Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm bacillus sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm Bacillus sử dụng làm probiotic chăn nuôi NGUYỄN THỊ LAN ANH Anh.ntlcb190028@sis.hust.edu.vn Ngành: Công nghệ thực phẩm Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Hồ Phú Hà Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 12/2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm Bacillus sử dụng làm probiotic chăn nuôi NGUYỄN THỊ LAN ANH Anh.ntlcb190028@sis.hust.edu.vn Ngành: Công nghệ thực phẩm Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Hồ Phú Hà Chữ ký GVHD Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 12/2021 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Nguyễn Thị Lan Anh Đề tài luận văn: Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm Bacillus sử dụng làm probiotic chăn nuôi Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số HV: CB190028 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày ………………….với nội dung sau: - Chỉnh sửa lỗi tả, bổ sung thông tin số tài liệu tham khảo (27, 30, 47,…), thống thuật ngữ khoa học sử dụng toàn luận văn - Chỉnh sửa phần kết luận bám sát với nội dung kết trình bày luận văn - Chỉnh sửa số đề mục cho phù hợp (mục 3.1) - Bổ sung phần tổng quan (mục 1.3: thu nhận chế phẩm Bacillus dạng bào tử) - Bổ sung phần tóm tắt, đề cập liên quan với chuyên ngành Công nghệ thực phẩm đề tài - Sơ đồ hóa phương pháp 2.2.8 Ngày tháng 12 năm 2021 Giáo viên hướng dẫn Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG NHIỆM VỤ TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Lan Anh Ngành: Cơng nghệ Thực phẩm Khố: 2019B Viện: Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm Bacillus sử dụng làm probiotic chăn nuôi - Nội dung đề tài: Thu thập sàng lọc chủng vi khuẩn Bacillus Khảo sát đặc tính probiotic chủng Bacillus tuyển chọn Thu nhận chế phẩm Bacillus ứng dụng chăn nuôi Kiểm tra chất lượng chế phẩm Bacillus thu Họ tên cán hướng dẫn: PGS TS Hồ Phú Hà Ngày giao nhiệm vụ: 23/12/2019 Ngày hồn thành nhiệm vụ: 30/12/2021 TRƯỞNG BỘ MƠN (Ký ghi rõ họ tên) Ngày tháng năm 20… GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Sau năm kể từ tốt nghiệp đại học, lại thêm lần em ngồi viết lời cảm ơn này, biết viết cho đủ em nhận q nhiều?! Để hồn thành nhiệm vụ giao đề tài, nỗ lực học hỏi thân cịn có hướng dẫn tận tình thầy giúp đỡ động viên bạn bè, người thân gia đình Qua trang viết này, em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS TS Hồ Phú Hà TS Nguyễn Hải Vân – Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội hướng dẫn bảo tận tình tỉ mỉ cho em suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành đề tài Em xin cảm ơn thầy cô thuộc Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho em thời gian làm việc phòng thí nghiệm Bên cạnh đó, gia đình, người thương bạn bè tin tưởng động lực tiếp thêm sức mạnh cho em Cảm ơn mẹ khơng hỏi con: “Khi học xong?”, cảm ơn thành viên Lab 305-B1 giúp đỡ cho em nhiều kỷ niệm đẹp, đẹp suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Cảm ơn Bách Khoa thân yêu cho hội bên suốt năm trời, tạm xa Bách Khoa nhé, xa mặt khơng cách lịng! Một lần em xin chân thành cảm ơn! Hà Nôi, Tháng 12 năm 2021 Học Viên Nguyễn Thị Lan Anh TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm Bacillus sử dụng làm probiotic chăn nuôi.” Tác giả luận văn: Nguyễn Thị Lan Anh Người hướng dẫn khoa học: Khóa: 2019B PGS.TS Hồ Phú Hà Từ khóa (Keyword): thức ăn chăn ni, bào tử Bacillus, chế phẩm probiotic, enzyme tiêu hóa, khả bám dính, điều kiện tiêu hóa giả lập Nội dung tóm tắt: Ngành chăn ni có vai trị quan trọng phát triển ngành công nghệ thực phẩm nói chung Chất lượng sản phẩm ngành chăn ni đóng vai trị định chất lượng nguồn nguyên liệu chất lượng sản phẩm thực phẩm Tuy nhiên vấn nạn kháng kháng sinh, tồn dư kháng sinh sản phẩm ngành chăn nuôi gây nên bấp bênh nguồn nguyên liệu chế biến thực phẩm, chất lượng thực phẩm chế biến từ ngành chăn nuôi khơng đánh giá cao, khó xuất thương mại Chế phẩm probiotic đánh giá giải pháp giúp nâng cao an toàn sinh học, giải vấn nạn kháng kháng sinh vật nuôi hướng tới mục tiêu phát triển bền vững ngành chăn ni Việt Nam qua thúc đẩy phát triển ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Việt Nam Nghiên cứu nhằm đánh giá tuyển chọn chủng vi sinh vật probiotic tiềm để sản xuất chế phẩm sinh học ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi 141 chủng vi sinh vật thu thập từ Bộ sưu tập Viện Hàn Lâm Khoa học công nghệ Việt Nam Bộ sưu tập Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm ĐH Bách Khoa Hà Nội sàng lọc tuyển chọn chủng Bacillus tiềm theo phương pháp nhuộm gram, khả sinh enzyme catalase, khả sống sót điều kiện pH thấp, khả sinh enzyme ngoại bào, khả tồn điều kiện đường ruột xác định theo phương pháp cho vi sinh vật probiotic tiếp xúc với môi trường dịch dày ruột non giả lập định lượng khả sống sót phương theo phương pháp pha lỗng liên tiếp trang đếm đĩa thạch, khả bám dính niêm mạc ruột vật nuôi Chủng Bacillus tiềm probiotic tuyển chọn tiến hành thu bào tử phương pháp kích thích vi khuẩn tạo bào tử mơi trường nghèo dinh dưỡng, sau tạo chế phẩm Bacillus dạng bào tử phương pháp sấy phun đánh giá hoạt tính probiotic chế phẩm Kết thu 52/91 chủng vi khuẩn Bacillus tiềm tuyển chọn tiêu trí gram dương, sinh catalase sống sót mơi trường pH thấp Trong 19 chủng (chiếm tỉ lệ 36,54%) có khả sinh loại enzyme ngoại bào bao gồm … Khả sống sót vi sinh vật probiotic thử nghiệm điều kiện tiêu hóa giả lập tương đối cao (trung bình đạt 70%) Dựa kết sàng lọc, hai chủng vi sinh vật probiotic tiềm P5QN4 P4QN11 lựa chọn để xác định khả bám dính, tạo bào tử thu chế phẩm Kết cho thấy hai chủng có mật độ bám dính niêm mạc ruột tốt mức 5,59 – 5,85 logCFU/cm2 hiệu suất bám dính cao đạt 91 98% mật độ thử 106 CFU/ml Chế phẩm dạng bào tử chủng dạng bột khơ (độ ẩm ≈ 11%) có mật độ 107 – 108 CFU/g, có khả sinh loại enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa, sống sót sinh trưởng tốt điều kiện đường ruột giả lập, mật độ không thay đổi pha log sau tháng bảo quản điều kiện thường Các kết thu nghiên cứu chứng minh tiềm sản xuất chế phẩm sinh học động vật sở để thực nghiên cứu sâu việc ứng dụng chế phẩm sản xuất thức ăn chăn nuôi MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus 1.1.1 Đặc điểm chung vi khuẩn Bacillus 1.1.2 Các yếu tổ ảnh hưởng tới điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus 1.1.3 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus 10 1.2 Tính chất probiotic số chủng Bacillus 11 1.2.1 Định nghĩa probiotic 11 1.2.2 Cơ chế tác dụng probiotic: 12 1.2.3 Tính chất probiotic vi khuẩn Bacillus 13 1.3 Thu nhận chế phẩm Bacillus dạng bào tử 15 1.3.1 Phương pháp kích thích vi khuẩn Bacillus tạo bào tử 15 1.3.2 Phương pháp thu chế phẩm probiotic 16 1.4 Ứng dụng Bacillus sp làm chế phẩm probiotic chăn nuôi 18 1.4.1 Thực trạng ngành chăn nuôi Việt Nam 18 1.4.2 Ứng dụng Bacillus sp làm chế phẩm probiotic 20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 25 2.1.1 Chủng vi sinh vật 25 2.1.2 Hóa chất – môi trường 26 2.1.3 Các thiết