(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu đặc tính sinh học và phân tử của chủng virus nhược độc kty prrs 04 gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HÀ VĂN THỊNH NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘC KTY PRRS - 04 GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các kết quả, số liệu nêu luận văn hoàn toàn trung thực chưa bảo vệ học vị khác Tôi cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Hà Văn Thịnh i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Quá trình học tập rèn luyện mái trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp tơi hịa thiện nhân cách trình độ chun mơn Tơi nhận quan tâm, dạy dỗ tận tình Thầy, Cơ giáo đặc biệt Thầy, Cô giáo công tác Khoa Thú y Nhân dịp hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cao học chuyên ngành Thạc sỹ thú y cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc đến Thầy, Cô giáo – người tận tình dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình tơi học tập Trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam suốt q trình tơi thực khóa luận Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô PGS TS Nguyễn Thị Lan, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Hà Nội, cô tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian thực khóa luận Đồng thời tơi xin bày tỏ biết ơn đến Thầy, Cô môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, anh chị phịng Thí nghiệm trọng điểm CNSH – khoa Thú Y (B213 – B214) nơi thực đề tài, tạo điều kiện để tơi hồn thành đề tài tốt Cuối tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người ln động viên, tạo điều kiện tốt giúp đỡ suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Hà Văn Thịnh ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài: 1.2 Mục tiêu đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn 2.1.1 Tình hình dịch PRRS giới 2.1.2 Tình hình dịch PRRS Việt Nam 2.1.3 Những nghiên cứu dịch PRRS nước 2.1.4 Những nghiên cứu dịch PRRS Việt Nam 2.2 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRSV) 2.2.1 Hình thái, cấu tạo 2.2.2 Phân loại virus PRRS 11 2.2.3 Khả gây bệnh virus PRRS 11 2.2.4 Sức đề kháng virus PRRS 11 2.2.5 Đặc tính ni cấy virus PRRS 12 2.3 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản 13 2.3.1 Đặc điểm chung 13 2.3.2 Động vật cảm nhiễm 13 2.3.3 Chất chứa mầm bệnh 13 2.3.4 Cơ chế sinh bệnh phương thức truyền lây 14 2.3.5 Triệu chứng lâm sàng lợn mắc PRRS 16 2.3.6 Bệnh tích lợn mắc PRRS 17 iii download by : skknchat@gmail.com 2.3.7 Các phương pháp chẩn đoán PRRS 18 2.3.8 Biện pháp phòng trị bệnh 20 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 22 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu 22 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23 3.1.4 Thời gian nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.2.1 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc -145 23 3.2.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc -145 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 môi trường tế bào Marc - 145 23 3.3.2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50 25 3.3.3 Xác định đường cong sinh trưởng virus PRRS qua đời cấy chuyển 25 3.3.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số hệ gen virus PRRS 25 3.3.5 Phương pháp giải trình tự Gen 28 3.3.6 Phương pháp đọc kết 30 Phần Kết thảo luận 31 4.1 Kết nghiên cứu chủng virus PRRS nghiên cứu 31 4.1.1 Kết lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu 31 4.1.2 Kiểm tra khả tạp nhiễm với loại virus khác 34 4.2 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng virus kty PRRS - 04 34 4.2.