4.1.1. Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu
Để thực hiện được đề tài chúng tôi tiến hành thu thập mẫu của các lợn nghi mắc PRRS trên cơ sở theo dõi khi có dịch xảy ra, kết hợp thu thập các thông tin của cán bộ thú y, chủ trại tại ổ dịch tại tỉnh Bắc Giang năm 2014. Tiến hành xác định một số triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn nghi mắc PRRS làm cơ sở cho việc thu thập mẫu cho nghiên cứu. Số mẫu thu thập được chúng tôi trình bày tại bảng 4.1.
Bảng 4.1. Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được
TT Nhóm lợn Số lượng (con) Triệu chứng lâm sàng chủ yếu
1 Lợn con theo mẹ 10 Sốt, bỏ bú, có rử mắt, tiêu chảy 2 Lợn sau cai sữa 7 Sốt, bỏ ăn, phát ban
3 Lợn choai 6 Sốt, khó thở, tím tai, sưng mí mắt 4 Nái mang thai 4 Sốt, bỏ ăn, sảy thai, tím tai 5 Nái nuôi con 3 Sốt, bỏ ăn, viêm vú
Tổng số 30
Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của các lợn mắc Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản, chúng tôi thấy rằng: triệu chứng lâm sàng của lợn rất thay đổi, phụ thuộc vào các chủng virus, trạng thái miễn dịch của đàn, cũng như điều kiện quản lý chăm sóc. Theo dõi trên các nhóm lợn khác nhau chúng tôi thấy:
Các biểu hiện chính của lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản gồm: sốt, chán ăn, bỏ ăn, phát ban, sưng mí mắt, khó thở, những biểu hiện này thường gặp ở hầu hết các nhóm lợn. Bên cạnh đó, ở mỗi nhóm lợn khác nhau có những biểu hiện không giống nhau cụ thể:
* Lợn con theo mẹ
Các biểu hiện lâm sàng chung như sốt, bỏ bú, sưng mí mắt chiếm tỉ lệ cao. Kết quả quan sát còn cho thấy tiêu chảy và táo bón là các biểu hiện thường gặp ở nhóm lợn này. Lý giải cho hiện tượng này chúng tôi cho rằng do bộ máy tiêu hoá của lợn con chưa hoàn chỉnh nên khi bị virus tác động ngoài gây tổn
thương về hệ hô hấp sẽ gây rối loạn tiêu hoá. Quan sát chúng tôi còn nhận thấy một số lượng ít lợn thường bị xù lông, chảy nước mũi, viêm khớp, run rẩy, đi đứng siêu vẹo.
* Lợn sau cai sữa
Biểu hiện lâm sàng của lợn sau cai sữa cũng giống biểu hiện lâm sàng của các nhóm lợn con theo mẹ và lợn choai, tuy nhiên tỷ lệ biểu hiện của từng chỉ tiêu lại khác nhau. Chiếm tỉ lệ cao nhất là sốt, chán ăn, bỏ ăn, hiện tượng khó thở cao nhất trong các nhóm lợn nghiên cứu. Giải thích cho sự khác biệt này chúng tôi cho rằng lợn sau cai sữa nhu cầu trao đổi chất cao dẫn đến nhu cầu oxi tăng lên, trong khi đó phổi viêm làm cho lợn càng khó thở hơn. Các triệu chứng lâm sàng khác như phát ban, mí mắt sưng, tai xanh cũng luôn chiếm một tỉ lệ cao trong các lợn mắc bệnh.
Trong quá trình quan sát chúng tôi thấy có sự liên hệ giữa biểu hiện phát ban và tím tai, ở hầu hết những lợn có hiện tượng phát ban thì sau một thời gian tai bắt đầu tụ máu và dần dần tím lại, kéo dài cho đến khi lợn chết.
Hiện tượng tiêu chảy và táo bón ở nhóm lợn này chiếm tỉ lệ thấp. Trong các trường hợp ghép với những bệnh khác có thể thấy lợn có các biểu hiện: thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, hắt hơi, thở nhanh, chảy nước mắt.
* Lợn choai
Quan sát những triệu chứng lâm sàng trên nhóm lợn này chúng tôi thấy, lợn choai mắc PRRS sốt cao, tỉ lệ lợn chán ăn, bỏ ăn thấp hơn lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa. Có thể trong giai đoạn này sức đề kháng của lợn cao hơn nên mặc dù mắc bệnh nhưng lợn vẫn ăn uống bình thường.
