Báo cáo thí nghiệm vi sinh vật

LỜI MỞ ĐẦU Xã hội ngày càng đi lên phát triển không ngừng theo hướng công nghiệp hóa, các vấn đề về ô nhiễm môi trường luôn tồn đọng và được quan tâm một cách cần thiết Trong đó việc kiểm tra vi sinh vật trong kiểm soát ô nhiễm môi trường giúp xác định mức độ ô nhiễm môi trường bằng cách nhận diện, thống kê các sinh vật chỉ thị 1 cách chính xác Môn học thí nghiệm vi sinh giúp sinh viên nắm bắt được các vấn đề trên không chỉ về lí thuyết mà còn ở việc nghiên cứu thực tế thông qua các phòng thí ng.

LỜI MỞ ĐẦU Xã hội ngày lên phát triển khơng ngừng theo hướng cơng nghiệp hóa, vấn đề ô nhiễm môi trường tồn đọng quan tâm cách cần thiết Trong việc kiểm tra vi sinh vật kiểm sốt nhiễm môi trường giúp xác định mức độ ô nhiễm môi trường cách nhận diện, thống kê sinh vật thị cách xác Mơn học thí nghiệm vi sinh giúp sinh viên nắm bắt vấn đề khơng lí thuyết mà cịn việc nghiên cứu thực tế thơng qua phịng thí nghiệm Trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh trang bị, qua giúp sinh viên tiếp cận nắm bắt gần với chuyên ngành tương lai Mặc dù cố gắng khơng thể tránh khỏi thiếu sót, bất cập Rất mong nhận đánh giá, phản hồi ~1~ MỤC LỤC ~2~ NGUYÊN TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Chuẩn bị đọc trước thí nghiệm để giảm tối đa rủi ro q trình thực nghiệm Khơng ăn, uống, hút thuốc phịng thí nghiệm Khơng ngậm vật dụng viết chì q trình ni cấy Điều giúp hạn chế nguy hiểm nhiễm vi sinh vật phịng thí nghiệm Bắt buộc phải có áo khốc trang suốt q trình làm thí nghiệm Điều giúp bảo vệ quần áo, da q trình làm thí nghiệm Chỉ mang dụng cụ cần thiết dùng cho thí nghiệm, ghi chép bút Các vật dụng khác túi xách, áo khoác, sách phải để nơi riêng biệt Tránh tình trạng lộn xộn q trình làm thí nghiệm Trước bắt đầu hay sau thí nghiệm cần phải tẩy trùng khu vực làm việc với dung dịch 5% lysol, amphyl hay 10% chlorox Tất môi trường phải dán nhãn ghi đầy đủ tên, ngày thí nghiệm Việc dán nhãn giúp không sử dụng nhầm lẫn mơi trường theo dõi thời gian sử dụng môi trường Nếu môi trường bị trào, đổ… phủ khăn lau Báo với người hướng dẫn phịng thí nghiệm Tẩy trùng sau lau Tuân thủ biển báo ghi chau đựng hóa chất để đảm bảo an tồn sử dụng xử lý kịp thời gặp cố Cẩn thận với đèn khử trùng (ví dụ: đèn cồn) Cần tắt đèn không sử dụng để tránh bị thương Khi cầm nắm dụng cụ cần ý không để tay chạm vào lửa Những sinh viên có mái tóc dài đặc biệt cần lưu ý mái tóc dễ dàng bắt lửa 10 Không sử dụng pipette miệng để tránh nuốt mơi trường hóa chất gây tổn thương gây bệnh Sử dụng pipette bóng cao su hay tay máy, việc gắn pipette cần phải tiến hành nhẹ nhàng, tránh mạnh tay gây vỡ 11 Khi vật liệu thủy tinh bị vỡ, cần đảm bảo thu dọn Sử dụng bao tay bảo vệ mảnh thủy tinh cần vứt bỏ vào hộp riêng, không để lẫn vào bao rác thông thường gây thủng bao ~3~ 12 Cẩn thận với dụng cụ có cạnh sắc nhọn 13 Tất dụng cụ bỏ cần tẩy trùng trước bỏ tái sử dụng lại Không rót mơi trường vào bồn rửa, mà phải bỏ vào nơi riêng Vi sinh vật khơng cịn tham gia thí nghiệm trước vứt bỏ cần phải diệt hết chúng Có thể tiêu diệt chúng autoclave, sử