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào qua đời cấy chuyển 34 4.2.2 Kết xác định hiệu giá virus qua đời cấy chuyển 38 4.3 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS - 04 41 4.3.1 Kết tách chiết RNA tổng số chủng virus KTY – PRRS - 04 41 iv download by : skknchat@gmail.com 4.3.2 Kết giải trình tự đoạn ORF5 chủng virus KTY - PRRS - 04 42 4.3.3 Kết nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua đời cấy chuyển 45 4.3.4 Kết nghiên cứu so sánh trình tự axit amin virus KTY - PRRS - 04 qua đời cấy chuyển 48 4.3.5 Kết xây dựng sinh học phân tử 51 Phần Kết luận kiến nghị 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị 53 Tài liệu tham khảo 55 v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Aa : acid amin BED : Blue Ear disease CNSH : Công nghệ sinh học CPE : Cyto Pathogenic Effect Cs : Cộng DMEM : Dulbecco,s Modified Eagle Medium ELISA : Enzyme Immunosortbent Linking Assay EVA : Equine virus FCS : Fetal Calf Serum IFA : Indirect Immunofluoresence Assay kDa : Kilodalton LDHV : Lactate Dehydlogenase – elevating virus MK : Monkey kidney cell MSD : Mistery Swine Disease OIE : Tổ chức thú y giới ORF : Open reading frame (khung đọc mở) PAM : Pulmnary alveolar macrophage PEARS : Porcine Endemic abortion and Respiratory syndrome PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus RNA SHFV L1 : Ribonucleic acid : Simian hemorrhaghic fever virus : Lần vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Protein cấu trúc PRRSV 10 Bảng 2.2 Sức đề kháng virus với điều kiện ngoại cảnh 12 Bảng 3.1 Thành phần thể tích cho phản ứng RT-PCR 27 Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR 27 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT-PCR 27 Bảng 4.1 Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập 31 Bảng 4.2 Kết chẩn đoán RT-PCR lợn nghi mắc PRRS 33 Bảng 4.3 Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu 34 Bảng 4.4 Kết xác định có mặt virus PRRS, CSF, FMD, PED TGE 34 Bảng 4.5 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào chủng virus KTY - PRRS - 04 qua đời 35 Bảng 4.6 Hiệu giá chủng virus KTY – PRRS – 04 thời điểm thu hoạch 38 Bảng 4.7 Hiệu giá chủng virus KTY - PRRS – 04 qua đời cấy chuyển 40 Bảng 4.8 Sai khác vị trí nucleotide đời chủng PRRS nghiên cứu 47 Bảng 4.9 So sánh tương đồng nucleotide virus KTY - PRRS – 04 đời cấy chuyển 47 Bảng 4.10 Sai khác vị trí axit amin đời chủng KTY - PRRS - 04 50 Bảng 4.11 So sánh tương đồng axit amin virus PRRS – 04 đời cấy chuyển 50 vii download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ lịch sử xuất PRRS giới Hình 2.2 Cấu trúc hạt PRRS virus Hình 2.3 Cấu trúc gen PRRS virus Hình 2.4: Bộ gen virus PRRS 10 Hình 2.5 Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào 14 Hình 4.1 Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus 36 Hình 4.2 Bệnh tích tế bào sau 36 gây nhiễm 36 Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 48 gây nhiễm 37 Hình 4.4 Bệnh tích tế bào sau 60 gây nhiễm 37 Hình 4.5 Bệnh tích tế bào sau 72 gây gây nhiễm 37 Hình 4.6 Đường cong sinh trưởng virus KTY – PRRS - 04 39 Hình 4.7 Log10 hiệu giá chủng virus KTY - PRRS – 04 qua đời cấy chuyển 40 Hình 4.