1. Phương pháp tiến hành
a. Đánh giá chủng nấm men
Nguyên tắc: cơ chế quá trình lên men rượu xảy ra theo phản ứng sau: C6H12O6 → 2C2H5O¬H + CO2 + 27kcal
+ Trong sản xuất rượu etylic nói chung cũng như sản xuất các loại rượu vang hay rượu đặc sản nói riêng, vấn đề quan trọng là phải chọn được chủng nấm men có khả năng lên men mạnh.
+ Nấm men kỵ khí tùy tiện. Trong điều kiện hiếu khí nấm men oxy hóa đường thành CO2 và H2O và sinh trưởng một cách mạnh mẽ. Trong điều kiện kỵ khí nấm men lên men đường thành etanol và CO2
+ Quá trình lên men được xúc tác bởi enzyme nội bào, có nghĩa là xảy ra bên trong tế bào. Sau đó CO2 và etanol được tiết ra môi trường. Rượu
etylic hòa tan nhiều trong nước nhung khả năng hòa tan của CO2 trong nước không lớn lắm (ở nhiệt độ 25-30oC áp suất 760mmHg, một lít nước hòa tan được 0,837-0,865 lít CO2). Độ hòa tan của CO2 trong rượu lớn hơn trong nước 3 lần. Do vậy môi trường lên men nhanh chóng bão hòa CO2.
+ Khi CO2 được hấp thụ trên bề mặt tế bào nấm men và các vật rắn của môi trường tạo thành các bọt bền chắc. Bọt đạt đến độ lớn nhất định thì nổi lên bề mặt kéo theo cả tế bào nấm men và vỡ ra khi tiếp xúc với không khí- lúc ấy tế bào lại chìm xuống. Điều đó làm cho tế bào nấm men không di động trở nên di động, trao đổi chất trong tế bào tăng lên mạnh mẽ, sự lên men diễn ra mãnh liệt hơn khiến cho cả dung dịch lên men như sôi rào rào trong bình.
+ Để đánh giá khả năng lên men rượu của 1 nấm men có thể thông qua việc xác định các sản phẩm hình thành trong quá trình như CO2,
axetandehit hoặc sản phẩm cuối cùng là etanol so với lượng đường ban đầu trong môi trường nuôi cấy.
Dựa vào phương trình tổng quát của quá trình lên men dễ thấy:
+ Lượng đường phân giải trong quá trình lên men càng nhiều thì lượng CO2 tạo ra càng lớn.
+ Tốc độ quá trình lên men chính là lượng CO2 bay ra từ một thê tích canh trường nhất định trong khoảng thời gian xác định.
Như vậy cách đo thể tích CO2 được hình thành là dễ hơn cả.
Môi trường lên men sau khi thanh trùng và điều chỉnh pH được cấy giống Saccharomyces cerevisiae và cho lên men trong những dung cụ nói trên ở nhiệt độ 30-35oC trong 1-2 ngày.
Phương pháp xác định CO2: Người ta sử dụng những dụng cụ như bình như bình Einhorn-Schmith, ống Durham hoặc dụng cụ thông thường tự chế trong phòng thí nghiệm theo nguyên tắc: Sự hình thành khí CO2 trong quá trình lên men càng nhiều thì quá trình lên men càng mạnh, hàm lượng rượu etylic thu được càng cao. Cho một thể tích xác định dịch lên men vào ống Durham hoặc bình Einhorn – Schmith. Để một thời gian cho phản ứng lên men xảy ra. CO2 thoát ra sẽ đẩy dung dịch ra và chiếm một thể tích nhất định. Dựa trên các vạch chia và xác định thể tích CO2 thoát ra.
b. Đánh giá chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao
Nguyên tắc:
Trong quá trình phát triển của vi sinh vật, enzym luôn luôn được tổng hợp để tham gia vào quá trình đồng hoá và quá trình dị hoá.
vật theo phương pháp cấy chấm điểm. Khi vi sinh vật phát triển, xung quanh khuẩn lạc hình thành vòng phân giải cơ chất có kích thước thùy thuộc vào lượng enzyme thủy phân mà khuẩn lạc tiết ra. Dựa vào tỷ lệ đường kính vòng thủy phân và đường kính khuẩn lạc người ta đánh giá và lựa chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cần thiết.
Tiến hành: Chế tạo môi trường Sapek-tinh bột để nuôi nấm mốc. Trên môi trường đã thanh trùng cấy chấm điểm hai loại nấm mốc khác nhau tại bốn vi trí cách đều nhau (thành bốn góc của hình vuông). Nuôi nấm mốc trong tủ ấm ở điều kiện thích hợp, sau 48 giờ lấy ra qua sát, đọc kết quả, lập tỷ số giữa đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng thủy phân. So sánh các tỷ số, khả năng sinh tổng hợp enzyme của các chủng tỷ lệ nghịch với tỷ số này.