Hiện tượng khó thở thể hiện rõ, lợn thở thể bụng, tần số hô hấp tăng, nhiều con khó thở phải há mồm, ngồi thở như chó ngồi nhất là trong những ngày có thời tiết nóng, giai đoạn cuối của bệnh lợn thở hắt ra, đôi khi lợn có biểu hiện chảy nước mũi.
Lợn choai mắc PRRS các triệu chứng lâm sàng thường kéo dài và không phân biệt rõ ràng do lợn bệnh thường mắc các bệnh kế phát khác.
* Lợn nái mang thai
Lợn mắc bệnh có các triệu chứng kéo dài phổ biến nhất vẫn là sốt, chán ăn, bỏ ăn. Hiện tượng tiêu chảy ít gặp nhất ở lợn nái mang thai. Chúng tôi cho rằng giai đoạn này lợn được chăm sóc cẩn thận, chế độ dinh dưỡng hợp lý, sức
đề kháng tốt nên ít bị tiêu chảy. Các biểu hiện như phát ban, sưng mí mắt, tai xanh cũng thấp hơn các nhóm lợn khác. Lợn nái có chửa thường bị sảy thai, ở những lợn có chửa dưới 2,5 tháng thì tỷ lệ sảy thai cao, ở những lợn có chửa trên 2,5 tháng có hiện tượng thai chết lưu, thai gỗ, đẻ sớm, lợn con đẻ ra yếu ớt tỷ lệ tử vong cao có thể lên tới 70%.
* Lợn nái nuôi con
Các biểu hiện của nhóm lợn này cũng tương tự nhóm lợn nái mang thai, tuy nhiên tỉ lệ tím tai và táo bón thấp hơn ở lợn nái mang thai. Đáng chú ý là viêm vú, mất sữa chiếm tỉ lệ rất cao 80%. Quan sát chúng tôi thấy lợn mắc PRRS thường mất sữa, viêm vú, viêm tử cung, động dục lẫn lộn. Nếu bệnh kéo dài không điều trị kịp thời kết phát sang viêm phổi nặng, lợn sẽ chết.
Kết quả nghiên cứu về triệu chứng lâm sàng của lợn mắc Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trong nghiên cứu của chúng tôi tương đối phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoa (2011) khi tác giả nghiên cứu về các triệu chứng của lợn mắc Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản tại cùng phụ cận Hà Nội.
Từ các mẫu lợn nghi mắc PRRS được thu thập qua chẩn đoán lâm sàng, chúng tôi chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR để xác định chính xác PRRSV. Kết quả chẩn đoán RT-PCR các lợn nghi mắc PRRS được trình bày ở bảng 4.2
Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán RT-PCR các lợn nghi mắc PRRS TT Nhóm lợn Số lượng (con) Kết quả RT-PCR Tỷ lệ
(%) Âm tính Dương tính
1 Lợn con theo mẹ 10 2 8 80 2 Lợn sau cai sữa 7 2 5 71,43 3 Lợn choai 6 1 5 83,33 4 Nái mang thai 4 0 4 100 5 Nái nuôi con 3 0 3 100
Tổng số 30 5 25 83,33
Qua bảng 4.2 cho thấy, trên 30 lợn nghi mắc PRRS thu thập ở ổ dịch tại Bắc Giang với 25 lợn dương tính với PRRSV, chiếm 83,33% và phân lập được 25 chủng PRRSV từ các mẫu phổi và hạch phổi của lợn bệnh. Chúng tôi chọn chủng virus PRRS của lợn nái có triệu chứng lâm sàng điển hình nhất để nghiên
cứu các đặc tính sinh học và sinh học phân tử.
Hồ sơ mẫu của chủng virus PRRS chúng tôi lựa chọn để nghiên cứu được trình bày tại bảng 4.3
Bảng 4.3. Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu STT Chủng virus Hiệu giá virus
(TCID50/25µl)
Cơ quan
phân lập Nguồn gốc 1 KTY-PRRS-04 106,74 Phổi Giang,năm 2014 Lợn nái, Bắc
Qua bảng 4.3 cho thấy, chủng virus KTY – PRRS – 04 được phân lập tại phổi của lợn nái mắc bệnh tại ổ dịch tại Bắc Giang năm 2014, hiệu giá của chủng virus nghiên cứu là 106,74.