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số 42 Hình 4.9 Kết phản ứng RT-PCR với mồi ORF5 43 Hình 4.10 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 chủng KTY-PRRS-04 đời cấy chuyển thứ 10 44 Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide chủng KYT-PRRS-04 đời cấy chuyển 46 Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin chủng KTY-PRRS-04 đời cấy chuyển 49 Hình 4.13 Cây sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS - 52 viii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hà Văn Thịnh Tên luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus nhược độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn” Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đề tài nhằm mục đích đánh giá ổn định số đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus cường độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn, qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 Phương pháp nghiên cứu Bằng phương pháp nghiên cứu: nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 môi trường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinh trưởng virus PRRS qua đời cấy truyền; tách chiết RNA tổng số hệ gen virus PRRS; RT-PCR; phương pháp giải trình tự Gen Kết kết luận Đặc tính sinh học chủng virus KTY - PRRS - 04: Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus nghiên cứu có tính ổn định cao qua đời cấy chuyển mơi trường Marc-145 Chủng virus PRRS có hiệu giá cao ổn định, có khả phát triển nhân lên tốt môi trường tế bào Marc-145 Hiệu giá virus thu cao thời điểm 72 sau gây nhiễm Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS - 04: Xác định trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng virus sau đời cấy chuyển liên tục Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 chủng virus KTY - PRRS - 04 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin protein kháng nguyên GP5 Trình tự nucleotide axit amin đoạn gen ORF5 chủng nghiên cứu qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 tương đối ổn định, mức độ tương đồng nucleotide từ 98,15% đến 100%; axit amin từ 96,88% đến 100% ix download by : skknchat@gmail.com Hình 4.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số (Theo thứ tự từ trái sang phải kết tách chiết RNA tổng số chủng KTY – PRRS – 04 đời P0, P10, P20, P30, P40) Qua hình ảnh điện di cho thấy có lượng lớn RNA thu sau tiến hành tách chiết, biểu vệt sáng thu chụp ảnh máy chụp ảnh gel RNA giữ Ethidiumbromide lại thạch tác dụng tia UV thuốc nhuộm này phát màu sáng Đồng thời RNA tách chiết có độ nguyên vẹn cao biểu thị vạch sáng, RNA tích điện âm nên điện trường chúng chạy cực dương Nếu phổ điện di RNA tách chiết hình cho nhiều dải băng (nhiều vạch sáng) chứng tỏ chiết tách chúng bị gãy đoạn nhiều Phổ điện di gọn chứng tỏ RNA chiết tách bị đứt gãy Như vậy, trình tách chiết RNA tổng số chủng virus KTY – PRRS – 04 qua đời cấy chuyển thành công, cung cấp nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR 4.3.2 Kết giải trình tự đoạn ORF5 chủng virus KTY - PRRS - 04 * Kết phản ứng RT-PCR Sản phẩm RNA tổng số chủng virus KTY - PRRS – 04 thu tách chiết khuếch đại kỹ thuật RT-PCR với tham gia enzyme chép ngược (Reverse Transcriptase) sử dụng cặp mồi ORF5 (đã trình bày phần phương pháp nghiên cứu) có khả phát virus PRRS thuộc chủng Bắc Mỹ chủng Châu Âu (cặp mồi cho phép xác định đoạn gen virus 42 download by : skknchat@gmail.com PRRS có kích thước 683bp) để tạo đoạn DNA hoàn chỉnh (cDNA) Sản phẩm cDNA sau khuếch đại máy PCR điện di chụp ảnh Kết phản ứng RT-PCR xác định PRRSV trình bày hình 4.9 Hình 4.9 Kết phản ứng RT-PCR với mồi ORF5 [Virus KTY - PRRS - 04 phát phản ứng RT-PCR với độ dài gen 683bp, thang chẩn M 100bp, giếng từ 1-5 mẫu đời virus KTY - PRRS - 04 (lần lượt từ phải qua trái P0, P10, P20, P30, P40), giếng đối chứng âm, giếng đối chứng dương (virus PRRS)] Sản phẩm điện di cho vạch DNA tương ứng với 683bp theo thiết kế mồi Kết tạo DNA chủng KTY- PRRS- 04 qua đời cấy chuyển thành công Như chúng tơi khẳng định xác có mặt virus Kết giải trình tự gen đời cấy chuyển Sau tiến hành kỹ thuật RT-PCR thu sản phẩm tiến hành tinh sản phẩm phản ứng RT-PCR kít để loại bỏ hết thành phần dư thừa sau phản ứng Sản phẩm sau tinh DNA virus cloning với loại mồi đơn (mồi xuôi mồi ngược) để nhân nhanh số lượng theo chiều đoạn gene Tinh sản phẩm phản ứng PCR giải trình tự kit cung cấp nhà sản xuất, sau tiến hành giải trình tự gene Quá trình giải trình tự thực nhờ vào máy giải trình tự Beckman coulter CEQ 8000 Mỹ phòng 43 download by : skknchat@gmail.com Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú Y – Khoa Thú Y Kết biểu thị chương trình Geneetyx trình bày minh họa hình 3.9 Hình 4.10 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 chủng KTY-PRRS-04 đời cấy chuyển thứ 10 Qua hình 4.10 cho thấy chất lượng giải trình tự tương đối tốt, đỉnh màu giản đồ thể loại nucleotide, loại nucleotide khác tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác đọc tia laser cho hiển thị màu tương ứng Adenine cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, 44 download by : skknchat@gmail.com Guanine cho màu xanh cây, Cytosine cho màu đen Sau giải trình tự, chuỗi nucleotide thu xử lý phần mềm phân tích máy tính Như việc tách chiết RNA tổng số, trình thực RT-PCR giải trình tự thực thành cơng Trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng qua đời nghiên cứu xác định 4.3.3 Kết nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua đời cấy chuyển Để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS 04 Chúng tơi tiến hành giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng virus nghiên cứu đời cấy chuyển thứ 10, 20, 30, 40 Để xác định tương đồng nucleotide đời cấy chuyển, qua thấy cụ thể mức độ biến đổi thành phần, trật tự nucleotide biến đổi cấu trúc gen chủng virus KTY - PRRS - 04 qua đời cấy chuyển Chuỗi gen mà chúng tơi tiến hành giải trình tự thành cơng có kích thước 603bp dùng làm chuỗi truy cập chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế nhằm tìm kiếm chuỗi đích đăng ký ngân hàng gen dựa vào mức độ tương ứng nucleotide Kết so sánh trình tự nucleotide chủng qua đời nghiên cứu xử lý phần mềm Genetyx thể hình 4.11 45 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide chủng KYT-PRRS-04 đời cấy chuyển Qua hình 4.11 chúng tơi thấy trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng PRRSV đời nghiên cứu có độ dài 603bp Kết so sánh cho thấy thành phần nucleotide đời cấy chuyển chủng virus khơng có thay đổi có thay đổi khơng đáng kể khác từ đến nucleotide, cụ thể sau: - Đời P0 P10 có trình tự nucleotide giống - Đời P20, P30 P40 có trình tự nucleotide giống Sự sai khác diễn đời cấy chuyển thể bảng 4.8 46 download by : skknchat@gmail.com Bảng 4.8 Sai khác vị trí nucleotide đời chủng PRRS nghiên cứu STT Vị trí sai khác P0 P10 P20 P30 P40 97 A A G G G 135 A A G G G 168 A A G G G 177 A A T T T 280 C C G G G 287 G G T T T 351 A A G G G 405 T T C C C 490 G G A A A 10 519 C C G G G 11 587 A A T T T Qua bảng 4.8 cho thấy, sai khác vị trí nucleotide 603 nucleotide theo thứ tự trình tự thu nhận chủng virus KTY - PRRS – 04 đời P0 P10 so với đời P20, P30 P40 11 vị trí sau 97 (A ↔ G); 135 (A ↔ G); 168 (A ↔ G); 177 (A ↔ T); 280 (C ↔ G); 287 (G ↔ T); 351 (A ↔ G); 405 (T ↔ C); 490 (G ↔ A); 519 (C ↔ G); 587 (A ↔ T) Từ kết giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng PRRS nghiên cứu đời cấy chuyển tiến hành thu thập xử lý chương trình MEGA5 để so sánh mức độ tương đồng nucleotide đời cấy chuyển Kết thể bảng 4.9 Bảng 4.9 So sánh tương đồng nucleotide virus KTY - PRRS – 04 đời cấy chuyển P0 - ORF5 P10 - ORF5 P20 - ORF5 P30 - ORF5 P0 - ORF5 100,00 P10 - ORF5 100,00 100,00 P20 - ORF5 98,15 98,15 100,00 P30 - ORF5 98,15 98,15 100,00 100,00 P40 - ORF5 98,15 98,15 100,00 100,00 47 download by : skknchat@gmail.com