bị phịng thí nghiệm 27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính catalase 27 2.2.2 Phương pháp nhuộm Gram 27 2.2.3 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 28 2.2.4 Phương pháp quan sát hình thái xác định mật độ tế bào 29 2.2.5 Phương pháp xác định khả sống sót mơi trường pH thấp 30 2.2.6 Phương pháp xác định khả sinh enzyme hỗ trợ tiêu hóa 31 2.2.7 Phương pháp xác định khả sống sót mơi trường đường ruột 32 2.2.8 Phương pháp xác định khả bám dính niêm mạc ruột chủng Bacillus 33 i 2.2.9 Thu bào tử từ chủng Bacillus sp probiotic 36 2.2.10 Phương pháp thu chế phẩm dạng bào tử vi khuẩn Bacillus 39 2.2.11 Phương pháp khảo sát đặc tính probiotic điều kiện bảo quản chế phẩm 40 2.2.12 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .42 3.1 Thu thập tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus định hướng ứng dụng chăn nuôi 42 3.1.1 Nhuộm Gram đánh giá khả sinh catalase 42 3.1.2 Bảo quản giống vi sinh vật 47 3.1.3 Sàng lọc chủng vi khuẩn Bacillus có khả sống sót mơi trường pH thấp 49 3.2 Khả sinh enzyme hỗ trợ tiêu hóa khả sống sót môi trường đường ruột chủng vi khuẩn Bacillus 52 3.2.1 Khả sinh enzyme hỗ trợ tiêu hóa chủng vi khuẩn Bacillus 52 3.2.2 Khả sống sót chủng vi khuẩn Bacillus môi trường đường ruột giả lập 56 3.2.3 Khả bám dính niêm mạc ruột gà chủng vi khuẩn Bacillus tiềm 58 3.3 Thu tinh bào tử vi khuẩn Bacillus tiềm 61 3.3.1 Khảo sát thời gian lên men chủng Bacillus môi trường DSM đạt hiệu suất thu bào tử cao 61 3.3.2 Khảo sát thời gian xử lý nhiệt để tinh bào tử 63 3.4 Thu chế phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus 64 3.5 Khảo sát đặc tính probiotic tỷ lệ sống sót sau bảo quản chế phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus thu 65 3.5.1 Khả sinh enzyme chế phẩm 65 3.5.2 Khả sống sót điều kiện đường ruột chế phẩm 66 3.5.3 Tỷ lệ sống sót chế phẩm sau thời gian bảo quản 68 PHẦN KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .70 Kết luận 70 Hướng nghiên cứu 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CFU Colony Forming Unit CMC Carboxymethyl cellulose DSM Difco sporulation media EDTA Acid Etylen Diamin Tetra Acetic NA/NB Nutrient agar/borth REA Relative enzyme activity values TCA Acid Trichloroacetic iii Bảng 6: Khảo sát thời gian ủ DSM cho hiệu suất thu bào tử cao chủng P5QN4 Mật độ ban Mật độ sau ủ Mật độ dịch đầu t=0 DSM bào tử (CFU/ml) (CFU/ml) (CFU/ml) (%) 24h 6,73.107 2,32 107 94,09 48h 5,86 107 3,91 107 97,74 60h 5,88 107 3,08 107 96,80 72h 1,2 108 2,59 107 91,76 96h 8,55 107 2,95 107 97,26 Thời gian Hiệu suất 1,94.10 Nhìn chung, phương pháp thu bào tử Bacillus môi trường DSM cho thấy hiệu tốt hiệu suất mốc thời gian ủ DSM đạt 90%, so sánh mật độ dịch vi khuẩn thời điểm t = (lúc vi khuẩn tồn dạng tế bào sinh dưỡng) với mật độ dịch bào tử thu ta thấy gần 100% tế bào sinh dưỡng chuyển hóa thành dạng bào tử điều với mục đích ban đầu nghiên cứu lựa chọn phương pháp thay phương pháp tác động khắc nghiệt khác để thu hiệu suất tạo bào tử cao Khi mật độ tiếp giống ban đầu thời điểm t = 1,94.107 thời gian ủ 48h cho thấy hiệu suất bào tử thu cao mức 97,74% mật độ dịch bào tử thu cao đạt 3,91.107 CFU/ml, cho thấy 48h thời điểm tốt để ủ vi khuẩn thu bào tử Bacillus Điều tương đồng với kết kiểm chứng thực khảo sát với chủng P4QN11 thời điểm 24h, 48h, 72h phương nhuộm đếm bào tử để ngoại suy mật độ dịch vi khuẩn sau nuôi DSM mật độ dịch bào tử thu Kết thu cho hiệu suất cao nuôi ủ DSM 48h (Bảng 3.7) đạt mức 99,7% 62 Bảng 7: Khảo sát thời gian ủ DSM cho hiệu suất thu bào tử cao