Bản tin Khoa học Trẻ: Số 2 (1), 2016

Bản tin Khoa học Trẻ: Số 2 (1), 2016 gồm các nội dung chính sau: Bước đầu xây dựng phương pháp luận hỗ trợ định danh các mẫu nấm Cordyceps và các chi lân cận bằng phát sinh chủng loài phân tử đa Gen; Đánh giá công tác bảo tồn và các tác nhân ảnh hưởng đến Rùa Xanh (Chelonia Mydas) tại Hòn Bảy Cạnh – VQG Côn Đảo; Định lượng Aflatoxin M1 trong sữa thô bằng phương pháp LC-MS/MS;...

LỜI GIỚI THIỆU Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ đơn vị trực thuộc Thành Đồn thành phố Hồ Chí Minh, giao thực nhiệm vụ phát triển phong trào sáng tạo khoa học kỹ thuật tuổi trẻ thành phố, tổ chức giải thưởng, đầu tư nghiên cứu, thực số cơng trình khoa học kỹ thuật có giá trị kinh tế, tổ chức thực hoạt động dịch vụ khoa học kỹ thuật phục vụ cho sản xuất, tổ chức đào tạo, bồi dưỡng nâng cao trình độ khoa học kỹ thuật, trình độ quản lý kinh tế xã hội cho thiếu nhi thành phố Với nhiệm vụ đó, nhiều năm qua Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ tổ chức thành cơng hai tuyến nội dung chính: phát triển phong trào sáng tạo khoa học kỹ thuật thiếu nhi thành phố tổ chức hoạt động khoa học cơng nghệ chun sâu, có hàm lượng chất xám cao với nhiều mơ hình khẳng định uy tín cộng đồng khoa học, thiếu thi nhân dân khơng riêng Thành phố Hồ Chí Minh nước Bản tin Khoa học trẻ xuất lần tiếp tục dấu ấn chuỗi hoạt động Trung tâm với việc lần Cục Thông tin Công nghệ Quốc Gia - Bộ Khoa học Công nghệ chứng nhận Mã số chuẩn quốc tế ISSN: 2354-1105 cấp ngày 01 tháng 04 năm 2015 Bản tin đăng tải cơng trình nghiên cứu nhà khoa học,nhà nghiên cứu trẻ nhiều lĩnh vực Các báo đăng tải phải thơng qua bình duyệt nhà khoa học, chuyên gia, nhà quản lý hội đồng khoa học nhằm phản biện, đánh giá, thẩm định chuyên môn báo Đây bước khởi đầu chặng đường thực mục tiêu Ban Thường vụ Thành Đoàn định hướng cho Trung tâm phải xây dựng tạp chí khoa học nghiêm túc, chất lượng dành cho nhà khoa học trẻ, niên, sinh viên hàng đầu nước Bản tin Khoa học Trẻ minh chứng cho đầu tư nghiêm túc đạo Ban Thường vụ Thành đoàn tập thể, cán nhân viên Trung tâm việc quan tâm, xây dựng sân chơi, hoạt động học thuật triển khai hình thức phong trào phải đạt chất lượng mặt khoa học Ban Thường vụ Thành Đoàn trân trọng chúc mừng bước phát triển Bản tin Khoa học trẻ Trung tâm Phát triển Khoa học công nghệ trẻ Rất mong Bản tin đón nhận tham gia nhiệt tình nhiều nhà khoa học đông đảo niên nước quốc tế Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 05 năm 2016 PHĨ BÍ THƯ THƯỜNG TRỰC THÀNH ĐỒN CHỦ TỊCH HỘI SINH VIÊN TP Lâm Đình Thắng Bản Tin TRNG TÂM PHÁT TRIỂN KH&CN TRẺ SỐ 01 PHẠM NGỌC THẠCH, Q1, TP.HCM ĐT: (84.8) 38.233.363 – (84.8) 38.230.780 E-mail: tckhtre@gmail.com ISSN: 2354-1105 MỤC LỤC CHỈ ĐẠO THỰC HIỆN Lâm Đình Thắng CHỊU TRÁCH NHIỆM XUẤT BẢN Đồn Kim Thành Trịnh Văn Hạnh Ngô Thị Diệp Nguyễn Thị Bích Thảo Nguyễn Thị Thu Thảo Lao Đức Thuận Bước đầu xây dựng phương pháp luận hỗ trợ định danh mẫu nấm Cordyceps chi lân cận phát sinh chủng loài phân tử đa Gen Nguyễn Ngọc Linh Đánh giá công tác bảo tồn tác HỘI ĐỒNG KHOA HỌC nhân ảnh hưởng đến Rùa Xanh (Chelonia Mydas) Hòn Bảy Cạnh PGS.TS.Huỳnh Thanh Hùng Nguyễn Thị Thu PGS.TS.Thái Văn Nam TS.Bạch Long Giang Trần Thị Kim TS.Chung Anh Dũng Võ Duy Việt Nguyễn Trí Hịa TS.Nguyễn Hồng Chương THƯ KÝ BIÊN TẬP Quan Quốc Đăng Hồng Sơn Giang Đồn Minh Chí Giấy phép xuất số: 17/QĐ-XBBT-STTTT Ngày 29/09/2014 STTTT Thành phố Hồ Chí Minh cấp – VQG Cơn Đảo Định lượng Aflatoxin M1 sữa thô phương pháp LC-MS/MS Nghiên cứu xây dựng số dễ bị tổn thương xã hội ngập xã Tam Thôn Hiệp, huyện Cần Giờ Nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu ứng dụng bào chế viên nén Dimenhydrinat 50 mg dùng làm thuốc chống say tàu xe Nguyễn Thị Thu Hằng Đặng Thị Ngọc Thanh Hoàng Minh Tâm Phân lập, xác định đặc tính nhận