Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp từ cây trâu cổ ( ficus pumila l ) họ dâu tằm (moraceae)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ CÂY TRÂU CỔ (Ficus pumila L.) HỌ DÂU TẰM (Moraceace) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sư phạm Hóa học Phú Thọ, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ CÂY TRÂU CỔ (Ficus pumila L.) HỌ DÂU TẰM (Moraceace) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sư phạm Hóa học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS Triệu Quý Hùng Trường Đại học Hùng Vương Phú Thọ, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học TS Triệu Qúy Hùng Các số liệu, kết nêu Khóa luận trung thực chưa có cơng bố cơng trình nghiên cứu trước Tồn thơng tin trích dẫn Khóa luận rõ nguồn gốc xuất xứ Sinh viên Trần Thị Thu Hà LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài nghiên cứu khoa học hướng tới khóa luận tốt nghiệp, với lịng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn Thầy hướng dẫn khoa học: TS Triệu Qúy Hùng-Trường Đại học Hùng Vương hướng nghiên cứu tận tình hướng dẫn em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Nhân dịp em xin bày tỏ cảm ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trường Đại học Hùng Vương, Khoa Khoa học Tự nhiên-Trường Đại học Hùng Vương tạo cho em môi trường học tập khoa học, nghiêm túc Em xin chân thành cảm ơn giảng viên Trường Đại học Hùng Vương giảng dạy hướng dẫn em thực thực nghiệm hóa học Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn sinh viên K12 ĐHSP Hóa học - Trường Đại học Hùng Vương hỗ trợ, động viên em suốt trình học tập thực Đề tài Phú Thọ, ngày 02 tháng năm 2018 Sinh viên Trần Thị Thu Hà -i- MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi MỞ ĐẦU 1 Lý lựa chọn đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi F.pumila L 1.2 Đặc điểm thực vật Trâu cổ 1.3 Các nghiên cứu hóa thực vật chi Ficus CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.2 Hóa chất thiết bị 12 2.2.1 Các loại hóa chất sử dụng 12 2.2.2 Các thiết bị nghiên cứu 13 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp ngâm chiết 15 2.3.2 Phương pháp sắc ký 16 2.3.3 Phương pháp kết tinh 18 2.3.4 Các phương pháp phổ 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ 27 3.2 Quá trình phân lập chất từ dịch chiết n-hexane Trâu cổ 31 3.1.1 Khảo sát thành phần định tính lựa chọn dung mơi 31 3.2.1 Quá trình phân lập chất 35 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 45 -i- -ii- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 Kết luận 53 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 -ii- -iii- DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT  Các phương pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography: Sắc ký cột  Các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation: Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation: Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt nhân COSY Correlation Spectroscopy: Phổ tương tác chiều đồng hạt nhân 1H-1H s: singlet (vạch đơn) t: triplet (vạch ba)  Tên hợp chất viết theo nguyên Tiếng Anh -iii- -iv- DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Lá Trâu cổ Hình 2.1: Các dung môi thông dụng sử dụng phân lập hợp chất thiên nhiên 12 Hình 2.2: Máy cất quay chân không 13 Hình 2.3: Bình triển khai sắc kí mỏng Camag 14 Hình 2.4: Bộ chưng cất dung mơi 14 Hình 2.5: Máy soi UV 14 Hình 2.6: Bếp điện đơi Gali 15 Hình 2.7: Sơ đồ chung phương pháp ngâm chiết 16 Hình 2.8: Minh họa sắc ký lớp mỏng 16 Hình 