2.3.2 Phương pháp sắc ký 2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng M: Hỗn hợp chất ban đầu A, B: Các vệt chất được phân tách. Hình 2.8: Minh họa sắc ký lớp mỏng Phương pháp sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn
-17-
Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai là 1 hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng như n-hexane, CH2Cl2,
EtOAc, acetone, MeOH.
Thuốc thử hiện màu được sử dụng là ceri sulfate Ce(SO4)2, vanilin.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký silica gel nói chung là dựa trên khả năng hấp phụ khác nhaucủa các chất trên silica gel (pha tĩnh) sẽ được dung môi rửa giải (pha động) khi đi lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải hấp) ở các vị trí khác nhau trên đường đi của dung môi. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ đi lên nhanh hơn chất có độ phân cực cao hơn [5], [12].
Độ linh động của chất được đánh giá thông qua hệ số Rf.
Trong trường hợp minh họa ở hình vẽ trên: Rf(A) = lA
l ; Rf(B) = lB
l.
Hai chất A, B được coi là tách riêng khỏi nhau khi triển khai sắc ký TLC, Rf(A) ≠ Rf(B). Từ hệ dung môi khi khảo sát TLC làm cơ sở để lựa chọn hệ dung môi cho sắc ký cột silica gel.
2.3.2.2 Phương pháp sắc ký cột
Hình 2.9: Minh họa sắc ký cột
Rf= Quãng đường di chuyển của hợp chất Quãng đường di chuyển của dung môi
-18-
Đối với phương pháp sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230-400 mesh astm) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-
hexane/acetone, n-hexane/CH3COOC2H5, CH2Cl2/MeOH,… với các tỉ lệ
thích hợp.
Nguyên lý của phương pháp sắc ký cột silica gel cũng tương tự như phương pháp sắc ký lớp mỏng ở trên; phương pháp này chỉ khác là trong sắc ký cột silica gel dung môi được di chuyển từ trên đỉnh cột đi xuống và hệ dung môi được lựa chọn từ TLC sẽ được tăng dần độ phân cực hoặc có thể chỉ là một dung môi duy nhất. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ được rửa giải trước rồi đến chất có độ phân cực cao hơn.
Tùy thuộc vào lượng mẫu cần phân tích mà ta lựa chọn được cột sắc ký phù hợp với mẫu.
2.3.3 Phương pháp kết tinh
Phương pháp kết tinh là một phương pháp đơn giản nhưng rất hiệu quả để tinh chế các chất hữu cơ ở thể rắn.
Nguyên tắc của phương pháp kết tinh này là dựa vào sự khác nhau về độ tan của các chất (chủ yếu là các chất rắn) trong một dung môi thích hợp, và sự khác nhau về độ tan ở nhiệt độ khác nhau của một số chất trong dung môi đó. Việc lựa chọn dung môi cũng rất quan trọng, cần phải lựa chọn dung môi sao cho chất hữu cơ cần tinh chế tan nhiều khi đun nóng và ít tan khi để nguội, còn tạp chất thì hoặc là tan tốt hơn sản phẩm chính hoặc là tách ra từ dung dịch trước hoặc sau hẳn sản phẩm chính. Thường thường phải kết tinh lại nhiều lần và sử dụng những dung môi khác nhau [5].
2.3.4 Các phương pháp phổ
2.3.4.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR)
Hơn hai mươi năm trở lại đây cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance), thường gọi là NMR, đã trở thành công nghệ ưu việt cho sự xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Trong tất cả các phương pháp
-19-
phổ nghiệm, duy nhất NMR một loại công cụ phân tích đầy đủ và sự giải thích trọn vẹn phổ.
Các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY) để nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất được phân lập được [9].
Cơ sở lý thuyết của phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên tương tác của hạt nhân từ (1H, 13C, …) với từ trường ngoài.
Phổ cộng hưởng từ nhân proton (1H-NMR):
- Cho biết số lượng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học, H) và xác nhận các loại proton khác nhau, môi trường bao quanh mỗi proton trong phân tử.
- Vị trí của tín hiệu cho biết proton thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc một, bậc hai, bậc ba,… Các proton khác nhau này có các môi trường electron bao quanh khác nhau, và chính môi trường electron bao quanh xác định proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ.
Trên phổ 1H-NMR tín hiệu các proton được ghi nhận thông qua độ chuyển dịch hóa học ( = /0= Hz/MHz = 106 ppm), trong đó chất nội chuẩn TMS được gán = 0 ppm.
-20-
- Ngoài ra, để biết số proton cùng loại dùng cường độ tín hiệu.