chủng P4QN11 Hiệu suất tạo 24h 48h 72h 95,93 99,70 96,97 bào tử (%) 3.3.2 Khảo sát thời gian xử lý nhiệt để tinh bào tử Xử lý nhiệt 80oC với dịch bào tủ thu nhằm mục đích tinh bào tử,loại bỏ tế bào sinh dưỡng cịn sót lại sau q trình ủ DSM, nhiên thời gian ủ ngắn việc tinh khơng đạt hiệu quả, dài làm giảm hiệu suất thu bào tử, cần khảo sát thời gian xử lý nhiệt trình tinh để đạt hiệu suất thu bào tử cao Ở mốc thời gian xử lý nhiệt 10, 20 30 phút, kết thu sau: Bảng 8: Khảo sát thời gian xử lý nhiệt tinh bào tử P5QN4 Trước xử lý nhiệt Sau xử lý nhiệt Hiệu suất T=10’ 4,67.107 96,12% T=20’ 3.107 93,7% 2,4.107 92,48% 9,55.10 T=30’ Kết cho thấy, hiệu suất tạo bào tử giảm dần tăng thời gian xử lý nhiệt, nhiên mức giảm không đáng kể (2,42%) mật độ dịch bào tử sau xử lý nhiệt đạt mức 107 CFU/ml Tiến hành nhuộm Melachite green mẫu xử lý nhận thấy mẫu xử lý nhiệt 10 phút xuất tế bào sinh dưỡng bắt màu hồng, mẫu 20 phút 30 phút không nhận thấy tế bào sinh dưỡng (hình 3.12) Như để vừa đảm bảo yếu tố tinh hiệu vừa thu hiệu suất tạo bào tử cao mức thời gian 20 phút xem thích hợp 63 Hình 11: Kính trường nhuộm Melachite mẫu dịch bào tử xử lý nhiệt (lần lượt từ trái sang phải: 10 phút, 20 phút, 30 phút) 3.4 Thu chế phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus Dịch bào tử P5QN4 P4QN11 sấy phun có sử dụng chất mang Maltodextrin 10% (w/v) để thu chế phẩm Kết sấy phun dịch bào tử thu chủng P5QN4 P4QN11 thể bảng, bảng 3.9 bảng 3.10 sau: Bảng 9: Hiệu suất sấy phun chủng P5QN4 P5QN4 Trước sấy Sau sấy Khối lượng chế phẩm (g) 5,716 3,420 Mật độ (CFU/ml) 3,2.107 1,9.107 Mật độ (CFU/g) 2,8.108 2,76.108 Hiệu suất bao nang 98,57% (theo mật độ CFU/g) Hiệu suất thu hồi 59,83% Bảng 10: Hiệu suất sấy phun chủng P4QN11 P4QN11 Trước sấy Sau sấy Khối lượng chế phẩm (g) 5,489 2,640 Mật độ (CFU/ml) 8,23.106 4,68.106 Mật độ (CFU/g) 7,49.107 4,68.107 Hiệu suất bao nang 62,48% (theo mật độ CFU/g) Hiệu suất thu hồi 48,10% 64 Hình 12: Chế phẩm P5QN4 thu sau sấy phun Nhìn chung, hiệu suất bao mang maltodextrin đạt hiệu tốt đạt 59,38% (CFU/ml) maltodextrin lại nguyên liệu rẻ tiền, nguồn phong phú thích hợp để ứng dụng chăn nuôi Độ ẩm chế phẩm đạt 11% giúp chế phẩm có khả bảo quản điều kiện nhiệt độ độ ẩm thường Thiết bị sấy phun phịng thí nghiệm dạng quy mơ nhỏ nên trình thu hồi chế phẩm dễ bị thất thoát khiến hiệu suất thu hồi chế phẩm đạt 50 - 60%, nhiên áp dụng vào quy mô dây truyền thiết bị lớn, vận hành liên tục hiệu suất thu hồi sản phẩm đạt giá trị cao Chế phẩm P4QN11 thu có mật độ 4,68.107 CFU/g P5QN4 2,76.108 CFU/g, mật độ thỏa mãn yêu cầu mật độ cần thiết để probiotic có ảnh hưởng tốt đến vật chủ (106-107 CFU/g), bên cạnh mật độ cao mật độ số chế phẩm sinh học bào tử Bacillus có thị trường như: Bio-Acimin Viet-Duc Pharmaceutical Co Ltd., chứa B subtilis, L acidophilus, S faecalis mật độ 107 CFU/g 3.5 Khảo sát đặc tính probiotic tỷ lệ sống sót sau bảo quản chế phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus thu 3.5.1 Khả sinh enzyme chế phẩm Khả sinh enzyme chế phẩm Bacillus P5QN4 P4QN11 thể bảng 3.8 hình 3.4 sau: 65 Bảng 11: Khả sinh enzyme chế phẩm Bacillus Chủng Giá trị REA Amylase Cellulose Protease P4QN11 1,21 1,49 1,49 P5QN4 1,21 1,52 1,71 So với hoạt tính enzyme nhận từ tế bào sinh dưỡng, khả sinh enzyme chế phẩm thấp enzyme ngoại bào Điều lý giải chế phẩm dạng bào tử, hoạt hóa nảy mầm, hoạt động sống chức sản sinh enzyme chưa ổn định Tuy nhiên nhìn chung, chế phẩm Bacillus có khả sinh loại enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa Trong P5QN4 có khả