P40 ORF5 100,00 Qua bảng 4.9 cho thấy: - Mức độ tương đồng nucleotide đoạn gen ORF5 đời P0 P10 100%; đời P20, P30 P40 100% - Độ tương đồng nucleotide đoạn gen ORF5 đời P0 P10 so với đời P20, P30 P40 98,15% Như vậy, sau cấy chuyển qua 40 đời chủng virus KTY - PRRS 04 tương đồng nucleotide đạt tỷ lệ cao 4.3.4 Kết nghiên cứu so sánh trình tự axit amin virus KTY - PRRS - 04 qua đời cấy chuyển Những sai khác trình tự nucleotide ba mã hóa dẫn đến sai khác thành phần axit amin (cứ nucleotide mã hóa cho axit amin- nucleotide gọi mã hóa) nhiên có thay đổi nucleotide mà khơng dẫn đến thay đổi axit amin số axit amin nhiều ba nucleotide mã hóa Chính vậy, đơi sai khác nucleotide lại không dẫn đến sai khác axit amin nên không làm thay đổi cấu trúc protein mã hóa gen Tuy nhiên, có sai khác nucleotide dẫn đến sai khác mã hóa hệ sai khác axit amin thay đổi tính chất protein tạo axit amin nguyên nhân phát sinh biến dị di truyền thay đổi tính gây bệnh virus Để nghiên cứu tồn diện đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS – 04 sau xác định trình tự nucleotide cần xác định tiếp thành phần axit amin đoạn gen để có kết xác biến đổi mức độ phân tử chủng virus KTY - PRRS – 04 qua đời cấy chuyển Từ trình tự nucleotide đoạn gen thu được, tiến hành xác định trình tự axit amin đoạn gen ORF5 dựa mã vi khuẩn bậc thấp (bacterial code) có ngân hàng gen so sánh trình tự axit amin chủng virus KTY - PRRS - 04 qua đời cấy chuyển Kết so sánh trình bày hình 4.12 48 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin chủng KTY-PRRS-04 đời cấy chuyển Qua hình 4.12 chúng tơi thấy trình tự axit amin đoạn gen ORF5 chủng virus KTY - PRRS – 04 đời nghiên cứu có kích thước 200 axit amin Cũng giống với trình tự nucleotide, trình tự axit amin đoạn gen ORF5 chủng virus KTY - PRRS – 04 đời P0 P10 giống nhau; đời P20, P30 P40 giống Sự sai khác diễn đời P0, P10 so với đời P20, P30, P40 thể bảng 4.10 49 download by : skknchat@gmail.com Bảng 4.10 Sai khác vị trí axit amin đời chủng KTY - PRRS - 04 STT Vị trí sai khác P0 P10 P20 P30 P40 33 N N D D D 59 K K N N N 94 P P A A A 96 G G V V V 164 G G R R R 196 Q Q L L L Qua bảng 4.10 chúng tơi thấy, sai khác trình tự axit amin chủng KTY - PRRS – 04 đời đời P0 P10 so với đời P20, đời P30 đời P40 vị trí gồm axit amin thứ 33 (N ↔ D); axit amin thứ 59 (K ↔ N); axit amin thứ 94 (P ↔ A); axit amin thứ 96 (G ↔ V); axit amin thứ 164 (G ↔ R); axit amin thứ 196 (Q ↔ L) Từ kết so sánh cho thấy thành phần axit amin đời cấy chuyển chủng virus khơng có thay đổi có thay đổi khơng đáng kể Kết giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng virus KTY - PRRS - 04 trình tự axit amin tương ứng xác định, thu thập sử dụng chương trình genetyx để so sánh tỷ lệ đồng thành phần axit amin chủng v iru s KTY - PRRS - 04 qua đời cấy chuyển Kết trình bày bảng 4.11 Bảng 4.11 So sánh tương đồng axit amin virus KTY - PRRS – 04 đời cấy chuyển P0 - ORF5 P10 - ORF5 P20 - ORF5 P30 - ORF5 P40 - ORF5 P0 - ORF5 100,00 P10 - ORF5 100,00 100,00 P20 - ORF5 96,88 96,88 100,00 P30 - ORF5 96,88 96,88 100,00 100,00 P40 - ORF5 96,88 96,88 100,00 100,00 50 download by : skknchat@gmail.com 100,00 Qua bảng 4.11 cho thấy sau cấy chuyển qua 40 đời chủng virus KTY - PRRS - 04 tương đồng axit amin đạt tỷ lệ cao Cụ thể, mức tương đồng trình tự axit amin đoạn gen ORF5 P0 P10 100%; đời P20, P30 P40 100%; đời P0 P10 so với đời P20, đời P30, đời P40 96,88% Tóm lại, từ kết phân tích thành phần nucleotide, axit amin so sánh đời cấy chuyển chủng virus nghiên cứu chúng tơi nhận thấy trình tự nucleotide axit amin đời cấy chuyển sai khác có sai khác khơng đáng kể Điều chứng tỏ chủng virus KTY - PRRS – 04 có ổn