dụng áp suất với nhiệt độ nâng lên đạt đến điểm cần thiết Một số trường hợp sử dụng hóa chất kháng vi sinh vật để làm vật dụng Pipette sử dụng nên để nơi vô trùng Những cục đông sữa đông, thạch đông cần phải loại bỏ để tránh tối đa việc lây nhiễm vi sinh vật 14 Không xếp petri ngoại trừ chúng giữ vững giá kim loại nhựa đặc biệt Điều giúp giảm việc phóng thích vi sinh vật khỏi mơi trường ngồi petri bị ngã bung nắp 15 Không mở nắp petri để ngửi môi trường Điều dẫn đến việc vi sinh vật xông lên gây nhiễm 16 Khi hơ que cấy lửa, cần để que cấy gần gốc lửa để đảm bảo vi sinh vật que cấy bị đốt cháy hoàn toàn Điều quan trọng cần khóm bụi vi sinh vật lại que cấy nguyên nhân gây phát tán vi sinh vật môi trường 17 Sau buổi thí nghiệm cần phải vệ sinh bàn tay cẩn thận trước rời khỏi phịng thí nghiệm 18 Ngay bị vết thương cố nhỏ cần báo cho người hướng dẫn phịng thí nghiệm biết để xử lí cách kịp thời xác ~4~ I CÁC DỤNG CỤ, THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG MƠN HỌC: DỤNG CỤ, THIẾT BỊ HÌNH ẢNH CƠNG DỤNG Đĩa petri Chứa mơi trường ni cấy VSV Ống nghiệm Dùng để chứa đựng dung dịch với thể tích nhỏ, ni cấy VSV mơi trường lỏng mơi trường thạch Bình tam giác Chứa mơi trường ni cấy hay dung mơi hóa chất pha chế môi trường Cốc thủy tinh Dùng để chứa cồn , hóa chất … Que trang Trải giọt sinh khối VSV lên bề mặt thạch ~5~ Que cấy vòng Ria bề mặt thach cấy phân lập VSV bề mặt thạch cấy truyền Đèn Cồn Tạo không gian vô trùng, khử trùng loại que cấy Gía để ống nghiệm Để tránh ống nghiệm vỡ, lăn ngồi Bình tia Chứa nước cất Bóp cao su Sử dụng để hút hóa chất thơng qua pipet micropipet Định lượng thể tích xác VSV, mơi trường ni cấy hay dung dịch hóa chất Định lượng xác khối lượng hóa chất cần lấy Cân điện tử ~6~ Nồi hấp Vô trùng ~7~ TUẦN 1: CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG NI CẤY VI SINH VẬT I Chuẩn bị mơi trường ni cấy vi sinh vật: • Mục đích: - Giúp sinh viên chuẩn bị môi trường hỗn hợp, cách phối hợp thành phần thích hợp để giúp vi sinh vật phát triển vô trùng môi trường, kiểm tra - nghên cứu vi sinh vật, nuôi cấy chúng Nắm bắt kỹ thuật chuẩn bị trùng môi trường, vô trùng dụng cụ, nuôi cấy vi sinh chuẩn • Ngun tắc: Khu vực làm thí nghiệm dụng cụ cấy cần vô trùng, công việc cần thực nhanh chóng hiệu quả, đáp ứng ngun tắc phịng thí nghệm • Vật liệu: - Cặp đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghệm, pipet, becher 100ml 250ml, cân điện tử, nồi hấp khử trùng, hóa chất cần dùng • Chuẩn bị môi trường Hasen: a) Thành phần: - Glucose: 7,5g - Pepton: 1,5g - KH2PO4: 0,45g - MgSO4: 0,45g - Agar : 3g - Nước cất: 150m b) Các bước tiến hành: ~8~ • Chuẩn bị đung dịch nước muối sinh lý: a) Thành phần: - NaCl: 0,9g - Nước cất: 100ml b) Các bước tiến hành: • Kết quả: II Kỹ thuật vô trùng nuôi cấy vi sinh vật: • Mục đích: - Gíup sinh viên hiểu rõ phương pháp cấy truyền kỹ thuật vô trùng - cấy truyền Học cách đảm bảo an tồn việc cấy vi sinh từ mơi trường sang môi trường khác mà không bị lây nhiễm ~9~ • Nguyên tắc: - Khu vực làm việc cần tẩy trùng để giảm tối đa mầm mống gây - bệnh Dụng cụ cấy truyền phải