Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc - 145
* Chuẩn bị tế bào Marc 145
- Gọi tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường DMEM bổ sung 5% FCS làm ấm trong tủ 370C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và
Bước 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FCS, chuyển tế bào và bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường DMEM + 5% FCS. Đóng chặt bình nuôi cấy lại, ghi tên tế bào và ngày gọi dậy lên nắp bình nuôi cấy.
Bước 4: Giữ tế bào ở tủ ấm 370C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự phát
triển của tế bào. Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình nuôi cấy mới.
- Cấy chuyển tế bào
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin-EDTA. Thêm 7ml môi
trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ Trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn
màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml
môi trường đầy đủ. Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong
môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/bình T75).
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5% CO2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
* Gây nhiễm virus KTY - PRRS - 04
Khi tế bào một lớp Marc-145 (tế bào phủ kín thành một lớp trên bề mặt nuôi cấy, không chồng chéo lên nhau) trong giếng đã chuẩn bị cho việc tiến hành gây nhiễm mọc kín hầu hết mặt giếng nuôi thì hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100µl mẫu đã chuẩn bị. Hỗn dịch virus tế bào được ủ ở 370C với 5% CO2 trong 60 phút.
Bổ sung 1,5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các giếng nuôi và ủ ở 370C với 5% CO2.
Hằng ngày theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi nổi vào các thời điểm 24, 36, 48, 60 và 72 giờ sau khi gây nhiễm.
* Thu virus
- Hằng ngày theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi nổi, chụp ảnh tế bào, thu virus khi chúng phá hủy 80-90% tế bào gây nhiễm.
- Chủng virus được bảo quản trong tủ -80°C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.