sinh enzyme Cellulose protease tiệm cận mức tốt số REA 1,93 1,88 (≈ 2) Hình 13: Khả sinh enzyme Amylase chế phẩm 3.5.2 Khả sống sót điều kiện đường ruột chế phẩm Khả sống sót sau q trình bảo quản tiêu chí quan trọng để đánh giá tính ứng dụng chế phẩm đó, hầu hết chế phẩm sinh học probiotic dạng khơ hay nước cần có thời gian bảo quản từ tháng điều kiện bảo quản thường Vì vậy, xác định khả sống sót chế phẩm 66 điều kiện bảo quản thường thí nghiệm sau để đánh giá chế phẩm probiotic thu nghiên cứu Hai chế phẩm Bacillus thử nghiệm khả sống sót điều kiện đường ruột phương pháp mục 3.2.2, kết thu sau: Hình 14: Khả sống sót mơi trường đường ruột giả lập chế phẩm Dựa vào kết hình 3.5 thấy, chế phẩm cho thấy khả chống chịu, chí sinh trưởng tốt mơi trường đường ruột giả lập sau 180 phút tiếp xúc dịch dày giả lập 180 phút tiếp xúc dịch ruột non giả lập Với chế phẩm P5QN4, mật độ t = 8,14 logCFU/ml sau 180 phút tiếp xúc dịch dày giả lập mật độ tăng lên 8,41 logCFU/ml, đạt mức 7,95 logCFU/ml sau 180 phút tiếp xúc dịch ruột non giả lập, tỷ lệ sống sót đạt 97,7% Trong chế phẩm P4QN11 mật độ t = 7,13 logCFU/ml sau 180 phút tiếp xúc dịch dày giả lập mật độ tăng lên 7,76 logCFU/ml, đạt mức 8,06 logCFU/ml sau 180 phút tiếp xúc dịch ruột non giả lập, tỷ lệ sống sót đạt 100% chí có khả sinh trưởng mơi trường dịch ruột non giả lập Kết có lớp vỏ bào tử giúp bào tử chống chịu 67 môi trường chứa enzyme muối mật pH thấp dịch giả lập Chứng minh ưu tuyệt vời chế phẩm dạng bào tử Bacillus so với loại chế phẩm khác 3.5.3 Tỷ lệ sống sót chế phẩm sau thời gian bảo quản Với điều kiện bảo quản nhiệt độ độ ẩm phịng thí nghiệm, chế phẩm kiểm tra khả sống sót hai mốc thời gian tháng tháng, kết trình bày bảng sau: Bảng 12: Khả sống sót sau trình bảo quản chế phẩm Bacillus Mật độ vi sinh vật (CFU/g) Thời gian bảo quản P5QN4 P4QN11 Sau sấy 2,55.108 4,68.107 tháng 2,68.108 4,41.107 tháng 1,39.108 1,37.107 Mẫu 1: chế phẩm P4QN11 sấy ngày 13/4 mật độ sau sấy 4,68.107 (CFU/g), sau thời gian bảo quản tháng, mật độ sau bảo quản là: 4,41.107 (CFU/g) , sau tháng mật độ sau bảo quản là: 1,37.107 (CFU/g) tỷ lệ sống sót đạt 99,7% sau tháng bảo quản 93% sau tháng bảo quản Mẫu 2: chế phẩm P5QN4 sấy ngày 13/4 mật độ sau sấy 2,55.108(CFU/g), thời gian bảo quản tháng mật độ sau bảo quản là: 2,68.108 (CFU/g), sau tháng mật độ sau bảo quản là: 1,39.108 (CFU/g) tỷ lệ sống sót đạt 100% sau tháng bảo quản 97% sau tháng bảo quản Kết luận chung sau tháng bảo quản, mật độ bào tử thay đổi mức không đáng kể, chế phẩm thu hoàn toàn phù hợp với việc bảo quản điều kiện thường Như hai chế phẩm Bacillus tiềm thu từ nghiên cứu có đầy đủ đặc tính probiotic chế phẩm có thị trường Nhưng có tính ưu việt chế phẩm thu thập từ nguồn mẫu Việt Nam, xác định tính nhạy cảm với kháng sinh thông dụng, đặc biệt chế phẩm P5QN4 nhạy cảm với kháng sinh Ampicillin [54] – loại kháng sinh có 68 từ lâu đời mà hầu hết chủng vi khuẩn kháng Độ ẩm chế phẩm đạt 10 – 11%, tương đương độ ẩm chế phẩm thị trường chế phẩm Bacillus Pro cơng ty Biospring có thời gian bảo quản 24 tháng Riêng mật độ chế phẩm đạt 107 – 108 CFU/g thấp so với mật độ 109 – 1010 CFU/g chế phẩm thị trường chủng probiotic tiềm nghiên cứu chưa khảo sát, lựa chọn điều kiện lên men thu mật độ sinh khối cao, mà hoạt hóa đạt mật độ 107 – 108 CFU/ml tiến hành tạo bào tử thu chế phẩm dẫn tới mật độ chế phẩm đạt 107 – 108 CFU/g 69 PHẦN KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Kết luận 1) Thu thập, sàng lọc tuyển chọn 52 chủng Bacillus tiềm từ sưu tập 141 chủng ban đầu 2) Tuyển chọn chủng