diện vi khuẩn nội sinh mía (Saccharum Officinarum L.) trồng tỉnh Tây Ninh Đinh Minh Châu Hồ Thị Bích Phương Nguyễn Hoàng Anh Thu nhận khảo sát hoạt tính sinh học sắc tố Prodigiosin từ vi khuẩn Serratia Marcescens Kha Trần Lâm Tú Quyên Bùi Phương Anh Số lượng: 300 Ứng dụng điều trị phẫu thuật bệnh u nang biểu bì (Dermoid Sinus) chó Phú Quốc 19 28 40 49 57 62 Chế in Cty TNHH Một thành viên In Lê Quang Lộc Trần Kiến Đức Phan Thị Trâm Lê Thị Ngọc Châu Xây dựng KIT PCR phát tạp nhiễm thành phần có nguồn gốc từ heo gà thực phẩm chay 67 In xong nộp lưu chuyển tháng 06/2016 Nguyễn Tuấn Anh Xây dựng quy trình Taq-Man RealTime PCR phát số nhóm Gene blaOxa Acinetobacter Baumannii 77 Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LUẬN HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM CORDYCEPS VÀ CÁC CHI LÂN CẬN BẰNG PHÁT SINH CHỦNG LOÀI PHÂN TỬ ĐA GEN (ON THE FIRST STEPS TOWARDS A METHODOLOGY TO ASSIST IN THE IDENTIFICATION OF CORDYCEPS AND RELATED FUNGI BY MULTIGENE PHYLOGENETICS) Trịnh Văn Hạnh, Ngô Thị Diệp, Nguyễn Thị Bích Thảo, Nguyễn Thị Thu Thảo, Lao Đức Thuận* Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Mở TP Hồ Chí Minh SUMMARY A methodology was created to assist in the identification process of entomopathogenic fungi (Cordyceps, Clavicipitaceae), a genus with a diverse species content and therapeutic applications The method was formed from creating a reference dataset to assist in the identification process of several samples (1) The dataset includes database of nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1, Tub and Atp6 for related fungi; (2) Gene sequences obtained from fungal samples of Lang Bian, Lam Dong through DNA extraction by phenol/chloroform method with the assist of β-mercaptoethanol and CTAB; (3) Molecular phylogenies were analyzed on single gene and multigene trees by MEGA 6.0 software with different tree construction methods (Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) and Maximum Likelihood (ML) Boostrapping was included to support tree branches The molecular method with the combination of molecular biology and bioinformatics was completely in agreement with morphological-based methods As a result, DL0038A and DL0038B were reconfirmed as Cordyceps takaomontana (Anamorphic form: Isaria tenuipes), DL004 was reconfirmed asCordyceps neovolkiana.DL0067 was in a very close relationship or is Isaria tenuipes, DL0075 was in a very close relationship or is Cordyceps staphylinicola DL0069 and DL0077 were in a very close relationship with Simplicillium lamellicola or Simplicillium lanosoniveum Keywords: Molecular phylogenetics, Cordyceps, Clavicipitaceae, Entomopathogenic fungi MỞ ĐẦU Chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps (họ Clavicipitaceae), tiêu biểu có Cordyceps sinensis, chứa nhiều thành phần hoạt chất quan trọng nhiều ứng dụng y học[3] Hiện nay, nghiên cứu khơng tập trung vào lồi Cordyceps sinensis mà cịn mở rộng nghiên cứu đến nhiều lồi thuộc họ Clavicipitaceae, lồi cho có hoạt tính y dược quý C sinensis[4] Tuy nhiên, việc định danh loại nấm thuộc chi dựa phân tích hình thái Kobayashi(1982)(được xem tiêu chuẩn vàng định danh) gặp nhiều khó khăn chi nấm (1) đa dạng đặc điểm, cấu trúc loài nấm thuộc họ Clavicipitaceae, (2) hệ thống định danh nhóm nấm tồn thể lưỡng danh hữu tính (teleomorph) vơ tính (anamorph) gây phức tạp hóa q trình định danh[3] Vì vậy, việc xây dựng phương pháp luận dựa việc phân tích phát sinh lồi phân tử nhằm hỗ trợ cho công tác định danh nấm tiến hành Phương pháp luận xây dựng dựa sinh học phân tử kết hợp với tin sinh học ứng dụng việc xây dựng phát sinh sinh Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 loài đơn gen hay đa gen Nền tảng phương pháp luận (1) sinh học phân tử (gồm chủ yếu PCR điện di giải trình tự) (2) tin