định đặc tính di truyền đời cấy chuyển 4.3.5 Kết xây dựng sinh học phân tử Qua việc so sánh mức độ tương đồng nucleotide axit amin chủng virus PRRS phân lập chủng tham chiếu, tiến hành xây dựng sinh học phân tử để xác định nguồn gốc phát sinh chủng virus KTY - PRRS - 04 Kết phân tích nguồn gốc phát sinh chủng PRRS nghiên cứu trình bày hình 4.13 Từ kết so sánh thành phần nucleotide axit amine chủng virus K T Y - PRRS - 04 Dựa chương trình ClustalW chúng tơi tiến hành xác định nguồn gốc phát sinh chủng PRRSV nghiên cứu để phân tích nguồn gốc phát sinh chủng PRRS nghiên cứu Kết phân tích nguồn gốc phát sinh cho thấy: Chủng virus K T Y - PRRS - 04 nằm nhánh phát sinh với chủng virus 374KTY, 352KTY, HTP0, nằm nhánh phát sinh khác với chủng 171KTY thuộc nhánh chủng virus PRRS Trung Quốc (GU980186) Chủng v i r u s nghiên cứu không nằm nhánh phát sinh chủng virus Bắc Mỹ VR-2332 nhánh Châu Âu -Lelystad Điều phù hợp với kết nghiên cứu trước sai khác nucleotide axit amin chủng virus với Các chủng virus PRRS Singapore, Thái Lan đưa vào phả hệ Tuy nhiên, chúng không nằm nguồn gốc phát sinh với chủng virus KTY - PRRS - 04 51 download by : skknchat@gmail.com Như vậy, lập sơ đồ phả hệ phân tích nguồn gốc phát sinh nghiên cứu so sánh với số chủng khu vực giới dựa trình tự chuỗi gen ORF5 cho thấy Chủng v i r u s K TY - P R R S - có nguồn gốc phát sinh với chủng PRRSV Trung Quốc, không nguồn gốc phát sinh với chủng VR-2332 EF488048China 171 20 Vaccine GU980185 TRICHOTOMY 52 GU980186 33 HTP1TY 87 347KTY 86 24 352-KTY 26 KTY – PRRS - 04 GU980179China GU980182China 27 AF184212Sing 100 100 70 DQ489311Eur 96 100 Lelystad 50 AF176463USA 39 AF046869USA 100 100 AF176461USA 78 73 AF176348 VR-2332 46 AF066183 94 DQ056373Thailand Hình 4.13 Cây sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS - 04 52 download by : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu Phịng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y, chúng tơi thu số kết luận đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus KTY – PRRS - 04 sau: Đặc tính sinh học chủng virus KTY – PRRS - 04 sau 40 đời cấy chuyển: 1.1 Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus nghiên cứu có tính ổn định cao qua đời cấy chuyển môi trường Marc-145 1.2 Chủng virus PRRS có hiệu giá cao ổn định, có khả phát triển nhân lên tốt môi trường tế bào Marc-145 Hiệu giá virus thu cao thời điểm 72 sau gây nhiễm Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-04 sau 40 đời cấy chuyển: 2.1 Xác định trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng virus sau đời cấy chuyển liên tục Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 chủng virus KTY-PRRS-04 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin protein kháng nguyên GP5 2.2 Trình tự nucleotide axit amin đoạn gen ORF5 chủng nghiên cứu qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 ổn định, mức độ tương đồng nucleotide từ 98,15 đến 100%; axit amin từ 96,88 đến 100% 5.2 KIẾN NGHỊ Để góp phần hồn thiện đề tài nghiên cứu mong muốn: Triển khai thực đề tài phạm vi rộng nghiên cứu với nhiều chủng PRRS nhằm thu kết toàn diện hơn, đánh giá chủng gây bệnh chủ yếu nước ta Tiếp tục nghiên cứu để giải trình tự gen đoạn gen lại virus PRRS tiến tới giải trình tự tồn hệ gen virus phát biến chủng để chế tạo vacxin có hiệu phịng bệnh cao Việc sản xuất vacxin phòng bệnh virus PRRS gây Việt Nam giới vấn đề cấp bách Kết nghiên cứu 53 download by : skknchat@gmail.com gen ORF5 virus PRRS qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc145 mà thu nhận sở liệu sinh học phân tử cho nghiên cứu vacxin phòng bệnh PRRS gây Chủng virus KTY - PRRS - 04 có nguồn gốc