơng tốt tế bào vi sinh vật khơng tách rời khó quan sát - Tuổi canh trường: số loài vi khuẩn bacillus hay trực khuẩn clostridium gram (+) tuổi canh trường q già có tính chất tương tự vi khuẩn gram (-) Các thao tác làm thí nghiệm ảnh hưởng nhiều đến kết 46 Lê Ngọc Diệp_20190430 Bài 9: Quan sát nấm mốc I - Mục đích thí nghiệm Quan sát đặc điểm hình thái ( hệ sợi, cuống sinh bào tử, bào tử) số lồi nấm mốc điển hình II Cơ sở lý thuyết Đặc điểm hình thái, sinh lý ứng dụng nấm mốc công nghiệp 1.1 - Đặc điểm hình thái Cấu tạo: Nấm mốc loại nấm hiển vi có cấu tạo sợi Có hai loại sợi nấm: sợi có vách ngăn (đa bào) sợi khơng vách ngăn (đơn bào) - Hình dạng: Đa số nấm mốc có hình sợi phân nhánh Khi phát triển sợi chằng chịt với làm thành hệ sợi nấm - gọi khuẩn ty thể (micelium) Một số sợi sinh trưởng cách đâm sâu vào môi trường gọi khuẩn ty chất Phần khác phát triển bề mặt chất gọi khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty chất có nhiệm vụ hút muối khống chất dinh dưỡng để ni tồn hệ sợi Khuẩn ty khí sinh có chức hơ hấp mang quan sinh sản bào tử - Kích thước: Sợi nấm có đường kính từ - 20 μm, dài cỡ cm hay 1.2 - Đặc điểm sinh lý Dinh dưỡng: Nấm mốc thuộc loại thực vật hạ đẳng khơng có diệp lục Chúng sống ký sinh hoại sinh - Hô hấp: Đa phần nấm mốc vi sinh vật hiếu khí Sinh sản: Nấm mốc sinh sản nhiều phương thức: + Sinh sản hữu tính tiếp hợp tử + Sinh sản sinh dưỡng đoạn sợi nấm + Sinh sản vơ tính hạch chủ yếu bào tử - Khả tạo bào tử: Bào tử quan sinh sản nấm mốc Có hai loại bào tử: + Bào tử nội sinh (bào tử nang - endospore) + Bào tử ngoại sinh (bào tử đính - exospore) Sợi nấm mang bào tử gọi cuống bào tử Bào tử nấm mốc có màu sắc đặc trưng cho lồi Bào tử nang Mucor, Rhizopus có màu đen Bào tử Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, Aspergillus niger - màu đen, Aspergillus usami - màu nâu, Aspergillus awamori – màu nâu đen, Penicillium - màu xanh lam Sự hình thành bào tử nấm mốc khác có tính chất đặc trưng cho lồi - 47 Lê Ngọc Diệp_20190430 - Khả chuyển động: Nấm mốc khơng có khả di động chúng phân bố rộng rãi tự nhiên bào tử phát tán khơng khí nhờ gió 1.3 - Ứng dụng cơng nghiệp Nấm mốc đóng vai trị quan trọng q trình chuyển hóa vật chất tự nhiên, vơ hóa chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường sinh thái - Sản xuất axit hữu - Sản xuất chất có hoạt tính sinh học cao enzim, protein, vitamin, axit amin, kháng sinh So sánh số lồi nấm mốc điển hình Lồi nấm Phân Hệ sợi Cuống sinh bào tử 48 Bào tử Lê Ngọc Diệp_20190430 mốc loại Phân nhánh, có Mucor Nấm Đơn bào Cuống cuống sinh hạ ( hệ sợi sinh bào tử phát đẳng không bào tử triển từ có vách khơng vị trí ngăn) có vách Khơng phân ngăn Bào tử nang nhánh, – Rhizopus nhánh sinh vị trí Các tế bào thể bình mọc khắp hướng, Cuống sinh bào tử quan sát Aspergillu khơng có vách ngăn thấy cấu trúc s ( đơn bào) hình cầu Đa bào ( Nấm bề mặt hệ sợi thượng có vách đẳng Bào tử khơng nhẵn đính