Bước 3: Chạy cột
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane (0% - 100%). Dùng pipet pasteur rửa hết phần hỗn hợp chất vừa cho lên cột còn vương lại trên miệng và thành cột, để một lớp bông mỏng lên trên mặt chất tránh khi cho dung môi lên làm xáo trộn bề mặt chất. Sau đó hứng dung dịch rửa giải khoảng 10ml vào các lọ có dung tích khoảng 15÷20ml.
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vết chất tương đương nhau trên bản mỏng. Sau đó dội cột bằng hệ dung môi MeOH. Kết quả thu được 10 phân đoạn có kí hiệu từ F1.1 ÷ F1.10 (Bảng 3.3).
-41-
Bảng 3.3. Kết quả các phân đoạn thu được từ phân đoạn F1
STT Bình
gộp Dung môi rửa giải
Phân đoạn Khối lượng (g) 1 1÷4 50 mL CH2Cl2 /n-Hexane 0% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 2% F1.1 1,5609 2 5÷6 300 mL CH2Cl2 /n-Hexane 10% 300 mL CH2Cl2 /n-Hexane 15% F1.2 0,7773 3 7÷19 550 mL CH2Cl2 /n-Hexane 20% 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 25% F1.3 14,5491 4 20÷32 250mLCH2Cl2/n-Hexane30% 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 35% F1.4 6 5 33÷39 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 40% 300 mL CH2Cl2 /n-Hexane 45% F1.5 0,5237 6 40÷48 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 50% 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 55% F1.6 0,6600 7 49÷52 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 60% 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 65% 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 70% F1.7 0,1259 8 53÷59 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 75% 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 80% F1.8 0,8578 9 60÷ 66 250 mL CH2Cl2 /n-Hexane 85% F1.9 1,3322 10 67÷77 250 ml CH2Cl2 /n-Hexane 90% 250 ml CH2Cl2 /n-Hexane 95% F1.10 10,6925
Giai đoạn 5: Phân lập các chất từ phân đoạn nhỏ F1.4 (6g)
Bước 1: Chuẩn bị cột
Cột có đường kính 2,5 cm; chiều dài 50 cm được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt:
-42-
Cân 180 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30
phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 1h.
Hình 3.14: Cột chạy silica gel Bước 2 : Đưa chất lên cột Bước 2 : Đưa chất lên cột
6 gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu F1.4) được hòa vào dung môi CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn hỗn hợp với khoảng 20 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen.Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ xung quanh cột để phần silica gel phân bố đều vào cột.
-43-