sinh học (gồm xây dựng sở dự liệu (CSDL), xây dựng phát sinh loài phân tử).Trên giới, việc nghiên cứu phát sinh loài ứng dụng hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng nghiên cứu trước đây, chẳng hạn Sung et al (2007) sử dụng liệu – gen bao gồm nrSSU, nrLSU, rpb1, rpb2, Atp6, tub tef1 để tiến hành phân tích, nghiên cứu sâu quan hệ chi thuộc họ Clavicipitaceae, kết nghiên cứu tái xếp lại chi liên quan Bộ liệu công bố Sung et al (2007) dẫn liệu đối chứng phát sinh lồi mà chúng tơi xây dựng Thông tin cho thấy kết hợp đa gen góp phần hỗ trợ làm tăng mức độ tin cậy phát sinh lồi q trình định danh nấm ký sinh côn trùng (Sung et al., 2007) Trong nghiên cứu này, Chúng tiến hành xây dựng phương pháp luận dựa sinh học phân tử kết hợp tin sinh học để định danh mẫu nấm kí sinh trùng Langbian nói chung Việt Nam nói riêng Đồng thời phương pháp luận kiểm định mẫu nấm kí sinh trùng định danh hình thái gồm: DL004: Cordyceps nevolkiana, DL0038A: Cordyceps takaomontana, DL0038B: Cordyceps takaomontana, DL0067: Isaria sp., DL0069: Simplicillium sp., DL0075: Cordyceps sp., DL0077: Simphicillium sp (Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, 2015) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Kế thừa kết nghiên cứu trước nhóm TS Trương Bình Ngun TS Đinh Minh Hiệp (2005), công bố sử dụng mẫu nấm phân thành nhóm gồm (1) DL004, DL0038A, DL0038B nhóm định danh hình thái đến mức lồi, xem nhóm đối chứng để kiểm tra phương pháp luận mà nhóm xây dựng; đặc biệt nhóm này: hai mẫu nấm DL0038A DL0038B hai mẫu định danh đến mức lồi hình thái, hỗ trợ từ phân tích trình tự ITS chưa đạt kết mong muốn (2) DL0067, DL0069, DL0075 DL0077 định danh hình thái đến mức chi, nhóm sử dụng với mục đích từ kết định danh phân tử hỗ trợ thêm thơng tin cho định danh hình thái Tách chiết DNA, phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu Quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi nấm thực phương pháp Phenol/Chloroform, theo Chomczynski Sacchi (1987) có biến đổi cho phù hợp với mục tiêu thu nhận DNA (thay đổi số pH phenol từ thành 8) bổ sung thêm chất bổ trợ β-mercaptoethanol CTAB Phản ứng PCR thực máy Mxpro-Mx3005P (Stratagene) với chương trình nhiệt bao gồm 95 ºC phút (1 chu kỳ), 40 chu kỳ lặp lại với 95 ºC - 30 giây, X ºC - 30 giây, 72 ºC - phút 72 ºC - phút (1 chu kỳ) (X nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho gen nrLSU: 55oC, nrSSU: 42,5oC, Tef1: 55oC, Rpb1: 46,3oC, Tub: 58,5oC, Atp6: 43oC) Thể tích phản ứng 25 µl bao gồm: 12,5 µl buffer PCR, 0,5 µl mồi xi ngược, µl ddH2O µl DNA Sản phẩm PCR tiến hành điện di gel agarose % tiến hành giải trình tự cơng ty Nam Khoa Mồi sử dụng cho phản ứng giải trình tự mồi sử dụng cho phản ứng PCR, cung cấp IDT (Intergrated DNA Technologies, Mỹ) Hiệu chỉnh trình tự, xây dựng phát sinh lồi Sản phẩm PCR sau giải trình tự chiều kiểm tra phần mềm Chromas Lite phiên 2.1.1 hai chiều hiệu chỉnh cẩn thận thông qua phần mềm Seaview, BioEdit, BLAST, … Các trình tự sau hiệu chỉnh gióng cột đồng hóa với liệu tham chiếu thu nhận từ cơng trình tác giả Sung et al Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 (2007) Cuối cùng, liệu tiến hành dị tìm mơ hình tiến hóa phù hợp theo chuẩn Bayesian Information Criterion (BIC) phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013) Cây phát sinh loài xây dựng phần mềm MEGA phiên 6.0 (Tamura et al., 2013) Các phương pháp sử dụng để xây dựng phát sinh loài bao gồm: Neighbor joining (NJ), Maximum parsimony (MP) Maximum likelihood (ML) mơ hình tiến hóa phù hợp từ kết dị tìm phần mềm MEGA 6.0; Cây phát sinh loài đánh giá phương pháp bootstrap lặp lại 1000 lần với mức đạt ý nghĩa giá trị ủng hộ lớn 50 so sánh mặt địa hình học (Topology) với phát sinh lồi tham chiếu Sung et al (2007) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách chiết DNA, PCR gen mục tiêu Xây dựng thành cơng quy trình tác chiết DNA tổng số từ hệ sợi nấm phương pháp phenol/Chloroform có bổ sung βmercaptoethanol CTAB cho kết tối ưu, nồng độ DNA cao (kết khơng trình bày) Chúng tơi tiến hành tối ưu hóa thành cơng quy trình PCR nhiệt độ bắt cặp cho gene đại diện hình Hình Điện di sản phẩm PCR gen nrLSU, nrSSU, Rpb1, Tef1 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% cho kết băng sản phẩm trùng khớp với kết khảo sát in silico tham khảo từ cơng trình nghiên cứu Sung et al (2007) cụ thể kích thước 950, 1102, 803 1040 nucleotides, tương ứng với gen nrLSU, nrSSU,rpb1 tef1 (Sung et al., 2007) Xây dựng phát sinh loài Các gen sau hiệu chỉnh tiến hành đồng hóa với sở liệu tham chiếu gen nrLSU, nrSSU, rpb1 tef1, Atp6, Tub xây dựng dựa cơng trình nghiên cứu Sung et al (2007) Các phát sinh loài xây dựng phần mềm MEGA 6.0 gồm NJ, MP, ML dựa liệu tham chiếu đơn gen mẫu nấm cho kết mặt địa hình học (Topology) tương ứng với (dữ liệu khơng trình bày) Tuy nhiên nhằm tăng hiệu phân tích, việc ghép gen với làm tăng chiều dài trình tự giúp tăng độ xác, thơng qua thơng số phát sinh chủng loài giá trị ràng buộc (bootstrap), đơn vị đo khoảng cách biến đổi (substitution) đồng quan điểm với nhiều cơng trình nghiên cứu khác giới, chẳng hạn nghiên cứu Sung et al (2007), Johnson et al (2009), Chan et al (2011) Phương pháp luận hỗ trợ định danh tái kiểm tra với kết định danh hình thái với mẫu định danh đến mức loài Cụ thể mẫu DL004, DL0038A, DL0038B Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 Hình Một phần phả hệ phân tử mẫu DL004 xây dựng phương pháp MP (Các số hiển thị NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Hình Một phần phả hệ phân tử mẫu DL0038A, DL0038B xây dựng phương pháp MP (Các số hiển thị NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Dựa phát sinh loài cho mẫu DL004 (Hình: 3), cho thấy địa hình học NJ, MP, ML tương tự mẫu DL004 phân nhóm với trình tự tham chiếu Ophiocordyceps neovolkiana (HQ215593, HM852531) với giái trị bootstrap đạt 100/100/94 NJ/MP/ML Giá trị bootstrap > 70% tương ứng với giá trị xác xuất > 95% giá trị phân nhóm ủng hộ mạnh mẽ[2] Dựa hình thái mẫu DL004 định danh Cordyceps neovolkiana (Lê et al., 2010) Như vậy, Kết phân tích phân tử mẫu DL004 trùng khớp với kết định danh hình thái, mẫu DL004 kết luận Cordyceps neovolkiana Mẫu DL0038A, DL0038B xây dựng phát sinh lồi đa gen ln phân nhóm với Isaria tenuipes (thể vơ tính Cordyceps takaomontana)[6] với giá trị bootstrap ủng hộ mạnh mẽ cho phân nhóm 98/99/95 NJ, MP, ML Về hình thái, mẫu DL0038A, DL0038B định danh Cordyceps takaomontana (Lê et al., 2010) Kết định danh phân tử mẫu tương đồng phù hợp với định danh hình thái, mẫu DL0038A DL0038 kết luận Cordyceps takaomontana (thể vơ tính Isaria tenuipes) Từ kết trên, phương pháp luận mà xây dựng lần tái kiểm tra cho thấy kết định danh phân tử hoàn toàn ủng hộ kết định danh hình thái Kết kiểm định giúp cung cấp thêm sở khoa học cho phương pháp luận xây dựng hướng đến ứng dụng định danh mẫu nấm khác, đặc biệt chi nấm Cordyceps chi lân cận Đối với mẫu DL0067, DL0069, DL0075, DL0077 định danh hình thái đến mức chi Cụ thể, mẫu DL0067 xây dựng phát sinh loài đơn gen đa gen ln phân nhóm với trình tự tham chiếu Isaria tenuipes giá trị bootstrap ủng hộ cao cho phân nhóm Khi xây dựng phát sinh lồi đa gen mẫu DL0067 lại phân nhóm với DL0038A với giá trị bootstrap NJ/MP/ML 100/100/100 mẫu nấm phân nhóm với Isaria tenuipes thuộc ngân hàng giống OSC111005 với giá trị bootstrap 98/99/95 NJ/MP/ML Kết phát sinh lồi đơn đa gen mẫu DL0067 định danh phân tử Isaria tenuipes (thể vơ tính Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 Cordyceps takaomontana) Hiện mẫu DL0067 tiếp tục ni cấy phịng thí nghiệm với mong muốn thu nhận thể để có thêm thơng tin định