2. Làm môi trường shapek nuôi nấm mốc
Chuẩn bị 200ml môi trường theo công thức sau:
Thành phần Khối lượng trong 1lit Khối lượng trong 200ml
Tinh bột 30g 6g NaNO3 2g 0.4g KCl 0.5g 0.1g KH2PO4 1g 0.2g MgSO4 0.5g 0.1g FeSO4 0.01g ( PTN chuẩn bị dung dịch 1%) 0.2ml Agar 20g 4g
3. Làm môi trường lỏng nuôi nấm men.
Chuẩn bị 200ml môi trường lỏng theo công thức sau
Thành phần Khối lượng trong 1lit Khối lượng trong 200ml
Glucose 100g 20g
(NH4)2SO4 10g 2g
KH2PO4 5g 1g
MgSO4.7H2O 2g 0.4g
- Sau khi pha hai môi trường trong 2 cốc đong, ta phân phối vào bình tam giác và ống nghiệm chứa ống durham.
4. Phân phối môi trường và khử trùng
Đối với môi trường lỏng cho vào 6 ống mỗi ống 7ml môi trường, đậy kín nút bông lại và bọc giấy đem đi thanh trùng
Môi trường Czapek-tinh bột sau khi khử trùng ta phân phối vào các hộp petri, mỗi hộp 15ml( thao tác phải nhanh để tránh thạch đông lại).
5. Gieo cấy
a. Cấy mẫu vi sinh vật trng mẫu Nato và Bacillus vào môi trường Czapek-tinh bột (làm việc xung quanh ngọn lửa đèn cồn). Czapek-tinh bột (làm việc xung quanh ngọn lửa đèn cồn).
Tay trái cầm ống nghiệm có canh trường vi sinh vật (ngửa lòng bàn tay lên, đặt ống nghiệm giữa ngón trỏ và ngón cái sao cho ống canh trường hơi nghiêng). Nhất thiết không để canh trường chạm nút bông (nếu là canh trường lỏng).
Dùng tay phải xoay nhẹ nút bông một vòng để dễ rút ra.
Tay phải cầm que cấy, nung nóng đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, lướt thân que cấy qua đèn cồn sao cho toàn bộ que cấy được thanh trùng hoàn toàn.
Kẹp nút bông giữa ngón út và lòng bàn tay phải hay giữa ngón út và ngón đeo nhẫn của bàn tay phải, rút nhẹ nút bông và giữ nguyên như vậy suốt quá trình lấy mẫu. tuyệt đối không để nút bông lên bất kỳ một vật nào khác.
Đốt miệng ống nghiệm trên đèn cồn.
Khéo léo đưa đầu que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy canh trường và nhẹ nhàng đưa que cấy ra.
Đốt miệng ống nghiệm một lần nữa rồi nút bông lại. Đặt ống nghiệm lên giá.
Đưa que cấy đã có vi sinh vật cấy chấm điểm vào môi trường đặc trong hộp petri.
Ta cấy chấm điểm ở bốn vị trí cách nhau( mỗi mẫu 2 điểm) hợp lí để cho khuẩn lạc phát triển không bị sát vào nhau.. Sau khi cấy xong đánh dấu vị trí cấy là mẫu nào xuống đáy hộp petri. Bọc giất và bỏ vào tủ nuôi:
khoảng 35oC, sau 2 ngày lên quan sát. Đổ lugol lên để đo d và D.
b. Cấy mẫu vi sinh vật B9, R4 vào môi trường lên men (làm việc xung quanh ngọn lửa đèn cồn). xung quanh ngọn lửa đèn cồn).
Sau thanh trùng ta làm nguội ống nghiệm chứa môi trường lên men. Đem mẫu đi vortex để sinh khối của vi sinh vật phân bố đồng đều. Dùng pipet lấy 0.7ml mẫu nấm men vào các ống.
Gieo cấy nấm men vào môi trường lỏng vô trùng (mẫu nấm men của nhóm là R6 và B2)
Dùng pipet hút canh trường cho vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng. Sau khi cấy xong đậy nút bông, ghi tên mẫu, bọc giấy đem đi nuôi cấy trong môi trường thích hợp
III. Kết quả
1. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột
Kết quả:
Không so sánh được vì để lâu quá nên lượng khí đều đầy.
2. Đánh giá khả năng lên men
Tất cả mẫu trong suốt, có ít lắng ở đáy ống nghiệm, có 4 ống Durham đều chứa đầy khí và nhô lên khoảng 0.9-1.1 cm , còn 2 ông thì chùm trong dung dịch trong ống chứa 2/3 ống durham là không khí.
IV. Thảo luận
Cấy nấm men trên thạch:
Hai mẫu có khả năng phân giải khác nhau
Ta thấy có 1 hộp petri không thấy sự xuất hiện của B.subtilis của mẫu Natto có thể do khi lấy mẫu quá ít
Cấy nấm men trên môi trường lỏng:
Trong tất cả các ống durham của 2 mẫu đều chứa đầy khí nên không thể dựa vào đây để đánh giá: lượng khí trong ống durham căng lớn thì khả năng phân giải lên men căng lớn.