vô trùng Cơng việc cấy cần phải thực nhanh chóng hiệu để giảm thiểu thời gian tiếp xúc môi trường cấy tác nhân gây nhiễm bên ngồi • Thực Nghiệm: - Ln để que cấy lửa đèn cồn trước đưa chúng vào môi trường - nuôi cấy Bỏ nắp đậy đảm bảo để mép ống nghiệm gần lửa với bán kính - lớn 20cm Đưa que cấy vào mơi trường di chuyển lướt mơi trường, nhanh chóng - hơ lửa miệng ống nghiệm đậy kín lại Đậy nắp không nhầm lẫn giữ nắp ngón út suốt q - trình mở nắp để thao tác Đối với đĩa petri mở nghiêng nắp góc 30 0-450 suốt q trình ni cấy - Không để nắp ống nghiệm petri chạm vào vật  Ưu điểm: - Định lượng vi sinh vật nhạy nhiệt - Nhận dạng dạng khuẩn lạc đặc trưng - Làm chủng vi sinh vật mục tiêu  Nhược điểm: - Chỉ cấy thể tích mẫu vật nhỏ - Chỉ cho phép đếm số lượng khuẩn lạc thấp III Kết quả: Số đĩa môi trường bị nhiễm : 3/6 đĩa - Nguyễn Phạm Thành Chung:2/2 - Nguyễn Minh Chánh:1/2 - Nguyễn Thị Ngọc Châu:0/2 • Nhận xét: ~ 10 ~ ảnh mẫu  Hệ số pha loãng: 10-6  Số khuẩn lạc: khuẩn lạc lớn bất thường + Tỉ lệ: 100  Có khuẩn lạc bất thường do: q trình thao tác cấy mẫu khơng khử trùng khu vực làm việc, đưa gần miệng lúc thao tác thao tác chưa dứt khốc thời gian khiến mơi trường bên tác động đến mẫu IV) Bàn luận:  Tại mẫu 10-5 , 10-6 xuất vi sinh vật, mẫu 10-4 khơng có vi sinh vật ? - Có thể q trình pha lỗng 10-1 lần, lượng vi sinh vật giảm dẫn đến xác suất pipette lấy thể tích 0,1ml mẫu chứa vi sinh vật thấp Pha loãng nhiềuthì lượng vi sinh vật xác suất pipette hút vi sinh vật giảm Trong trình hút có bọt khí làm cho lượng vi sinh vật lắc mẫu chưa kĩ, để thời gian lâu lấy mẫu làm vi sinh vật lắng xuống,…  Từ dẫn đến việc mẫu sau ko có vi sinh vật  Tại mẫu 10-6 lại có khuẩn lạc bất thường? - Có thể q trình cấy có thành viên khơng trang bị bao tay , trang nên gây ảnh hưởng đến mơi trường Suy đốn khuẩn lạc từ người thành viên nhiễm vào trình giao tiếp cấy  Thời gian thí nghiệm: 05/04/2019 V) VI) Tài liệu tham khảo: Giáo trình thí nghiệm vi sinh vật mơi trường Kết luận ~ 15 ~ 1.Số loại khuẩn lạc? Số lượng loại? Mơ tả đặc điểm khuẩn lạc? - Có hai loại khuẩn lạc • Loại 1: có hình trịn trắng sữa trơn • Loại 2: dạng hình trịn có vài chấm bề mặt + Ghi chú: dĩa có xuất loại vi sinh vật lạ bị nhi ễm đếm số lượng Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí mẫu ban đầu?( đơn vị CFU/ml) Cơng thức tính N(CFU/g hay CFU/ml)= Trong - N: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn gam hay - ml mẫu (CFU: colony forming units) C: tổng số khuẩn lạc đếm hộp petri chọn (có s ố khuẩn lạc nằm khoảng 25-250 khuẩn lạc đĩa) - : số hộp petri cấy độ pha loãng thứ i - hệ số pha lỗng tương ứng - thể tích dung dịch mẫu(ml) cấy vào đĩa  = 44*(CFU/ml) Định lượng loại vi sinh vật mẫu ban đầu? =5*(CFU/ml) =39*(CFU/ml) Xác định khuẩn lạc nấm men (saccharomyces cerevisiae): Loại dạng hình trịn có vài chấm bề mặt khu ẩn lạc n ấm men  Khuẩn lạc Nấm men ( saccharomyces cerevisiae) khuẩn lạc tròn có chấm liti bề mặt ~ 16 ~ TUẦN 3: CẤY PHÂN LẬP - CẤY CHUYỀN – NHUỘM GRAM I/ Cấy phân lập: 1) Mục đích nguyên tắc: - Giúp sinh viên thực hành phương pháp nuôi cấy tách riêng