danh dựa hình thái Kết hợp với định danh hình thái mẫu DL0067 Isaria sp (Lê et al., 2010) định danh phân tử cho kết đến mức loài Isaria tenuipes giúp cung cấp thêm thông tin để hỗ trợ nhóm nghiên cứu định danh sau Như vậy, kết luận mẫu DL0067 Isaria sp có quan hệ gần lồi Isaria tenuipes Hình Một phần phả hệ phân tử mẫu DL0069, DL0077 xây dựng phương pháp MP (Các số hiển thị NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Về hình thái, tương tự mẫu DL0067 hai mẫu DL0069, DL0077 định danh đến mức chi Simplicillium (Lê et al., 2010) Mẫu DL0069, DL0077 xây dựng phát sinh lồi đơn gen ln phân nhóm với Simplicillium lamellicola (CBS 116.25) Simplicillium lanosoniveum (CBS 101267) chi Simplicillium với giá trị bootstrap ủng hộ cho phân nhóm mức ý nghĩa (kết khơng trình bày) Kết hợp với phát sinh lồi đa gen gen nrLSU, nrSSU, rpb1, Tef1 phân nhóm Simplicillium với thơng số bootstrap NJ/MP/ML 100/90/99.Như vậy, kết luận mẫu DL0069, DL0077 loài thuộc chi Simplicillium sp có quan hệ gần với lồi Simplicillium lamellicola hay Simplicillium lanosoniveum Hình Một phần phả hệ phân tử mẫu DL0069, DL0077 xây dựng phương pháp MP (Các số hiển thị NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Trường hợp mẫu DL0075 tiến hành xây dựng đơn gen đa gen ln phân nhóm với trình tự tham chiếu Cordyceps staphylinidicola với giá trị bootstrap ủng hộ cao cho phân nhóm đa gen NJ/MP/ML 100/100/100 Về mặt hình thái mẫu DL0075 định danh tới mức chi Cordyceps sp.Vì vậy, chúng tơi kết luận mẫu DL0075 lồi thuộc Cordyceps sp có quan hệ gần lồi Cordyceps staphylinidicola Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 KẾT LUẬN Phương pháp luận dựa việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử - kết hợp với tin sinh học xây dựng thành công hỗ trợ định danh lồi nấm ký sinh trùng Phương pháp khẳng định tái kiểm tra mẫu DL004, DL0038A, DL0038B Kết định danh phân tử hồn tồn trùng khớp với kết định danh hình thái, mẫu kết luận DL0038, DL0038B Cordyceps takaomontana - thể hữu tính Isaria tenuipes - thể vơ tính DL004 là Cordyceps neovolkiana Đối với mẫu nấm chưa thể định danh đến mức lồi dựa hình thái, kết định danh dựa phân tử cho thấy: mẫu DL0067 định danh loài thuộc Isaria sp có quan hệ gần lồi Isaria tenuipes DL0075 nhận định loài thuộc Cordyceps sp có quan hệ gần loài Cordyceps staphylinidicola Mẫu DL0069, DL0075 nhận định lồi thuộc Simplicillium sp có quan hệ gần với loài Simplicillium lamellicola hay Simplicillium lanosoniveum Kết định danh cung cấp cho thêm nhiều thông tin sở khoa học cho công tác định danh dựa hình thái sau TÀI LIỆU THAM KHẢO Andreas, D, B, Ouellette, B, F, Bioinfomatics A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Methods of Biochemical Analysis, Vol 43, pp 323-359 Capote, N., Pastrana, A, M, Aguado, A, and Torres, P, S, 2012.Molecular Tools for Detection of Plant Pathogenic Fungi and Fungicide Resistance, Plant Pathology, InTech Chan, W, H, Ling, K, H, Chiu, S, W, et al (2011), Molecular Analyses of Cordyceps gunnii in China, J Food & Drug Anal 19: 18-25 Cummings; John, N, 2009 Entomopathogenic fungi in New Zealand native forests : the genera Beauveria and Isaria, Biological Sciences, 10 Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Ngun, 2015.Nghiên cứu nhóm nấm Cordyceps Tây Nguyên khảo sát tiềm ứng dụng chúng y dược,Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài Sở Khoa Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Kobayasi, Y, 1982.Keys to taxa of genera Cordyceps and Torrubiella, Transactions of the mycological society of Japan; Vol 23, 329-364 Sung, G, H,; Jones, N, L, H; Jae, M, S,; Luangsaard, J, J,; Shrestha, B,; Spatafora, J, W, 2007 Phylogenetic classification of Cordycepsand the clavicipitaceous fungi, Studies in Mycology; Vol 57; pp.5-59 Sung, G, H, Sung, J, M, Hywel-Jones, N, L, Spatafor, J, W, 