Bacillus P5QN4 P4QN11 có đầy đủ đặc tính probiotic, có khả sản sinh ba enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa, tỷ lệ sống sót >70% mơi trường đường ruột giả lập, khả bám dính 106 CFU/cm2 niêm mạc ruột gà 3) Đề xuất quy trình tạo tinh bào tử Bacillus với thời gian lên men chủng môi trường DSM thu bào tử 48 giờ, thời gian xử lý nhiệt 80oC để tinh dịch bào tử 20 phút Thu nhận hai chế phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus là: P5QN4 mật độ đạt 108 CFU/g P4QN11 mật độ đạt 107 CFU/g 4) Chế phẩm thu có khả sinh ba enzyme ngoại bào (protease, amylase, cellulose) hỗ trợ tiêu hóa, sống sót sinh trưởng mơi trường đường ruột giả lập, bảo quản tốt điều kiện thường, tỷ lệ sống sót đạt >90% sau tháng Hướng nghiên cứu Các kết thu tiếp tục nghiên cứu để ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi: - Nghiên cứu nâng cao mật độ chế phẩm probiotic thông qua nâng cao mật độ tế bào sinh dưỡng tiếp giống - Đánh giá hiệu in vivo chế phẩm probiotic động vật 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Murray, Patrick R., Ken S Rosenthal, and Michael A Pfaller Medical microbiology E-book Elsevier Health Sciences, 2020 [2] Redmond, Caroline, et al "Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis." Microbiology 150.2 (2004): 355-363 [3] Stewart, George C "The exosporium layer of bacterial spores: a connection to the environment and the infected host." Microbiology and Molecular Biology Reviews 79.4 (2015): 437-457 [4] Munoz, Lawrence, Yoshito Sadaie, and Roy H Doi "Spore coat protein of Bacillus subtilis Structure and precursor synthesis." Journal of Biological Chemistry 253.19 (1978): 6694-6701 [5] Henriques, Adriano O., and Charles P Moran, Jr "Structure, assembly, and function of the spore surface layers." Annu Rev Microbiol 61 (2007): 555588 [6] RYTER, A (1965, January) “Morphologic study of the sporulation of Bacillus subtilis” In Annales de l'Institut Pasteur (Vol 108, pp 40-60) [7] Online Biology Notes - A Complete notes for Students https://www.onlinebiologynotes.com [8] Moir, Anne "How spores germinate?." Journal of applied microbiology 101.3 (2006): 526-530 [9] Cutting M Simon (2016): The Use of Probiotic Bacteria as Animal Feed Supplements Hội thảo Chế phẩm prbiotics chịu nhiệt BioSpring Hà Nội tháng năm 2016 [10] Huynh A Hong, Le Hong Duc, Simon M Cutting (2005): The use of bacterial spore formers as probiotic ELSEVIER FEMS Microbiology Reviews 29 (2005) 813-835 [11] Han, D., et al "Response surface optimization of the cultivation conditions and medium composition a novel probiotic strain Bacillus pumilus STF26." International Food Research Journal 21.4 (2014): 1355-1361 71 [12] Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), "Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn sinh Protease kiềm" [13] Phương Thị Hương, Vũ Văn Hạnh "Lựa chọn điều kiện lên men cho sinh trưởng chủng Bacillus subtilis BSVN15 ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic chăn nuôi” [14] Hương, Phạm Trần Thùy, and Đỗ Thị Bích Thủy "Ảnh hưởng số yếu tố lên trình thu nhận chế phẩm amylase ngoại bào từ Bacillus subtilis DC5." Tạp chí khoa học, Đại học Huế 71.2 (2012): 187-199 [15] Thành, Ngô Tự, et al "Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải." VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 25.2 (2009) [16] Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu (2009) Nghiên cứu khả sống mơi trường đường tiêu hóa động vật số chủng Vi sinh vật nhằm bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotics Tạp chí khoa học, 09 (55), Trường Đại học Nơng lâm, Đại học Huế, tr 82 [17] Khuất Hữu Thanh, Bùi Văn Đạt (2010) Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus để tạo chế phẩm sinh học sử dụng ni trồng thủy sản Tạp chí khoa học công nghệ, 05 (48), tr 57-63 [18] Foysal, Md Javed, and Asura Khanam Lisa "Isolation and characterization of Bacillus sp strain BC01 from soil displaying potent antagonistic activity against plant and fish pathogenic fungi and bacteria." Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 16.2 (2018): 387-392 [19] Araya, M., et al "Guidelines for the evaluation of probiotics in food Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food." (2002) [20] Jose Luis Balcazar, Ignacio de Blas, Imanol Ruiz-Zarzuela, David Cunningham, Daniel Vendrell Jose Luis Muzquiz (2006), "The role of probiotics in aquaculture", Veterinary Microbiology, 114(3 - 4), 173–186 72 [21] Nicolae corcionivoschi, Dan Drinceanu, Lavinia Stef, Ioan Luca, Călin Julean Mingyart, Dr Oana (2010), "Probiotics - Identification and ways of action ", Innovative Romanian Food Biotechnology, 1-11 [22] Xiaohua Guo cộng (2006), "Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis MA139 in pigs", Antonie Van Leeuwenhoek 90(2), tr 139-146 [23] Jorge Olmos J Paniagua-Michel (2014), "Bacillus subtilis A Potential Probiotic Bacterium to Formulate Functional Feeds for Aquaculture", Microbial and Biochemical Technology, 6(7), 361 – 365 [24] Nguyễn Hoàng Anh Nguyễn Thị Lâm Đồn* (2018), "Bacillus có tiềm probiotic từ ruột gà" [25] Weiwei Wang Youbiao Ma, Haijun Zhang, Jing Wang, Wenming Zhang, Jun Gao, Shugeng Wu (2018), "Supplemental Bacillus subtilis DSM 32315 manipulates intestinal structure and microbial composition in broiler chickens" [26] Monteiro, Sandra M., et al "A procedure for high‐yield spore production by Bacillus subtilis." Biotechnology Progress 21.4 (2005): 1026-1031 [27] Nicholson WL, Setlow P (1990) Sporulation, germination and outgrowth In: Harwood CR, Cutting SM (eds) Molecular [28] Carvalho, Ana S., et al "Relevant factors for the preparation of freeze-dried lactic acid bacteria." International Dairy Journal 14.10 (2004): 835-847 [29] Le, Nguyen Thi My, and Nguyen Thuy Huong "Microencapsulation of Lactobacillus fermentum 39-183 by spray drying in the presence of prebiotics." [30] Tổng cục thống kê Việt Nam, “Báo cáo tình hình ngành chăn ni năm 2019-2020”, www.gso.gov.vn [31] Reduced Antibiotic Use in Livestock: How Denmark Tackled Resistance (2014) [32] R&D department, Bispring company 73 [33] Le Hong Duc Tran Thu Hoa, Rachele Isticato, Loredana Baccigalupi, Ezio Ricca, Pham Hung Van, and Simon M Cutting (2001), "Fate and Dissemination of Bacillus subtilis Spores in a Murine Model" [34] Hồ Trung Thông Hồ Lê Quỳnh Châu, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh (2010), "Đánh giá khả bám dính kháng khuẩn mức độ in vitro số chủng vi sinh vật có tiềm sử dụng làm probiotics” [35] Nguyễn Thị Lộc Lê Văn An, Nguyễn Minh Hương, Nguyễn Thị Thu Trang (2017), "Nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum) phần thức ăn nuôi lợn giai đoạn sau cai sữa nuôi thịt" [36] Nguyễn Đức Hiền Lê Thị Hải Yến (2016), “ Khảo sát đặc tính probiotic chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tỉnh đồng sông cửu long” [37] Garrity, George M., Julia A Bell, and Timothy G Lilburn "Taxonomic outline of the prokaryotes Bergey’s manual of systematic bacteriology." New York (2004) [38] Nguyễn Lân Dũng, Giáo trình vi sinh vật học, 1962: Đại học