bào bào tử ngăn) nang Penicilliu Có thể mọc m nhiều nhánh Cuống sinh bào tử có cuống bào vách ngăn (đa bào) tử; tế bào thể bình mọc xịe giống hình chổi III Thực hành thí nghiệm 49 Lê Ngọc Diệp_20190430 - Quan sát số lồi nấm mốc qua kính hiển vi - Nhận xét: + Hệ sợi có vách ngăn hay khơng? + Cuống sinh bào tử có vách ngăn hay khơng? Có phân nhánh hay khơng? + Bảo tử nang hay bào tử đính? Hình dạng bào tử đính ( cầu, dễ tre,…) Di chuyển mẫu nhiều góc để quan sát rõ ràng Do kích thước nấm mốc lớn nên ta dùng vật kính x4 vật kính x10 để dễ quan sát điều chỉnh Từ kết quan sát, dựa vào đặc điểm hình thái để kết luận lồi nấm IV Kết thí nghiệm Mẫu è Kết quan sát mẫu: hệ sợi cuống sinh bào tử vách ngăn, có rễ giả, bào tử nhẵn, trịn đều, có nhiều nhánh cuống sinh bào tử mọc vị trí Dựa vào đặc điểm kết luận mẫu Rhizopus Mẫu 50 Lê Ngọc Diệp_20190430 è Kết quan sát mẫu: hệ sợi cuống sinh bào tử khơng có vách ngăn, phân nhánh, có cuống sinh bào tử phát triển từ vị trí, bào tử nang Dựa vào đặc điểm kết luận mẫu Mucor Mẫu è Kết quan sát mẫu: cuống sinh bào tử khơng có vách ngăn, bào tử quan sát thấy xù xì khơng nhẵn, dạng trịn; khơng thể quan sát thấy hệ sơi Mẫu có số đặc điểm đặc trưng Aspergillus, nhiên chưa thể kết luận Mẫu 51 Lê Ngọc Diệp_20190430 Quan sát mẫu ta thấy: mọc nhiều nhánh cuống bào tử; tế bào thể bình mọc xịe giống hình lúa, khơng quan sát rõ hệ sợi có vách ngăn hay khơng, cuống bào tử có vách ngăn, có đặc điểm Penicillium chưa thể kết luận BÀI 10: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN – PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ỐNG DUHAM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASES I Mục đích thí nghiệm:  Đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme amylase phân giải tinh bột nấm mốc  Đánh giá khả lên men nấm men II Nội dung thực hiện, phương pháp tiến hành Phương pháp tiến hành a Đánh giá chủng nấm men  Nguyên tắc: chế trình lên men rượu xảy theo phản ứng sau: C6H12O6 → 2C2H5O¬H + CO2 + 27kcal + Trong sản xuất rượu etylic nói chung sản xuất loại rượu vang hay rượu đặc sản nói riêng, vấn đề quan trọng phải chọn chủng nấm men có khả lên men mạnh + Nấm men kỵ khí tùy tiện Trong điều kiện hiếu khí nấm men oxy hóa đường thành CO2 H2O sinh trưởng cách mạnh mẽ Trong điều kiện kỵ khí nấm men lên men đường thành etanol CO2 + Quá trình lên men xúc tác enzyme nội bào, có nghĩa xảy bên tế bào Sau CO2 etanol tiết mơi trường Rượu 52 Lê Ngọc Diệp_20190430 etylic hịa tan nhiều nước nhung khả hòa tan CO2 nước không lớn (ở nhiệt độ 25-30oC áp suất 760mmHg, lít nước hịa tan 0,837-0,865 lít CO2) Độ hịa tan CO2 rượu lớn nước lần Do môi trường lên men nhanh chóng bão hịa CO2 + Khi CO2 hấp thụ bề mặt tế bào nấm men vật rắn môi trường tạo thành bọt bền Bọt đạt đến độ lớn định lên bề mặt kéo theo tế bào nấm men vỡ tiếp xúc với khơng khí- lúc tế bào lại chìm xuống Điều làm cho tế bào nấm men không di động trở nên di động, trao