2007.A multi-gene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi):Identification of localized incongruence using a combinational bootstrap approach, Molecular Phylogenetics and Evolution Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 ĐÁNH GIÁ CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CÁC TÁC NHÂN ẢNH HƯỞNG ĐẾN RÙA XANH (Chelonia mydas) TẠI HÒN BẢY CẠNH – VQG CÔN ĐẢO MARINE TURTLE CONSERVATION PROCESS AND FACTORS AFFECTING GREEN TURTLE (Chelonia mydas) IN ISLAND BAY CANH - CON DAO NATIONAL PARK Nguyễn Ngọc Linh TÓM TẮT Rùa Xanh hay tên thường gọi Vích (Chelonia mydas) lồi rùa biển, cịn xuất sinh sản Côn Đảo Qua nghiên cứu, tác giả ghi nhận số lượng rùa mẹ đẻ trứng tăng ổn định theo thời gian (>300 cá thể/mỗi năm), tỉ lệ trứng nở thành công (80 %), số cá thể Vích thả tự nhiên tăng lên đáng kể thời gian 10 năm (1994 -2014) từ 6442 cá thể lên đến 118423 cá thể Tuy nhiên, nhiều mặt hạn chế cơng tác bảo tồn, là: chưa tìm mối liên hệ biến đổi nhiệt độ không khí nói riêng yếu tố mơi trường nói chung trạm ấp so với bãi tự nhiên, thời gian ấp trứng, vận tốc bò bãi cát, vận tốc bơi rùa so sánh thông số rùa nở từ trạm ấp từ tổ tự nhiên bãi cát Bên cạnh đó, tác động từ thiên nhiên ảnh hưởng tiêu cực từ hoạt động người chi phối đến tồn quần thể loài Rùa biển Do vậy,cần phải có nghiên cứu sâu hành động ưu tiên việc bảo vệ nhóm sinh vật biển q tương lai Từ khóa: Vích, Cơng tác bảo tồn, Vích sinh sản, Vích con, Cơn Đảo, Du lịch sinh thái, Phóng sinh Vích SUMMARY Green turtle (Chelonia mydas) is one of seven sea turtle species, which also appears in Con Dao Through research, the author noted the number of mother turtles lay eggs in Con Dao, which steadily increased from 1994 to 2014 (> 300 individuals / per year), as well as successful hatched rate (80%) and the number of baby green turtles were released into the wild increased significantly during 10 years ago, from 6442 up to 118 423 bodies However, there are still limited in conservation activities that is: typical examples such as have not found a relation between the nature nests and artificial incubation about the air temperature change and environmental factors; after incubation time how the speed of baby turtles crawling on the sand Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 71 (A) (B) (C) Hình (A) Sự bắt cặp TP1 TP2 lên trình tự 16S rDNA Sus scrofa (Mã số truy cập Genbank: KC208030) Vị trí Y cặp mồi TP1 tương thích với nucleotide C trình tự bắt cặp; Kết BLAST (B) cặp mồi TP1 (C) TP2 thể tính đặc hiệu mồi Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 72 (A) (B) (C) Hình (A) Sự bắt cặp CLO1 CLO2 lên trình tự DNA khơng mã hóa Lactuca sativa(Mã số truy cập Genbank: AP007232); Kết BLAST (B) cặp mồi CLO1 (C) CLO2 thể tính đặc hiệu cặp mồi Kết kiểm tra 23 mẫu thực phẩm chay thị trường Khảo sát 23 mẫu thực phẩm chay thị trường (12 mẫu thực phẩm chay từ siêu thị, mẫu thu thập từ chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương, mẫu công ty thực phẩm chay Âu Lạc, mẫu thực phẩm chay từ quán cơm chay Thủ Dầu Một) mẫu động vật (heo, gà) làm đối chứng dương, mẫu thực vật (cải bắp) làm đối chứng âm Kết điện di thể hình Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 73 (A) Chú thích: 1, 2, 3, 4, 5: mẫu thực phẩm chay từ công ty Âu Lạc (thứ tự:đùi gà xả chay, thịt nạc kho chay, sườn ram chay, bò kho chay, pate gan ngỗng chay) 6, 7, 8: mẫu thực phẩm chay từ quán cơm chay Thủ Dầu Một(thứ tự mẫu: heo chiên chay, chả trứng vịt chay, chả cá chay) 12, 13, 14: mẫu thực phẩm chay từ chợ Thủ Dầu Một (thứ tự: gà cục chay, bột xù, thịt gà xé chay) 9: Mẫu động vật (thịt heo) 10: mẫu thực vật (cải bắp) Mẫu động (B) Chú thích:1, 2, 3, 4, 5, 6: Lúa mạch nâu hạt, lúa mạch vàng khúc, Amila vàng lát nhỏ, Amila bạch kê cục, bột