phát sinh với chủng PRRSV Trung Quốc, không nguồn gốc phát sinh với chủng VR-2332 54 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn (2007), Hướng dẫn phịng chống hội chứngRối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS) Cục Thú Y (2007), Báo cáo Hội thảo khoa học phịng chống hội chứng Rối loạn hơ hấp sinh sản lợn, ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007), “Một số hiểu biết virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấpsinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007), “Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội Lê Văn Năm (2007), “Kết khảo sát bước đầu biểu lâm sàng bệnh tích đại thể bệnh PRRS số địa phương thuộc đồng Bắc Bộ Việt Nam”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Văn Thanh (2007), “Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS)”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội William T.Christianson Han Soo Joo (2001), Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS), Tạp chí KHKT Thú y, tập VIII - số – 2001, tr 74 - 86 Kết nghiên cứu chủng PRRSV cường độc Trung Quốc(Tian Kegong, Trung tâm kiểm soát dịch bệnh động vật Trung Quốc Bản dịch TS Nguyễn Hữu Nam cộng sự) II TÀI LIỆU TIẾNG ANH Done SH, Paton DJ, White ME (1996), “Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS”: a revew, with emphasis on pathological, virological and diagnostic aspects Br Vet J 152, pp 153 – 174 Forsberg, R., Storgaard, T., Nielsen, H.S., Oleksiewicz, M.B., Cordioli, P., Sala, G., Hein, J., Botner, A., 2002 The genetic diversity of European type PRRSV is 55 download by : skknchat@gmail.com similar to that of the North American type but is geographically skewed within Europe Virology 299, 38–47 Kim, H.S., Kwang, J., Joo, H.S and Frey, M.L 1993 Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line Arch Virol., 133:477-483 Gao, Z.Q., Guo, X., Yang, H.C., 2004 Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus Archives of Virology 149, 1341-1351 OIE, Porcinereproductive and respiratory syndrome (PRRS), chapter 2.6.5, www.oie.int Frederick A.Murphy, E.Paul J.Gibbs, Marian C.Horzinek, Michael J.Studdert, “Veterinary virology (Third edition), chapter 34 Arteriviridae” Nelsen CJ, GenBank, (1998), ‘‘Porcine reproductive and respiratory syndrome virus RespPRRS MLV”, complete genome, May 15 Suazez P (2000), “Utrastructure pathogenesis of PRRS virus”, Vet Res 31, pp 47 – 55 Key, K.F., Haqshenas, G., Guenette, D.K., Swenson, S.L., Toth, T.E., Meng, X.J., 2001 Genetic variation and phylogenetic analyses of the ORF5 gene of acute porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates Veterinary Microbiology 83, 249–263 10 Meng XJ, Paul PS, Halbur PG, Lum MA (1995), ‘‘ Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A and Europe”, Arch Virol 140:745-755 11 Tian K, Yu, Zhao, (2007), “Emergence of fatal PRRS variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark”, PLoS ONE (6), e526 doi: 10.137l/jouARNl Pone.0000526 56 download by : skknchat@gmail.com ... TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hà Văn Thịnh Tên luận văn: ? ?Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus nhược độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn? ?? Ngành:... thực tiễn tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus nhược độc KTY - PRRS - 04 gây hội chứng rối loạn Hô hấp sinh sản lợn? ?? download by : skknchat@gmail.com... 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Đánh giá ổn định số đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus nhược độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn qua đời cấy chuyển môi trường tế bào