4.1.2.Kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác
Để kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác: dịch tả lợn (CSF), lở mồm long móng (FMD), tiêu chảy thành dịch trên lợn (PED) và viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) trong huyễn dịch tế bào bằng kỹ thuật RT-PCR. Kết quả thu được trình bày tại bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả xác định sự có mặt của virus PRRS, CSF, FMD, PED và TGE
Virus PRRSV CSFV FMDV PEDV TGEV
Kết quả + - - - -
Ghi chú: +: là dương tính; -: là âm tính
Kết quả bảng 4.4 cho thấy trong huyễn dịch tế bào virus PRRS chúng tôi lựa chọn nghiêm cứu chỉ phát hiện sự có mặt của virus PRRS. Các virus còn lại đều cho kết quả âm tính (không phát hiện thấy sự có mặt của chúng trong huyễn dịch tế bào).
4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG VIRUS KTY - PRRS - 04 CHỦNG VIRUS KTY - PRRS - 04
4.2.1. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển. chuyển.
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu các đặc tính sinh học của chủng virus PRRS nghiên cứu bằng việc tiến hành cấy chuyển chủng virus đó liên tục qua 40 đời
trên môi trường tế bào Marc-145. Do điều kiện thời gian thực tập hạn chế, số lượng các đời tương đối nhiều nên chúng tôi sẽ lựa chọn đại diện các đời cấy chuyển: Đời 0, đời 10, đời 20, đời 30 và đời 40 để tiến hành nghiên cứu khả năng nhân lên của các thế hệ virus và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của chủng virus này.
Cụ thể chúng tôi chuẩn bị một khay 96 giếng tế bào Marc-145 đã mọc đều một lớp trên bề mặt nuôi cấy. số lượng tế bào trong một giếng của khay được xác định bằng cách đếm 4 giếng đại diện ở 4 góc của khay 96 và tính trung bình. Sau đó, huyễn dịch chứa virus được đưa vào gây nhiễm cho các giếng tế bào theo lượng thích hợp để đảm bảo MOI = 0,01. Khay tế bào gây nhiễm virus được ủ ở 37°C/5% CO2 để theo dõi CPE qua các thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ… sau khi gây nhiễm cho đến khi CPE không còn phát triển thêm trên các giếng tế bào nữa.
Kết quả theo dõi sự nhân lên của virus nghiên cứu qua sự phát triển bệnh tích tế bào trên môi trường tế bào Marc-145 được thể hiện ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua các đời
Chủng virus Giờ CPE (%)
Đời 0 Đời 10 Đời 20 Đời 30 Đời 40 KTY-PRRS-04 24h 0 0 0 0 0 36h 5* 10 10 10 10 48h 40 45 45 45 45 60h 70 80 80 80 80 72h 100 100 100 100 100 84h B B B B B Ghi chú:
- 5*: 5% tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy (ước lượng bằng mắt khi soi trên kính hiển vi soi nổi).
Qua bảng 4.5 chúng tôi thấy rằng: khả năng nhân lên và phá hủy tế bào theo dõi ở những thời điểm nhất định không có sự thay đổi nhiều giữa các đời, khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus ở các đời cấy chuyển tương đối ổn
định. Virus PRRS xâm nhập vào tế bào và nhân lên nhanh chóng, gây ra bệnh tích tế bào rất điển hình sau 36 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào xuất hiện sớm, sau khi gây nhiễm 36 giờ tế bào bắt đầu co cụm lại với nhau. Đến thời điểm sau 48 giờ gây nhiễm các tế bào co cụm đó bắt đầu chồi lên khỏi đáy bình nuôi cấy với mật độ ngày càng nhiều hơn.
Đến thời điểm sau 72 giờ gây nhiễm thì các tế bào bị phá hủy hoàn toàn, bắt đầu bong tróc khỏi đáy bình, có thể quan sát rất rõ hình thái bệnh tích này qua kính hiển vi soi ngược. Bệnh tích tế bào (CPE) xuất hiện sớm ở 36 giờ sau khi gây nhiễm đạt khoảng 5-10%.(hình 4.2).
Số lượng tế bào bị phá hủy tăng dần sau 48 giờ gây nhiễm đạt từ 40%, ( hình 4.3). Thời điểm 60 giờ sau khi gây nhiễm thì virus gây bệnh tích tế bào ở mức khá cao từ 70% (hình 4.4).
CPE đến thời điểm 72 giờ sau khi gây nhiễm đã đạt tới 100%.
Sau 84 giờ gây nhiễm PRRSV đã phá vỡ tế bào hoàn toàn, các tế bào bong tróc toàn bộ khỏi bề mặt nuôi cấy.