nêm bào ngư, bột nêm gà chay.7: Động vật (heo) 8: Mẫu trộn heo: cải (tỉ lệ 1:1).TV: thực vật (cải).Chứng (): không DNA vật (thịt heo) 11: Mẫu động vật (thịt gà) 15: mẫu hỗn hợp (tỉ lệ heo:gà:thực vật: 1:1:1) 16, 17, 18, 19, 20:mẫu hỗn hợp (thực phẩm chay Âu Lạc:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1) 21, 22, 23: Mẫu hỗn hợp (thực phẩm chay từ chợ Thủ Dầu Một:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1) 24, 25, 26: Mẫu hỗn hợp (nguồn cung cấp ngoài:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1) M: Thang chuẩn 100 bp (C) Chú thích:1, 2, 3, 4, 5, 6: Bột nêm gà chay 1, bột nêm gà chay 2, bạch kim kê, burger tiêu đen, dăm chay, chả lụa Vegan ĐV: Động vật (heo) 7: Mẫu trộn heo: cải (tỉ lệ 1:1).TV: thực vật (cải).Chứng (-): khơng DNA Hình Kết kiểm tra tạp nhiễm thành phần động vật mẫu thực nghiệm Tổng số mẫu phát chứa DNA động vật 9/23 mẫu (39,13%) có mẫu từ siêu thị, mẫu từ quán cơm chay mẫu từ thị trường chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương.Các giếng có xuất vạch sản phẩm 154 bp DNA động vật Độ sáng không đồng vạch mẫu bị nhiễm giải thích hàm lượng DNA động vật nhiễm mẫu khác nhau, nồng độ DNA tách không giống nhau, dẫn đến khuếch đại vạch có độ sáng khác Đối với mẫu chứng dương hoàn toàn xuất vạch với kích thước 154 bp sáng, mẫu chứng âm khơng xuất hiệnvạch sản phẩm 154 bp.Để xác định mẫu nhiễm DNA loài nào, sản phẩm PCR mẫu Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 74 chọn đại diện để giải trình tự cơng ty Nam Khoa (mẫu 8-Hình 3A) Hình Kết giải trình tự mạch xuôi (mồi TP1) sản phẩm PCR mẫu Dựa vào kết giải trình tự (hình 4), chúng tơi xác định lồi nhiễm mẫu nghi ngờ chứa DNA động vật tương đồng với trình tự gen ty thể loài gà Gallus gallus với mã số truy cập KF981434 cho thấy mẫu bị nhiễm gà q trình chế biến (Dữ liệu khơng trình bày) Kết kiểm tramột số mẫu thực phẩm chay với phương pháp Multi-PCR (kết hợp cặp mồi chứng nội) Áp dụng quy trình multiPCR với cặp mồi TP1-TP2 đặc hiệu cho vùng gen 16S rDNA động vật cặp mồi CLO1-CLO2 khuếch đại đặc hiệu cho vùng gen khơng mã hóa lục lạp sử dụng làm chứng nội Khảo sát thực mẫu thực vật, mẫu động vật mẫu thực phẩm chay thị trường Hình Kết kiểm tra số mẫu trị trường Multi-PCR Chú thích: 1: Lúa mạch nâu hạt, 2: Bột gà nêm chay, 3: Amila vàng nhỏ,4: Amila bạch kê cục,5: Bột nêm bào ngư,ĐV: Động vật (heo),TV: Thực vật (cải bắp),(-): Chứng âm,L: Thang chuẩn 100 bp Giếng TV xuất vạch sản phẩm chứng nội vị trí 426 bp, phù hợp với kết khảo sát in silico cặp mồi CLO1-CLO2 Giếng ĐV xuất vạchkích thước 154 bp với sản phẩm khuếch đại trình tự 16S rDNA cặp mồi TP1-TP2 Giếng 1, 3, xuất vạch sản phẩm chứng nội vị trí 426 bp, khơng xuất vạch vị trí 154 bpchứng tỏ mẫu âm tính (khơng nhiễm DNA động vật) Giếng không xuất vạch sản phẩm 154 bp, nhiên khơng thể kết luận mẫu âm tính thực khơng xuất vạch sản phẩm chứng nội 426 bp, chứng tỏ mẫu kiểm tra có thành phần phụ gia ức chế phản ứng PCR, mẫu cần phải có phân tích sau này, đặc biệt phải tìm hiểu thành phần phụ gia q trình chế biến có ảnh hưởng đến q trình khuếch đại hay không? Giếng xuất vạch mờ, Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 75 vạch vị trí 154 bp vạch vị trí 426 bp chứng tỏ mẫu dương tính (bị nhiễm DNA động vật) KẾT LUẬN Chúng bước đầu thành công xây dựng sở khoa học để phát thành phần tạp nhiễm động vật thực phẩm chay dựa việc khuếch đại gen 16S rDNA ty thể động vật kết hợp với khuếch đại gen lục lạp sử dụng làm chứng nội cho phản ứng Đồng thời, tiến hành thử nghiệm thành công việc kiểm tra 23 mẫu thực phẩm chay thị trường, kết phát 9/23 (39,13%) mẫu nhiễm DNA động vật Từ kết khảo sát in silico đến in vitro cho thấy kit PCR hoàn toàn đủ sở khoa học để kết luận bước đầu thành công xây dựng kit phát thành phần động vật thực phẩm chay, đồng thời tiến hành thử