lẻ loại vi - sinh vật khỏi môi trường vi sinh vật đa dạng Để nghiên cứu loại đơn lẻ cộng đồng vi sinh vật cần phải phân lập chúng khỏi cộng đồng đồng thời ni cấy khiết chúng, việc thực thông qua nghiên cứu sinh lí sinh hóa quan sát kính hiển vi Phần lớn nghiên cứu vi sinh vật - địi hỏi phải sử dụng môi trường khiết Phần lớn phương pháp ni cấy khiết dựa vào kỹ thuật pha lỗng Hiện nay, phương pháp tỏ hữu dụng thực tế phương pháp nuôi cấy đĩa môi trường hỗn hợp, người ta trải cấy vết ~ 17 ~ bôi bề mặt môi trường dinh dưỡng tế bào vi sinh vật - tách riêng tế bào Mỗi tế bào phân lập phát triển thành khuẩn lạc lúc - hồn tất công việc nuôi cấy chủng Việc tách tế bào riêng lẻ để phát triển thành khuẩn lạc công việc đơn giản, tất khuẩn lạc phát triển từ tế bào ban đầu, ví dụ: chủng streptococcus thường kết hợp thành chuỗi tế bào nên tách riêng tế bào riêng biệt Một số tế bào vi sinh vật tiết mơi trường bên ngồi chất vật liệu màng nhầy thể nhớt, chúng kết dính tế bào lại với 2) Phương pháp hạn chế nhược điểm nuôi cấy phân lập: - Bảo đảm que cấy nguội trước đưa vào thạch - Giữ que cấy song song với bề mặt thạch, không đưa que cấy sâu vào - thạch làm thủng bề mặt thạch Sử dụng ánh sáng phản chiếu để quan sát đường cấy, đường - mờ nhạt cho phép cấy đường tốt Luôn khử trùng que cấy sau dứt đường cấy Điều giúp - phân lập tốt Sử dụng nắp petri để ngăn chặn vi sinh vật bên rơi vào Khi đưa vào tủ nuôi cấy, lật ngược petri lại để ngăn chặn giọt nước tụ lại rơi xuống làm lan truyền tế bào vi khuẩn  (Không phương pháp hồn chỉnh để có đĩa cấy phân lập hoàn hảo Mỗi phương pháp cần lặp lặp lại nhiều lần để tách riêng tế bào riêng rẽ.) 3) Vật liệu thí nghiệm: Giống vi sinh vật, mơi trường ni cấy đĩa petri, que cấy vịng, đèn cồn 4) Các bước tiến hành: Dùng bút lông dầu đánh dấu giống VSV cần lấy môi trường thạch đĩa petri Sau hơ que cấy vòng lửa đèn cồn Đợi que cấy vịng nguội , sau lấy mẫu cách chạm nhẹ vào giống khuẩn lạc cần lấy Ria dích dắc mơi trường thạch thành bốn đường riêng biệt Khử trùng que cấy Gói đĩa lại giấy lưu trữ tủ sấy ~ 18 ~ Sau 24h đến 48h quan sát khuẩn lạc cấy • Kết quả: Nguyễn Phạm Thành Chung Nguyễn Minh Chánh Nguyễn Thị Ngọc Châu ~ 19 ~ • Nhận xét: + đường cấy chưa chuẩn , đẹp chưa đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ria dích dắc , khuẩn lạc ko rời đẹp mà dính chồng lên + trình cấy thao tác chậm , sai sót làm mẫu bị nhiễm tác nhân bên + lấy mẫu nhiều nên số lượng khuẩn lạc nhiều • Tài liệu tham khảo : giáo trình thí nghiệm VSV mơi trường II/ Cấy chuyền: • Mục đích ngun tắc: - Giúp sinh viên thực hành phương pháp nuôi cấy tách riêng lẻ loại vi sinh vật khỏi mơi trường vi sinh vật đa dạng • Vật liệu thí nghiệm: Giống vi sinh vật, mơi trường ni cấy ống nghiệm (thạch nghiêng), que cấy vòng, đèn cồn • Các bước tiến hành: ~ 20 ~ Thực nghiệm: • Kết ~ 21 ~ Nguyễn Phạm Thành Chung Nguyễn Minh Chánh Nguyễn Thị Ngọc Châu • Nhận xét: + Đường cấy chưa chuẩn, đẹp, khuẩn lạc dính chồng lên ~ 22 ~ + Có ống nghiệm không xuất khuẩn lạc q trình lấy mẫu ko chạm trúng vào giống khuẩn lạc + Bề mặt thạch bị sần, nứt trình