- Để biết proton nào tương tác với proton nào sử dụng sự tương tác (tách vạch phổ) và hằng số tương tác spin – spin (J).
+ Sự tương tác J tạo ra sự tách vạch phổ. Sự tách vạch phản ánh môi trường bao quanh của các proton đang hấp thụ không phải đối với các electron mà đối với các proton khác ở gần bên cạnh. Khẳng định số vạch phổ được tách theo qui tắc (n+1) với n là số proton có tương tác. Cường độ các vạch phổ được tách tỉ lệ theo qui tắc tam giá Pascal.
+ Như vậy, hằng số tương tác J cho biết một cách chính xác loại thông tin về cấu trúc phân tử. Hằng số J không phụ thuộc vào từ trường cảm ứng. Giá trị hằng số J được đo bằng Hz luôn bằng nhau dù từ trường ngoài thế nào. Độ lớn của hằng số tương tác phụ thuộc vào mối liên quan cấu trúc giữa các proton có tương tác [7], [8].
Hình 2.11: Sự tách vạch phổ của propan-1-ol
Phổ cộng hưởng từ nhân carbon-13 (13C-NMR):
Tương tự như proton, là một trong các đồng vị của carbon, 13C là hạt nhân cho phổ NMR. Phổ 13C-NMR được sinh ra theo cách giống như phổ 1H- NMR [7].
Với các đồng vị 13C chỉ chiếm 1,1% hàm lượng carbon thiên nhiên, nhưng độ nhạy của phổ kế hiện đại đủ để đo phổ 13C-NMR.
-21-
Phổ 13C-NMR cho nhiều loại thông tin như 1H-NMR những thông tin trực tiếp là về khung carbon mà không có proton gắn với nó.
- Ngoài ra, số lượng tín hiệu cho ta biết có bao nhiêu nhóm carbon khác nhau hay nhóm carbon tương đương khác nhau có ở trong phân tử.
- Với sự tách vạch tín hiệu cho ta biết có bao nhiêu hiđro gắn với mỗi carbon. Phân biệt tín hiệu của carbon các bậc, nhóm CH là một vân đôi (d), ở nhóm CH2 là vân ba (t), ở nhóm CH3 là vân bốn (q), còn carbon không đính với hiđro là vân đơn (s). Trong kỹ thuật đo phổ hiện nay thường khử tương tác giữa C và H nên các carbon tương đương chỉ xuất hiện tín hiệu và 1 vạch đơn.
- Như vậy, độ chuyển dịch hóa học (C) cho biết trạng thái lai hóa (sp3, sp2,sp) của mỗi carbon, cho biết môi trường electron bao quanh mỗi carbon đối với nhau, carbon gần bên cạnh hay các nhóm chức.
Hình 2.12: Độ chuyển dịch hóa học carbon C-13
Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer): Đây là kỹ thuật ghi phổ hỗ trợ cho phổ 13C-NMR.
Sự cân bằng của các hạt nhân giữa các trạng thái spin thấp hơn và cao hơn dưới ảnh hưởng của từ trường. Sự đặt vào một xung tần số radio để tạo ra sự dư hạt nhân ở trạng thái spin cao hơn. Trong kĩ thuật DEPT, mẫu được chiếu xạ với chuỗi xung phức tạp trong cả hai kênh 13C và 1H. Kết quả của các chuỗi xung này là các tín hiệu 13C đối với các nguyên tử carbon trong
-22-
phân tử sẽ có pha khác nhau, phụ thuộc vào số nguyên tử hydro gắn vào mỗi carbon. Mỗi dạng carbon sẽ xử sự một cách khác nhau chút ít, phụ thuộc vào khoảng thời gian của các xung phức. Những khác nhau này có thể phát hiện và phổ được tạo ra trong mỗi phép thực nghiệm có thể được vẽ [7].
Để phân biệt được tín hiệu của carbon ở các bậc, nhóm CH là một vân đôi (d), ở nhóm CH2 là vân ba (t), ở nhóm CH3 là vân bốn (q), còn carbon không đính với hidro là vân đơn (s). Thông thường các máy đo phổ 13C-NMR sử dụng kỹ thuật xóa tương tác nên mỗi tín hiệu của C chỉ còn 1 vạch; trong kỹ thuật ghi phổ DEPT-90; các nhóm CH ở phía trên; trong DEPT-135 các nhóm CH, CH3 ở phía trên, CH2 ở phía dưới, C bậc 4 không xuất hiện tín hiệu trên phổ DEPT.