2.9: Minh họa sắc ký cột 17 Hình 2.10: Độ chuyển dịch hóa học proton 19 Hình 2.11: Sự tách vạch phổ propan-1-ol 20 Hình 2.12: Độ chuyển dịch hóa học carbon C-13 21 Hình 2.13: Minh họa phổ DEPT 22 Hình 2.14: Phổ 1H-1H COSY 23 Hình 2.15: Phổ HSQC 24 Hình 2.16: Phổ HMBC 25 Hình 2.17: Phổ khối lượng ESI-MS 26 Hình 3.1: Mẫu Trâu cổ sau phơi khô 27 HÌnh 3.2: Hình ảnh ngâm Trâu cổ dung mơi n-Hexane 28 Hình 3.3: Quá trình lọc dung dịch qua vải 28 Hình 3.4: Quá trình lọc dung dịch qua giấy lọc 29 Hình 3.5: Quay khơ dung dịch máy cất quay 29 Hình 3.6: Cặn n-hexane Trâu cổ 30 Hình 3.7: Sơ đồ ngâm chiết Trâu cổ 31 Hình 3.8: Kết khảo sát TLC cặn chiết n-hexne Trâu cổ 33 Hình 3.9: TLC cặn n-hexane Trâu cổ với hệ dung môi (VII) 34 -iv- -v- Hình 3.10: Cột tổng silica gel cặn n-Hexane 36 Hình 3.11: Hình ảnh TLC phân đoạn F1÷F9 38 Hình 3.12: Cột chạy silica gel 39 Hình 3.13: Cột phân đoạn F1 40 Hình 3.14: Cột chạy silica gel 42 Hình 3.15: Cột phân đoạn F1.4 43 Hình 3.16: Sơ đồ phân lập hợp chất FH4 44 Hình 3.17: Hình ảnh chất FH4 sắc ký đồ TLC 45 Hình 3.18: Cấu trúc hợp chất FH4 45 Hình 3.19: Phổ ESI-MS FH4 46 Hình 3.20: Phổ 13C-NMR FH4 47 Hình 3.21: Phổ DEPT FH4 48 Hình 3.22: Phổ 1H-NMR FH4 49 Hình 3.23: Phổ HSQC FH4 50 Hình 3.24: Phổ COSY FH4 51 Hình 3.25: Phổ HMBC FH4 52 -v- -vi- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Giá trị Rf màu sắc vệt chất mỏng 34 Bảng 3.2 Kết phân đoạn thu từ cột tổng n-Hexane 36 Bảng 3.3 Kết phân đoạn thu từ phân đoạn F1 41 Bảng 3.4 Kết phân đoạn thu từ phân đoạn F1.4 43 -vi- -42- Cân 180 gam silica gel, ngâm trương nở ngập n-hexane khoảng 30 phút, trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí Rót từ từ hỗn hợp silica gel trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định thời gian 1h Hình 3.14: Cột chạy silica gel Bước : Đưa chất lên cột gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu F1.4) hịa vào dung môi CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, đem trộn hỗn hợp với khoảng 20 gam silica gel, làm bay hết dung môi đến thu hỗn hợp bột tơi màu nâu đen.Cho từ từ silica gel đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ xung quanh cột để phần silica gel phân bố vào cột -43- Hình 3.15: Cột phân đoạn F1.4 Bước 3: Chạy cột Tiến hành rửa giải hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane (0% - 100%) Dùng pipet pasteur rửa hết phần hỗn hợp chất vừa cho lên cột vương lại miệng thành cột, để lớp mỏng lên mặt chất tránh cho dung môi lên làm xáo trộn bề mặt chất Hứng dung dịch rửa giải khoảng 10ml vào lọ có dung tích khoảng 15÷20ml Kiểm tra sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp lọ có vết chất tương đương mỏng Sau dội cột hệ dung môi MeOH Kết thu phân đoạn có kí hiệu từ F1.4.1 ÷ F1.4.6 (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Kết phân đoạn thu từ phân đoạn F1.4 STT Bình gộp Dung mơi rửa giải 1000 mL CH2Cl2/n-Hexane 0% 1÷66 67÷107 108÷138 1000 mL CH2Cl2/n-Hexane 8% 1000 mL CH2Cl2 /n-Hexane 2% 1000mL CH2Cl2 /n-Hexane 4% 1000 mL CH2Cl2/n-Hexane 6% Phân Khối lượng đoạn (g) F1.4.1 1,2042 F1.4.2 1,1420 F1.4.3 0,0867 -44- STT Bình Dung môi rửa giải gộp Phân Khối lượng đoạn (g) F1.4.4 1,3457 F1.4.5 0,4000 F1.4.6 1,8203 1000 mL CH2Cl2/n-Hexane 12% 1000 mL CH2Cl2/n-Hexane 14% 139÷200 201÷274 274÷hết 500 mL CH2Cl2 /n-Hexane 35% 1000 mL CH2Cl2/n-Hexane 20% 1000 mL CH2Cl2/n-Hexane 25% 1000 mL CH2Cl2/n-Hexane 30% Bước 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ Sau phân lập xong phân đoạn F1.4 ta tiến hành kết tinh phân đoạn nhỏ F1.4.3 hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane 1:1 thu 220 mg chất FH4 dạng tinh thể hình kim suốt màu trắng Quá trình phân lập hợp chất FH4 từ cặn n-Hexane Trâu cổ trình bày qua Hình 3.16 Hình 3.16: Sơ đồ phân lập hợp chất FH4 -45- Hợp chất FH4 không màu đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm, 366 nm màu xanh tím với thuốc thử Ce(SO4)2 (Hình 3.17) Hình 3.17: Hình ảnh chất FH4 sắc ký đồ TLC Trên hình ảnh sắc ký lớp mỏng chất FH4 xác định giá trị Rf = 0,64 (CH2Cl2/n-Hexane 50:50) 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập Sau tiến hành ngâm chiết mẫu Trâu cổ, sắc kí silica gel nhiều lần phân lập hợp chất FH4 Hợp chất đo phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Từ kiện phổ thu so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định cấu trúc hợp chất FH4 hợp chất triterpenoid amyrin acetate Hình 3.18: Cấu trúc hợp chất FH4 -46- Phổ khối lượng ESI-MS FH4 cho pic ion phân tử proton hóa [M +H]+ = 469 pic ion phân tử [M-CH3COOH+H]+ = 409 phù hợp với CTPT C32H52O2, M=468 Hình 3.19: Phổ ESI-MS FH4 -47- Phân tích phổ 13C-NMR DEPT cho thấy tín hiệu 32 carbon có nhóm methyl, 10 nhóm methylene, nhóm methin, nhóm carbonyl carbon bậc Hình 3.20: Phổ 13C-NMR FH4 -48- Hình 3.21: Phổ DEPT FH4 -49- Hình 3.22: Phổ 1H-NMR FH4 Trên phổ 1H-NMR xuất tín hiệu đặc trưng nhóm methyl H 0,83 (s); 0,87 (s) (2 x CH3); 0,88 (s) (2 x CH3); 0,96 (s); 0,97 (s); 1,13 (s); -50- nhóm acetate (OCOCH3) H 2,04 tín hiệu proton nhóm methin olefinic H 5,18 (t, J=4,0 Hz, H-12) Bên cạnh phổ 1H-NMR cịn có tín hiệu nhóm methin gắn với oxygen acyl hóa C-3 H 4,50 (t, J=8,0 Hz) Trên phổ HSQC xác định tín hiệu tương tác carbon proton liên kết trực tiếp với H-5 (H 5,18) tương tác với C-5 (C 145,2); H-3 (H 4,50) tương tác với C-3 (C 81,0) Hình 3.23: Phổ HSQC FH4 -51- Trên phổ COSY xác định chuỗi liên kết H-12H-11H-9; H-3H-2 Hình 3.24: Phổ COSY FH4 Trên phổ HMBC có tín hiệu proton H-3 tương tác với carbon nhóm carbonyl C 171,0 chứng tỏ nhóm OCOCH3 gắn với khung triterpen vị trí C-3 -52- Hình 3.25: Phổ HMBC FH4 Từ liệu phổ ESI-MS, phổ 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC so sánh với tài liệu tham khảo [3] cho phép xác định cấu trúc FH4 -amyrin acetate -53- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trong trình nghiên cứu thực đề tài thu kết sau: - Đã điều chế 97,1 gam cặn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ kí hiệu (FPLH) Khảo sát TLC cặn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ lựa chọn hệ dung môi CH2Cl2/n-HexaneEtOAc/CH2Cl2 MeOH/ CH2Cl2 để phân tách cặn dịch chiết n-Hexane thành phân đoạn nhỏ F1-F9 - Từ phân đoạn nhỏ F1 phân tách thành 10 phân đoạn nhỏ F1.1-F1.10 Từ phân đoạn F1.4 tiếp tục phân tách phân tách thành phân đoạn nhỏ F1.4.1 – F1.4.6 Từ phân đoạn F1.4.3 tiếp tục phân tách kết tinh thu hợp chất -amyrin acetate (FH4) - Cấu trúc hợp chất FH4 xác định phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC phổ khối lượng Kiến nghị - Tiếp tục phân lập chất từ phân đoạn lại dịch chiết n-hexane cặn dịch chiết khác Trâu cổ - Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ Trâu cổ - Bán tổng hợp số hợp chất nghiên cứu tách từ Trâu cổ khảo sát hoạt tính sinh học chúng -54- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 1, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [2] Nguyễn Văn Hùng (2011), Họ Na (Annonaceae)-Hóa học hoạt tính sinh học loài Desmos rostrata, Goniothalamus tamirensis, Fissistigma villosissium - Quyển 1, NXB Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Hà