Rf= Quãng đường di chuyển của hợp chất Quãng đường di chuyển của dung môi
-18-
Đối với phương pháp sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230-400 mesh astm) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-
hexane/acetone, n-hexane/CH3COOC2H5, CH2Cl2/MeOH,… với các tỉ lệ
thích hợp.
Nguyên lý của phương pháp sắc ký cột silica gel cũng tương tự như phương pháp sắc ký lớp mỏng ở trên; phương pháp này chỉ khác là trong sắc ký cột silica gel dung môi được di chuyển từ trên đỉnh cột đi xuống và hệ dung môi được lựa chọn từ TLC sẽ được tăng dần độ phân cực hoặc có thể chỉ là một dung môi duy nhất. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ được rửa giải trước rồi đến chất có độ phân cực cao hơn.
Tùy thuộc vào lượng mẫu cần phân tích mà ta lựa chọn được cột sắc ký phù hợp với mẫu.
2.3.3 Phương pháp kết tinh
Phương pháp kết tinh là một phương pháp đơn giản nhưng rất hiệu quả để tinh chế các chất hữu cơ ở thể rắn.
Nguyên tắc của phương pháp kết tinh này là dựa vào sự khác nhau về độ tan của các chất (chủ yếu là các chất rắn) trong một dung môi thích hợp, và sự khác nhau về độ tan ở nhiệt độ khác nhau của một số chất trong dung môi đó. Việc lựa chọn dung môi cũng rất quan trọng, cần phải lựa chọn dung môi sao cho chất hữu cơ cần tinh chế tan nhiều khi đun nóng và ít tan khi để nguội, còn tạp chất thì hoặc là tan tốt hơn sản phẩm chính hoặc là tách ra từ dung dịch trước hoặc sau hẳn sản phẩm chính. Thường thường phải kết tinh lại nhiều lần và sử dụng những dung môi khác nhau [5].
2.3.4 Các phương pháp phổ
2.3.4.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR)
Hơn hai mươi năm trở lại đây cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance), thường gọi là NMR, đã trở thành công nghệ ưu việt cho sự xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Trong tất cả các phương pháp
-19-
phổ nghiệm, duy nhất NMR một loại công cụ phân tích đầy đủ và sự giải thích trọn vẹn phổ.
Các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY) để nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất được phân lập được [9].
Cơ sở lý thuyết của phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên tương tác của hạt nhân từ (1H, 13C, …) với từ trường ngoài.
Phổ cộng hưởng từ nhân proton (1H-NMR):
- Cho biết số lượng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học, H) và xác nhận các loại proton khác nhau, môi trường bao quanh mỗi proton trong phân tử.
- Vị trí của tín hiệu cho biết proton thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc một, bậc hai, bậc ba,… Các proton khác nhau này có các môi trường electron bao quanh khác nhau, và chính môi trường electron bao quanh xác định proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ.
Trên phổ 1H-NMR tín hiệu các proton được ghi nhận thông qua độ chuyển dịch hóa học ( = /0= Hz/MHz = 106 ppm), trong đó chất nội chuẩn TMS được gán = 0 ppm.