Hình 2.13: Minh họa phổ DEPT
Phổ COSY (1H-1H COSY, Correlation Spectroscopy):
Hiện nay có nhiều loại phổ NMR hai chiều, một số loại được dùng phổ biến là: 1H-1H COSY cho tín hiệu của các proton ở gần nhau (geminal, vicinal) tương tác với nhau từ đó xác định được các chuỗi liên kết trong phân tử.
Việc xác định các mối quan hệ tương tác là một hỗ trợ quan trọng để thiết lập sự liên kết của phân tử.
-23-
Ethylbenzene [17]
Hình 2.14: Phổ 1H-1H COSY
HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation):
Trên phổ HSQC cho tín hiệu tương tác của các proton và carbon liên kết trực tiếp với nhau; từ đó xác định được các carbon tương ứng với proton trong các nhóm CH3, CH2, CH [8].
-24-
Ethylbenzene [17]
Hình 2.15: Phổ HSQC
HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation):
Trên phổ HMBC cho tín hiệu tương tác xa giữa proton và carbon cách nhau 2 hoặc 3 liên kết (2J, 3J). Đây là loại phổ đặc biệt quan trọng giúp gắn kết các mảnh cấu trúc đặc trưng với nhau từ đó xây dựng cấu trúc phẳng của phân tử [9].
-25-
Ethylbenzene [17]
Hình 2.16: Phổ HMBC
2.3.4.2 Phương pháp phổ khối lượng
Phương pháp phổ khối lượng (MS-Mass Spectrometry) là một kĩ thuật dùng để đo đạc tỉ lệ khối lượng trên điện tích của ion, dựa trên sự ion hóa các phân tử. Các ion được phân tách dựa trên tỉ lệ khối lượng/điện tích (m/z). Một số kỹ thuật được sử dụng để ion hóa phân tử gồm phương pháp EI (Electron Impact-va chạm điện tử), ESI (Electrospray Impact-phun mù điện tử). Phương pháp ESI thường áp dụng cho các hợp chất có phân tử khối lớn và thu trên phổ đồ cho tín hiệu các ion giả phân tử như [M+H]+, [M+Na]+, [M-H2O+H]+, [M-H], …[9].
-26-
-Naphthoic acid [18]
-27-
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết n-Hexane cây Trâu cổ
Mẫu cây Trâu cổ sau khi thu hái về được rửa sạch, thái nhỏ, sau đó đem ra phơi trong bóng râm.
Hình 3.1: Mẫu Trâu cổ sau khi phơi khô
Tiến hành phơi mẫu Trâu cổ đến khi nào khô thì cho vào máy nghiền nghiền nhỏ bớt lá rồi cho vào các bình thủy tinh dung tích 5 lít để ngâm.
Ngâm mẫu trong các bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ, bình có nắp đậy (thường ngâm mẫu trong bình thủy tinh). Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây. Ở đây chúng tôi sử dụng bình tam giác thủy tinh dung tích 5 lít để ngâm mẫu.
-28-
HÌnh 3.2: Hình ảnh ngâm lá Trâu cổ bằng dung môi n-Hexane
Ngâm lần thứ nhất trong 24h sau đó chắt lọc lấy hết phần dung dịch ngâm được.
-29-
Khi lọc hết phần dung dịch của mẫu qua quá trình lọc dung dịch qua vải lại tiếp tục lọc phần dung dịch vừa lọc được đó qua quá trình lọc dung dịch qua giấy lọc.
Hình 3.4: Quá trình lọc dung dịch qua giấy lọc
Sau đó, đem dung dịch thu được đi cô đặc lại mẫu bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ 44°C, tốc độ quay trung bình 205 vòng/phút để thu được cặn dịch chiết n-hexane lá cây Trâu cổ.
-30-
Dung môi thu hồi sau lần cất quay được đựng vào các bình thủy tinh lại tiếp tục cho vào ngâm lần hai. Các bước thực hiện tương tự đối với lần hai, lần ba, lần bốn,lần 5 cũng ngâm trong 24h sau đó làm tương tự lần một. Ngâm đến khi dung dịch ngâm mẫu có màu nhạt dần thì dừng. Sau các quá trình ngâm, lọc, cất quay ta thu được 97,1 gam cặn dịch chiết n-hexane lá cây Trâu cổ (kí hiệu FPLH).
