1. Làm tiêu bản vi sinh vật sống nhuộm đơn giản, sử dụng kính hiển vi quan sát tế bào nấm men, đánh giá một số chỉ tiêu canh trường. quan sát tế bào nấm men, đánh giá một số chỉ tiêu canh trường. a) Dụng cụ, hóa chất chuẩn bị thí nghiệm
- Canh trường nấm men (dạng lỏng).
- Kính hiển vi, phiến kính, lá kính.
- Xanh metylen.
- Pipet, đèn cồn.
b) Thực hành thí nghiệm
Làm tiêu bản giọt ép
Chuẩn bị một phiến kính và một lá kính sạch, trong suốt. Khử trùng phiến kính và lá kính bằng cồn, để khô.
- Dùng que cấy hoặc pipet lấy canh trường vi sinh vật đặt lên giữa phiến kính (2 vòng của que cấy canh trường nấm men).
- Dùng que cấy lấy xanh metylen thêm vào canh trường đã có trên phiến kính. Sau đó dùng cấy trộn và dàn đều hỗn hợp trên trong đường kính khoảng 1cm các vi sinh vật được tách nhau và xanh metylen phân bố nhuộm đều.
Chú ý: lấy giọt canh trường vừa phải, không nhiều hoặc ít quá. Nhiều quá, canh trường sẽ trào ra ngoài. Nếu ít quá, tiêu bản mau khô và hay tạo thành bọt khí trong tiêu bản, rất khó quan sát.
- Ép lá kính lên giọt canh trường bằng cách để một cạnh lá kính tiếp xúc với phiến kính sát mép giọt canh trường, nghiêng góc 60o, từ từ hạ lá kính nằm lên mặt phiến kính. Tránh đặt lá kính nhanh, mạnh quá giọt canh trường bắn ra ngoài hoặc lớp không khí giữa lá kính và phiến kính không kịp thoát sẽ tạo thành bọt khí.
Chú ý:
+ Các thao tác làm tiêu bản phải thực hiện quanh khu vực của ngọn lửa đèn cồn để hạn chế nhiễm tạp.
+ Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn ra ngoài phần tiếp xúc của phiến kính và lá kính ta dùng giấy lọc thấm bớt nước đi.
+ Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để giọt dịch khỏi bị khô.
Đặt tiêu bản lên khay kính và quan sát.
- Tế bào nấm men sống có khả năng ngăn cản hấp thụ thuốc nhuộm à tế bào không bị nhuộm màu xanh
à ta quan sát thấy sự tương phản màu: môi trường có màu thuốc nhuộm >< tế bào sống không màu.
- Tế bào chết mất không có khả năng ngăn thuốc nhuộm đi vào trong tế bào à bị nhuộm màu của thuốc nhuộm. Màu của tế bào chết đậm hơn màu của môi trường do tế bào và môi trường được ngăn cách bởi thành tế bào, thuốc nhuộm bị giữ lại trong tế bào.
è Màu đậm: tế bào vsv chết > môi trường > tế bào vsv sống.
Quan sát và xác định số lượng tế bào sống/chết, tế bào nảy chồi, tế bào lạ,…
à đánh giá canh trường nấm men.
2. Sử dụng buồng đếm hồng cầu định lượng trực tiếp tế bào nấm men.a) Dụng cụ và hóa chất a) Dụng cụ và hóa chất
- Canh trường nấm men (dạng lỏng).
- Buồng đếm hồng cầu.
- Pipet, nước muối để pha loãng, ống nghiệm.
- Kính hiển vi.
b) Thực hành thí nghiệm
- Khử trùng buồng đếm bằng cồn, để khô.
- Pha loãng canh trường trong trường hợp mật độ tế bào nấm men quá lớn, dẫn đến khó quan sát. Tỷ lệ pha loãng có thể tự chọn.
- Dùng pipet sạch lấy canh trường nhỏ vào khoang chia của buồng đếm, sau đó dùng lá kính ép lên bề mặt, ấn nhẹ để lá kính dính chặt vào phiến kính.
Thao tác quanh khu vực đối lưu của ngọn lửa đèn cồn để hạn chế tối đa sự nhiễm tạp của vi sinh vật.
- Đặt buồng đếm lên khay của kính hiển vi, quan sát và đếm lượng tế bào có trong 5 ô vuông lớn chéo nhau (mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ). Dùng kết quả để tính toán số tế bào trung bình trong mỗi ô.