Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3. 2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50
3.3.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS
RNA tổng số là toàn bộ RNA được tách chiết từ mẫu nghiên cứu. Muốn thu RNA thì cần loại bỏ DNA, vì nếu lẫn DNA trong hỗn hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả RT-PCR. RNA tổng số này có thể bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt động (tRNA, mRNA) của tế bào và virus. Mục
đích là thu nhận được RNA của hệ gen virus PRRS đạt hàm lượng cao, đảm bảo đủ làm khuôn cho RT-PCR.
Tách chiết RNA virus bằng Kit QIAgen
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit.
Bước 1: Hút 560µl Buffer AVL vào ống Eppendorf loại 1,5ml.
Bước 2: Thêm 140µl dung dịch mẫu đã xử lý là hỗn dịch (chứa virus và
dung dịch PCS cho vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm) vào ống Eppendorf trên, sau đó vortex trong 15 giây.
Bước 3: Spin down
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 5: Thêm 560 µl dung dịch Ethanol (96% - 100%) vào ống, vortex 15 giây
và Spin down để loại bỏ các giọt trên nắp.
Bước 6: Hút 630µl huyễn dịch trên sang cột QIAamp spin (cột lọc). Ly tâm
8000 vòng/phút, trong 2 phút, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới ống.
Bước 7: Lặp lại bước 6 một lần nữa với phần mẫu còn lại.
Bước 8: Thêm 500µl dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng/phút, trong 2 phút
rồi giữ cột, bỏ nước dưới.
Bước 9: Thêm 500µl dung dịch AW2, ly tâm 14000 vòng/phút, trong 3
phút, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới cột. Sau đó ly tâm lại thêm một lần nữa 14000vòng/phút,trong 1phut để loại bỏ hoàn toàn AW2.
Bước 10: Đặt cột QIA vào ống eppendort 1,5ml mới, thêm 60ml dung dịch
AVE để ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Sau đó ly tâm 8000 vòng, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới. Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -80°C.
* Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR
Mẫu ARN sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT-PCR theo bộ Kit one-step Invitrogen với các thành phần được trình bày dưới bảng 3.1
Bảng 3.1. Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCRThành phần phản ứng Thể tích cần lấy(µl) Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy(µl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Primer Forwad 0,5 Primer reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Tổng thể tích 25
Các cặp mồi dùng cho phản ứng RT-PCR bao gồm có mồi xuôi và mồi ngược nhằm khuếch đại đoạn gen ORF5 có kích thước 603bp của PRRSV, được trình bày dưới bảng 3.2.
Bảng 3.2. Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR
Trình tự nucleotid của đoạn mồi Kích thước
Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC
603 bp Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT-PCR
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 5 phút 2 Duỗi mạch 95 15 giây 35 Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
* Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm
Kỹ thuật điện di được sử dụng trong phân tích định tính, định lượng, thu nhận, tách các acid nucleic và protein từ một hỗn hợp mẫu.
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Người ta thường sử dụng 2 loại thạch để điện di là Agarose và Polyacrylamid. Hai loại thạch này được hòa tan trong dung dịch đệm là TBE hoặc TAE, trong nghiên cứu này sử dụng thạch agarose và dung dịch đệm TAE để tạo bản gel.
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TAE 1 x hòa tan với 1,5 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong 5 phút, đợi tới khi thạch nguội (khoảng 500C – 600C) cho thêm 3µl Ethidium Bromide rồi đổ vào khuôn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng kiểm tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TAE ngập bản gel khoảng 3-5mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT-PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6µl DNA marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di bản gel được lấy ra nhuộm Ethydium bromide hoặc SYBR green trong khoảng từ 5-7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng các vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.