Qua kết quả trên cho phép chúng tôi đánh giá sơ bộ về mức độ nhân lên của virus cũng như sức sống của virus được lựa chọn để nghiên cứu, cơ bản chủng virus sau khi gây nhiễm đều có khả năng nhân lên mạnh mẽ, gây ra bệnh tích tế bào và hủy hoại tế bào nhanh chóng ,tương đối ổn định. Điều đó cho thấy phương thức bảo quản virus là khá tốt, đảm bảo được yêu cầu đặt ra. Vì vậy, các chủng virus này có thể tiếp tục dùng cho những nghiên cứu tiếp theo.
Một số hình ảnh bệnh tích tế bào khi gây nghiễm virus PRRS
Hình 4.1. Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus
Hình 4.2. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm
Hình 4.3. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm
Hình 4.4. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm
Hình 4.5. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây gây nhiễm
Kết quả nghiên cứu về tốc độ nhân lên và gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY - PRRS - 04 trong nghiên cứu của chúng tôi có phần cao hơn so với với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thu Trang (2015) về virus nhược độc PRRS Hanvet1.VN trên tế bào Marc-145 và kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan (2011) về các chủng PRRS phân lập được tại các vùng phụ cận Hà Nội. Theo chúng tôi nguyên nhân là do chủng virs KTY - PRRS - 04 có độc lực cao hơn so với các chủng virus trong nghiên cứu của các tác giả nói trên.
Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Toan và cs. (2016) nghiên cứu về đặc tính sinh học của chủng virus KTY - PRRS - 04 phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy chuyển.
Như vậy, chúng tôi đánh giá sơ bộ về mức độ nhân lên của virus PRRS cũng như sức sống của virus KTY - PRRS - 04 được lựa chọn để nghiên cứu, cơ bản chủng virus sau khi gây nhiễm đều có khả năng nhân lên mạnh mẽ, gây ra bệnh tích tế bào và hủy hoại tế bào nhanh chóng, tương đối ổn định.
Bên cạnh đó, chúng tôi nhận thấy phương thức bảo quản virus KTY - PRRS - 04 trong nghiên cứu này là khá tốt, đảm bảo được yêu cầu đặt ra. Vì vậy, các chủng virus này có thể tiếp tục dùng cho những nghiên cứu tiếp theo.
4.2.2. Kết quả xác định hiệu giá virus qua các đời cấy chuyển.
Sau khi lựa chọn được chủng virus PRRS dùng để nghiên cứu (bảng 4.3), chúng tôi tiến hành tìm hiểu đặc tính sinh học của chúng qua việc xác định hiệu giá virus. Chúng tôi chuẩn bị một khay 96 giếng đã phủ tế bào Marc-145 một lớp. Số lượng tế bào trong một giếng của khay được xác định bằng cách đếm 4 giếng đại diện ở 4 góc của khay 96 và tính trung bình. Huyễn dịch virus được pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp của các giếng theo thứ tự đánh dấu trước (25µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau một giờ ủ, chúng tôi bổ sung vào mỗi giếng 100µl dung dịch duy trì DMEM có chứa 10% TBP. Để khay tế bào đã gây nhiễm virus trong tủ ấm 37°C/5% CO2.
Quan sát CPE qua các thời điểm 24, 36, 48, 60,….sau gây nhiễm. Sau đó, virus được thu hoạch và xác định TCID50 theo phương pháp của Reed-Muench.
* Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của virus trên tế bào
Tại các thời điểm 24, 36, 48, 60, 72, 80, 96, 108, 120 giờ sau gây nhiễm tiến hành thu hoạch virus chủng KTY – PRRS – 04 đời P0. Dịch virus thu được tại mỗi thời điểm được trộn chung thành một mẫu đồng nhất để xác định hiệu giá. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để có đánh giá trung bình. Kết quả được trình bày tại bảng 4.6.
Bảng 4.6. Hiệu giá của chủng virus KTY – PRRS – 04 tại các thời điểm thu hoạch
Thời điểm thu
virus (giờ) 24 36 48 60 72 84 96 108 120 Hiệu giá virus L1 104,5 104,5 105,7 106,5 106,7 104,6 104,3 103,8 103,5 L2 104,2 104,8 105,5 106,4 106,72 104,64 104,5 104,0 103,8 L3 103,99 104,5 105,6 106,2 106,8 104,5 104,2 103,7 103,6 TB 104,23 104,6 105,6 106,37 106,74 104,58 104,33 103,83 103,63
0 1 2 3 4 5 6 7 8 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 84 h 96 h 108 h 120 h L og h iệ u