đổi chất tế bào tăng lên mạnh mẽ, lên men diễn mãnh liệt khiến cho dung dịch lên men sôi rào rào bình + Để đánh giá khả lên men rượu nấm men thơng qua việc xác định sản phẩm hình thành trình CO2, axetandehit sản phẩm cuối etanol so với lượng đường ban đầu môi trường ni cấy  Dựa vào phương trình tổng qt trình lên men dễ thấy: + Lượng đường phân giải trình lên men nhiều lượng CO2 tạo lớn + Tốc độ trình lên men lượng CO2 bay từ thê tích canh trường định khoảng thời gian xác định  Như cách đo thể tích CO2 hình thành dễ  Mơi trường lên men sau trùng điều chỉnh pH cấy giống Saccharomyces cerevisiae cho lên men dung cụ nói nhiệt độ 30-35oC 1-2 ngày  Phương pháp xác định CO2: Người ta sử dụng dụng cụ bình bình Einhorn-Schmith, ống Durham dụng cụ thông thường tự chế phịng thí nghiệm theo ngun tắc: Sự hình thành khí CO2 trình lên men nhiều trình lên men mạnh, hàm lượng rượu etylic thu cao Cho thể tích xác định dịch lên men vào ống Durham bình Einhorn – Schmith Để thời gian cho phản ứng lên men xảy CO2 thoát đẩy dung dịch chiếm thể tích định Dựa vạch chia xác định thể tích CO2 b Đánh giá chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp enzyme cao  Nguyên tắc:  Trong trình phát triển vi sinh vật, enzym luôn tổng hợp để tham gia vào q trình đồng hố q trình dị hố  Phương pháp đo vịng thủy phân dựa vào ngun tắc: Trên mơi trường có chất tương ứng với enzyme cần tổng hợp, người ta nuôi vi sinh 53 Lê Ngọc Diệp_20190430 vật theo phương pháp cấy chấm điểm Khi vi sinh vật phát triển, xung quanh khuẩn lạc hình thành vịng phân giải chất có kích thước thùy thuộc vào lượng enzyme thủy phân mà khuẩn lạc tiết Dựa vào tỷ lệ đường kính vịng thủy phân đường kính khuẩn lạc người ta đánh giá lựa chọn chủng có khả sinh tổng hợp enzyme cần thiết  Tiến hành: Chế tạo môi trường Sapek-tinh bột để nuôi nấm mốc Trên môi trường trùng cấy chấm điểm hai loại nấm mốc khác bốn vi trí cách (thành bốn góc hình vng) Ni nấm mốc tủ ấm điều kiện thích hợp, sau 48 lấy qua sát, đọc kết quả, lập tỷ số đường kính khuẩn lạc đường kính vịng thủy phân So sánh tỷ số, khả sinh tổng hợp enzyme chủng tỷ lệ nghịch với tỷ số Làm môi trường shapek nuôi nấm mốc  Chuẩn bị 200ml môi trường theo công thức sau: Thành phần Tinh bột NaNO3 KCl KH2PO4 MgSO4 FeSO4 Agar Khối lượng 1lit 30g 2g 0.5g 1g 0.5g 0.01g ( PTN chuẩn bị dung dịch 1%) 20g Khối lượng 200ml 6g 0.4g 0.1g 0.2g 0.1g 0.2ml 4g Làm môi trường lỏng nuôi nấm men  Chuẩn bị 200ml môi trường lỏng theo công thức sau Thành phần Khối lượng 1lit Khối lượng 200ml Glucose 100g 20g (NH4)2SO4 10g 2g KH2PO4 5g 1g MgSO4.7H2O 2g 0.4g - Sau pha hai môi trường cốc đong, ta phân phối vào bình tam giác ống nghiệm chứa ống durham 54 Lê Ngọc Diệp_20190430 Phân phối môi trường khử trùng  Đối với môi trường lỏng cho vào ống ống 7ml mơi trường, đậy kín nút bơng lại bọc giấy đem trùng  Môi trường Czapek-tinh bột sau khử trùng ta phân phối vào hộp petri, hộp 15ml( thao tác phải nhanh