Nội [3] Đồn Thị Mai Hương, Nguyễn Văn Hùng, Marc Litaudon, Francoise Guéritte (2009), “Các triterpene khung oleanan ursan từ vỏ Eberhardtia urata (Sapotaceae)”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 47(1), tr.95-99 [4] Đỗ Tất Lợi (2011), Những cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Thời Đại [5] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [6] Đức Quang (2004) Cây Trâu cổ chữa bệnh, , xem 10/5/2018 [7] Trần Quốc Sơn, Đặng Văn Liếu (2013), Giáo tình sở hóa học hữu cơ, Tập 1, NXB Đại học sư phạm [8] Đặng Như Tại, Ngô Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ, Tập 1, NXB Giáo dục Việt Nam [9] Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng hóa học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [10] Đào Thị Hải Yến (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học số phân đoạn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ (Ficus pumila L.) họ dâu tằm (Moraceace) địa bàn tỉnh Phú Thọ, Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành sư phạm hóa học, Trường Đại học Hùng Vương, Phú Thọ -55- Tài liệu Tiếng Anh [11] Anshul Chawla, Ramandeep Kaur, Anil Kumar Sharma (2012), “Ficus carica Linn.: A Review on its Pharmacognostic, Phytochemical and Pharmacological Aspects”, International Journal of Pharmaceutical and Phytopharmacological Research, 1(4), pp 215-232 [12] B.S Furniss, A.J Hannaford, P.W.G Smith, A.R Tatchell (1989) Text book of practical organic chemistry, Longman Scientific Technical, New York [13] N Kiruthiga and D Sathish Sekar (2014), “Studies on Phytochemicals and Steroid Isolation from n-Hexane Extract of Anisochilus carnosus”, International Journal of Advanced Biotechnology and Research(IJBR), 5(3), pp.337-345 [14] Natália Maria Noronha, Grazielle Esteves Ribeiro, Ingridy Simone Ribeiro, Marcos José Marques, Luiz Felipe Leomil Coelho, and Jorge Kleber Chavasco (2014), “Phytochemical profile and antioxidant and antimicrobial activities of hydroethanolic extracts of Ficus pumila”, African Journal of Microbiology Research, 8(28), pp 2665-2671 [15] Vu Minh Trang, Phan Minh Giang, Phan Tong Son (2010), “Phytosterols, taraxerane triterpenoids, and flavonol glycosides from the leaves of Mallotus macrostachyus (Miq.) Muell.-Arg (Euphorbiaceae)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 48(6A), pp 11-16 [16] Pham Thi Nhat Trinh, Nguyen Huu An, Pham Ngoc An, Mai Dinh Tri, Cao Van Du, Nguyen Thi Le Thuy, Nguyen Trong Tuan, Vang Thi Kim Thoa, Nguyen Ngoc Tuan & Le Tien Dung (2017), “A new benzofuran derivative from the leaves of Ficus pumila L.”, Natural Product Research, DOI: 10.1080/14786419.2017.1395427 [17] http://www.magritek.com/products/spinsolve/nmr-spectra-examples/ [18] https://www.chromacademy.com/chromatography-Na-and-K-Adductsin-LC-MS.html -56- GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS Triệu Quý Hùng Trần Thị Thu Hà ... /n-Hexane (2 5 %) (IV): CH2Cl2 /n-Hexane (3 5 %) (V): CH2Cl2 /n-Hexane (5 0 %) (VI): CH2Cl2 /n-Hexane (7 5 %) (VII): CH2Cl2 /n-Hexane (1 00 %) (VIII): EA/Hx (5 %) (IX): EA/Hx(10 %) (X): EA/Hx(25 %) (XI): Ac/Hx(5 %). .. sau (Hình 3. 8): -33- (XI) (I), (II) (III) (IV) (V) (VI) (VII) (VIII) (IX) (X) (XIII) (XIV) (XII) Hình 3.8: Kết khảo sát TLC cặn chiết n-hexne Trâu cổ -34- Từ kết so sánh cho ta thấy chất khai triển...TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN L? ??P VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ CÂY TRÂU CỔ (Ficus pumila L. ) HỌ DÂU TẰM (Moraceace) KHÓA LUẬN TỐT