Hình 3.6: Cặn n-hexane lá cây Trâu cổ
Sau khi ngâm n–Hexane, tiếp tục ngâm lần lượt tiếp theo với EtOAc và MeOH thu được các cặn dịch chiết EtOAc, MeOH sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
-31-
Hình 3.7: Sơ đồ ngâm chiết lá cây Trâu cổ
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết n-hexane cây Trâu cổ
3.1.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi
+ Triển khai sắc ký lớp mỏng: Lấy một lượng nhỏ cặn dịch chiết n- hexane Trâu cổ hòa tan trong hỗn hợp n-hexane. Pha hệ dung môi (2 mL) rồi đổ vào bình triển khai sắc ký. Sử dụng bản mỏng với kích thước 15 mm x 40 mm. Đưa chất lên lớp mỏng bằng ống mao quản, cách đáy bản mỏng 6 mm và cách đều hai bên mép bản, để dung môi bay hết rồi đưa vào bình triển khai. Khi dung môi chạy lên cách mép trên của bản khoảng 3 mm thì lấy bản mỏng ra, sấy để dung môi bay hết.
+ Lập sắc ký đồ: Tiến hành lập sắc ký đồ trong các điều kiện sau: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng = 254 nm và 366 nm. Sau đó nhúng bản mỏng vào dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2, sấy bản mỏng, quan sát dưới ánh sáng thường.
Lá cây Trâu cổ khô
(FPL; 5,8 kg)
n-Hexane, (10L, 24h)x5
Dịch chiết n-Hexane Mẫu cây
Cặn dịch chiết
n-Hexane
(FPLH; 97,1 g)
Chưng cất
dưới áp suất giảm
Ngâm tiếp với EtOAc, MeOH
-32-
Từ các khâu triển khai sắc ký lớp mỏng, lập sắc ký đồ thấy mỗi vết tách ra trên bản mỏng có một giá trị Rf khác nhau. Dựa trên sắc ký đồ, phân tích sơ bộ thành phần chiết để biết: Số lượng chất có trong cặn chiết, đánh giá sơ bộ khả năng phân tách chất của dung môi trên silicagel.
+ Kết quả sắc ký đồ:
Hệ các dung môi được triển khai gồm:
(I): CH2Cl2/n-Hexane ( 5%) (II): CH2Cl2 /n-Hexane (10%) (III): CH2Cl2 /n-Hexane (25%) (IV): CH2Cl2 /n-Hexane (35%) (V): CH2Cl2 /n-Hexane (50%) (VI): CH2Cl2 /n-Hexane (75%) (VII): CH2Cl2 /n-Hexane (100%) (VIII): EA/Hx (5%) (IX): EA/Hx(10%) (X): EA/Hx(25%) (XI): Ac/Hx(5%) (XII): Ac/Hx(10%) (XIII): EA/ CH2Cl2 (10%) (XIV): MeOH/ CH2Cl2 (5%)
Các bản mỏng sau khi được triển khai sắc ký, hiện màu bằng đèn tử ngoại sau đó nhúng vào dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2 thu được kết quả tương ứng như sau (Hình 3.8):
-33-
(I), (II) (III) (IV)
(V) (VI) (VII)
(VIII) (IX) (X)
(XI) (XII) (XIII) (XIV)
-34-
Từ các kết quả so sánh trên cho ta thấy các chất được khai triển tốt nhất ở hệ dung môi (IV),(V),(VI),(VII),(VIII),(IX),(X),(XI),(XII),(XIII) và
(XIV). Các vệt chất đều hiện màu ở đèn tử ngoại với bước sóng =366 nm (một số vệt chất hiện màu ở cả bước sóng 254nm) và thuốc thử Ce(SO4)2.
UV-366 Ce(SO4)2
Hình 3.9: TLC cặn n-hexane Trâu cổ với hệ dung môi (VII)
Từ các bản mỏng khảo sát các vệt chất với hệ dung môi trên cho ta thấy các giá trị Rf của các vệt chất với hệ dung môi CH2Cl2 /Hexane 100% được trình bày cụ thể, rõ rệt trong Bảng 3.1
Bảng 3.1. Giá trị Rf và màu sắc các vệt chất trên bản mỏng
STT Rf Ce(SO4)2
UV
254 nm 366 nm
1 0,100 Xanh đen Nâu Hồng
2 0,325 Xanh đen Nâu (-)
3 0,613 Xanh đen (-) Trắng xanh
4 0,844 Xanh đen Nâu (-)
5 0,969 Xanh đen Nâu Vàng
(-): không hiện Rf = a/b
Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử(cm)
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết(cm)
-35- 0 < Rf < 1
Qua các sự khảo sát bản mỏng và sự hiện màu các vệt chất trong dung dịch Ce(SO4)2, ta lựa chọn hệ dung môi CH2Cl2 /Hexane 100% với độ phân cực tăng dần làm dung môi rửa giải cho cột tổng cặn n-Hexane của cây Trâu