để tránh thạch đông lại) Gieo cấy a Cấy mẫu vi sinh vật trng mẫu Nato Bacillus vào môi trường Czapek-tinh bột (làm việc xung quanh lửa đèn cồn)  Tay trái cầm ống nghiệm có canh trường vi sinh vật (ngửa lòng bàn tay lên, đặt ống nghiệm ngón trỏ ngón cho ống canh trường nghiêng) Nhất thiết không để canh trường chạm nút (nếu canh trường lỏng)  Dùng tay phải xoay nhẹ nút bơng vịng để dễ rút  Tay phải cầm que cấy, nung nóng đỏ que cấy lửa đèn cồn, lướt thân que cấy qua đèn cồn cho toàn que cấy trùng hồn tồn  Kẹp nút bơng ngón út lịng bàn tay phải hay ngón út ngón đeo nhẫn bàn tay phải, rút nhẹ nút giữ nguyên suốt q trình lấy mẫu tuyệt đối khơng để nút bơng lên vật khác  Đốt miệng ống nghiệm đèn cồn  Khéo léo đưa đầu que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy canh trường nhẹ nhàng đưa que cấy  Đốt miệng ống nghiệm lần nút lại Đặt ống nghiệm lên giá  Đưa que cấy có vi sinh vật cấy chấm điểm vào mơi trường đặc hộp petri  Ta cấy chấm điểm bốn vị trí cách nhau( mẫu điểm) hợp lí khuẩn lạc phát triển khơng bị sát vào Sau cấy xong đánh dấu vị trí cấy mẫu xuống đáy hộp petri Bọc giất bỏ vào tủ nuôi: khoảng 35oC, sau ngày lên quan sát Đổ lugol lên để đo d D b Cấy mẫu vi sinh vật B9, R4 vào môi trường lên men (làm việc xung quanh lửa đèn cồn)  Sau trùng ta làm nguội ống nghiệm chứa môi trường lên men  Đem mẫu vortex để sinh khối vi sinh vật phân bố đồng  Dùng pipet lấy 0.7ml mẫu nấm men vào ống  Gieo cấy nấm men vào môi trường lỏng vơ trùng (mẫu nấm men nhóm R6 B2) 55 Lê Ngọc Diệp_20190430  Dùng pipet hút canh trường cho vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng Sau cấy xong đậy nút bông, ghi tên mẫu, bọc giấy đem nuôi cấy môi trường thích hợp III Kết Đánh giá khả phân giải tinh bột  Kết quả:  Không so sánh để lâu q nên lượng khí đầy Đánh giá khả lên men  Kết quả: 56 Lê Ngọc Diệp_20190430  Tất mẫu suốt, có lắng đáy ống nghiệm, có ống Durham chứa đầy khí nhơ lên khoảng 0.9-1.1 cm , cịn ơng chùm dung dịch ống chứa 2/3 ống durham khơng khí IV Thảo luận  Cấy nấm men thạch:  Hai mẫu có khả phân giải khác  Ta thấy có hộp petri khơng thấy xuất B.subtilis mẫu Natto lấy mẫu q  Cấy nấm men mơi trường lỏng: Trong tất ống durham mẫu chứa đầy khí nên khơng thể dựa vào để đánh giá: lượng khí ống durham căng lớn khả phân giải lên men căng lớn 57 Lê Ngọc Diệp_20190430 ...BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT I Mục đích thí nghiệm  Tìm hiểu mơi trường dinh dưỡng, loại mơi trường dinh dưỡng cách tạo môi trường dinh dưỡng (môi trường. .. bị môi trường dinh dưỡng nước muối sinh lý cho nhóm sau thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu  Sử dụng phương pháp phân lập nuôi cấy môi trường đặc  Với vi sinh vật kị khí: sử dụng phương pháp đổ... VI SINH VẬT I Mục đích thí nghiệm phương pháp nghiên cứu Mục đích thí ngiệm  Phân lập chủng sinh vật: vi sinh vật hiếu khí nước tương bần, vi khuẩn Lactobacillus mẫu men vi sinh  Chuẩn bị môi