cấy thao tác mạnh tay • Tài liệu tham khảo : giáo trình thí nghiệm VSV mơi trường III/ Nhuộm gram: • Mục đích nguyên tắc: - Giúp làm quen với vài phương pháp nhuộm đơn giản Đồng thời sinh viên so sánh hình thái đặc trưng hình dạng, kích thước - nhằm hiểu thêm tính đa dạng vi sinh vật Việc nhuộm màu sử dụng thuốc nhuộm tạo phản ứng hóa học tế bào với hóa chất nhằm làm bật tương phản tế bào môi - trường xung quanh Vết bôi phải đảm bảo không dày để quan sát tế bào riêng - lẻ Tế bào không bị rửa trôi trình nhuộm – rửa Tế bào giữ hình thái ban đầu sau cố định nhuộm • Vật liệu thí nghiệm: Vi sinh vật, lam kính, thuốc nhuộm (Crystal violet, Lugol, Fuchsin), giá ống nghiệm, giấy thấm, cốc thủy tinh, que cấy vịng, kính hiển vi • Phương pháp nhuộm gram: - Phương pháp nhuộm áp dụng để phân loại nhóm vi sinh vật Dựa phản ứng với thuốc nhuộm Gram người ta chia vi khuẩn thành hai nhóm: Gram âm Gram dương * Một số yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp nhuộm Gram: + Chuẩn bị vết bôi: vết bôi dày việc tẩy màu thực Nếu cố định vết bơi q nóng khiến tế bào bị gảy đứt biến dạng + Nồng độ độ tồn lưu thuốc thử ảnh hưởng đến chất lượng trình nhuộm + Rửa nước làm khơ phải xác Thừa nước lam kính làm lỗng thuốc thử, đặc biệt với Gram iodine + Nhuộm Gram tin cậy tế bào lấy từ giai đoạn pha loãng trình sinh trưởng Nếu lấy giai đoạn già lẫn nhiều tế bào chết bị gãy đứt, lúc tế bào nhuộm thành Gram âm tế bào Gram dương ~ 23 ~ Hiện có số giả thuyết chấp nhận, giải thích khác tế bào Gram âm Gram dương:  Vách tế bào Gram dương chứa cao phân tử protein đường gọi murein Màng murein tạo thành rào ngăn không cho phép phức hợp crystal violet – iodine vượt qua giai đoạn tẩy màu Khi khơng cịn vách tế bào, Gram dương không ngăn cản phức chất trở thành Gram âm Vách tế vào Gram âm chứa murein nhiều lipid tế bào Gram dương Đặc tính hóa học cho phép tạo phức hợp nhanh dễ dàng bị tẩy giai đoạn tẩy màu  Một giả thuyết khác xác định chất nằm bên tế bào Tất đại phân tử nhân tham gia lipid, carbonhydrate, protein, acid nhân Tuy nhiên giả thuyết khó chấp nhận việc di chuyển thành phần làm thay đổi tính chất vách tế bào Tuy nhiên, có số chứng tạo thành phức hợp crystal violet – acid ribonucleic – iodine tế bào Gram dương  Sự kết hợp hai giả thuyết đưa kết luận: tế bào Grm dương khơng thấm mà cịn tồn hợp chất tạo phức hợp bền vững với thuốc nhuộm • Các bước tiến hành: ~ 24 ~ ~ 25 ~ ... đảm bảo vi sinh vật que cấy bị đốt cháy hoàn toàn Điều quan trọng cần khóm bụi vi sinh vật lại que cấy nguyên nhân gây phát tán vi sinh vật môi trường 17 Sau buổi thí nghiệm cần phải vệ sinh bàn... VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG NI CẤY VI SINH VẬT I Chuẩn bị mơi trường ni cấy vi sinh vật: • Mục đích: - Giúp sinh vi? ?n chuẩn bị môi trường hỗn hợp, cách phối hợp thành phần thích hợp để giúp vi sinh. .. khảo: Giáo trình thí nghiệm vi sinh vật mơi trường- Đặng Vũ Bích Hạnh ~ 11 ~ TUẦN 2: TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ I/ Tổng vi sinh vật hiếu khí: • Mục đích : - Vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn tăng trưởng