tổng hợp - Hà Nội [39] Khuất Hữu Thanh Bùi Văn Đạt (2010), "Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus để tạo chế phẩm sinh học sử dụng nuôi trồng thủy sản", Tạp chí khoa học cơng nghệ 48(5), 57 - 63 [40] Latorre, Juan D., et al "Evaluation and selection of Bacillus species based on enzyme production, antimicrobial activity, and biofilm synthesis as directfed microbial candidates for poultry." Frontiers in veterinary science (2016): 95 [41] Son Chu-Ky, Thi-Khanh Bui, Tien-Long Nguyen Phu-Ha Ho (2014), "Acid adaptation to improve viability and X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase activity of the probiotic bacterium Lactobacillus fermentum HA6 exposed to simulated gastrointestinal tract conditions", International Journal of Food Science and Technology, 49 565–570 74 [42] Nguyễn Hồng Anh Nguyễn Thị Lâm Đồn* (2018), "Bacillus có tiềm probiotic từ ruột gà" [43] Trần Quốc Việt, Bùi Thu Huyền, Dương Văn Hợp, Vũ Thành Lâm (2009) Phân lập, tuyển chọn đánh giá đặc tính probiotic số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn nuôi Tạp chí Khoa học cơng nghệ chăn ni, 16: 521-537 [44] Alp, Duygu, and Hakan KuleaŞan "Determination of competition and adhesion abilities of lactic acid bacteria against gut pathogens in a wholetissue model." Bioscience of Microbiota, Food and Health (2020) [45] PGS.TS.Biền Văn Minh Trường ĐHSP – Đại học Huế [46] Tavares, Milene B., et al "Bacillus subtilis endospores at high purity and recovery yields: optimization of growth conditions and purification method." Current microbiology 66.3 (2013): 279-285 [47] Chávarri, María, Izaskun Marón, and María Carmen Villarán "Encapsulation technology to protect probiotic bacteria." Probiotics IntechOpen, 2012 [48] Nguyễn, Kim Nữ Thảo, et al "Bảo tồn lưu giữ nguồn gen Vi sinh vật." (2020) [49] Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Minh Thái, Nguyễn Thị Linh Giang, Trần Hữu Tâm Đông, Trần Cát (2014), "Nghiên cứu đặc tính probiotic Bacillus subtilis BS02", Tạp chí Y Học Thực Hành 907(3), 21 - 25 [50] Casula, Gabriella, and Simon M Cutting "Bacillus probiotics: spore germination in the gastrointestinal tract." Applied and environmental microbiology 68.5 (2002): 2344-2352 [51] Alp, Duygu, Hakan Kuleaşan, and Aylin Korkut Altıntaş "The importance of the S-layer on the adhesion and aggregation ability of lactic acid bacteria." Molecular biology reports 47.5 (2020): 3449-3457 [52] Barbosa, T.M., Serra, C.R., La Ragione, R.M., Woodward, M.J., Henriques, A.O., 2005 Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract Appl Environ Microbiol 71 75 [53] Spinosa, M.R., Braccini, T., Ricca, E., De Felice, M., Morelli, L., Pozzi, G., Oggioni, M.R., 2000 On the fate of ingested Bacillus spores Res Microbiol 151, 361e368 [54] Nguyễn Thị Minh Đức (2021), “Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp sử dụng làm probiotic cho vật nuôi khảo sát khả không chuyển/nhận gen kháng kháng sinh”, Luận văn thạc sĩ 76 ... probiotic, … Do chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm Bacillus sử dụng làm probiotic chăn nuôi? ?? nhằm lựa chọn chủng Bacillus tiềm có đặc tính probiotic nghiên cứu thu chế phẩm probiotic. .. pháp thu chế phẩm probiotic 16 1.4 Ứng dụng Bacillus sp làm chế phẩm probiotic chăn nuôi 18 1.4.1 Thực trạng ngành chăn nuôi Việt Nam 18 1.4.2 Ứng dụng Bacillus sp làm chế phẩm probiotic. .. nghệ Thực phẩm Khố: 2019B Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm Bacillus sử dụng làm probiotic chăn nuôi - Nội dung đề tài: Thu thập