nghiệm lượng lớn mẫu thực phẩm chay TÀI LIỆU THAM KHẢO Anderson, J., Prior, S 2012.Vegetarian diets Food science and human nutrition, the Colorado State University Booton, G.C., Carmichael, J.R., Visvesvara, G.S., Byers, T.J., Fuerst, P.A.2003 ‘Identification of Balamuthia mandrillaris by PCR Assay Using the Mitochondrial 16S rRNA Gene as a Target’Journal of Clinical Microbiology41(1): pp.453-455 Chomczynski, P., Sacchi, N 2006 ‘The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on’Nature Protocols1(2): pp.581-585 Chomczynski, P., Sacchi, N 1987 ‘Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction’ Analytical Biochemistry 162: pp.156-159 Claude, C., Hermann, S., Eilber, U., Steindorf, K 2005 ‘Lifestyle determinants and mortality in German vegetarians and health-conscious persons: Results of a 21-year follow-up’Cancer Epideminol Biomarkers Prev14: pp 963-968 Girish, P.S., Anjaneyulu, A.S.R., Viswas, K.N., Anand, M., Rajkumar, N., Shivakumar, B.M., Bhaskar, S 2004 ‘Sequence analysis of mitochondrial 12S rRNA gene can identify meat species’Meat Science66: pp.551-556 Heulin, Surget-Groba, Y., Guiller, A., Guillaume, C.P., Deunff, J 1999 ‘Comparisons of mitochondrial DNA (mtDNA) sequences (16S rRNA gene) between oviparous and viviparous strains of Lacerta vivipara: a preliminary study’ Molecular Ecology8: pp.1627-1631 Hsieh, H.M., Tsai, C.C., Tsai, L.C., Chiang, H.L 2005 ‘Species identification of meat products using the cytochrome b gene’Forensic Science Journal4: pp.29-36 Ishizaki, S., Sakai, Y., Yano, T., Nakano, S., Yamada, T., Nagashima, Y., Shiomi, K., Nakao, Y., Akiyama, H 2012 ‘Specific detection by the polymerase chain reaction of potentially allergenic salmonid fish residues in processed foods’Biosci Biotechnol Biochem 76(5): pp.980-985 10 Karabudak, E., Kiziltan, G., Cigerim, N 2008 ‘A comparison of some of the cardiovascular risk factors in vegetarian and omnivorous Turkish females’J Hum Nutr Diet21: pp.13-22 11 Key, T.J., Appleby, P.N., Rosell, M.S 2006 ‘Health effects of vegetarian and vegan diets’Proc Nutr Soc65: pp.35-41 Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 76 12 Melton, T., Holland, C 2007 ‘Routine Forensic Use of the Mitochondrial 12S Ribosomal RNA Gene for Species Identification’J Forensic Sci62: pp.250-257 13 Michael, T.C., Brandon, S.G., Gerald, H.L., Jr, and Brian, R.M 1994 ‘Rates and patterns of chloroplast DNA evolution’Proceedings of the National Academy of Sciences USA 91: pp.6795-6801 14 Misener, S., Krawetz, S.A 1999 ‘Methods in Molecular Biology’, © Humana Press132: pp 365-386 15 Mitanin, T., Akane, A 2009 ‘Identification of animal species using the partial sequences in the mitochondrial 16S rRNA gene’Internationl Symposium Advances in legal Medicine11(1): pp.449-450 Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 77 XÂY DỰNG QUY TRÌNH TAQ-MAN REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ NHĨM GENE blaOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII Nguyễn Tuấn Anh1*, Huỳnh Minh Tuấn2, Nguyễn Kim Huyền2, Nguyễn Vũ Hoàng Yến2, Trịnh Thị Thoa2, Huỳnh Kim Ngân2, Võ Thị Tuyết Nga2, Nguyễn Văn Vĩnh Châu3, Hồ Huỳnh Thùy Dương14 Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương Khoa Kiểm soát Nhiễm khuẩn, Bệnh viện Đại học Y Dược Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh * Nguyễn Tuấn Anh, Email: ntanhbio@gmail.com TÓM TẮT Tổng quan: Acinetobacter baumannii tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu Đặc biệt, chủng A baumannii sở hữu số nhóm gene bla OXA, có khả biểu tính đa kháng kháng sinh, carbapenem Mục đích: Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình Taq-Man real-time PCR phát số nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-51 blaOXA-58 điển hình A baumannii Phương pháp: Quy trình sử dụng mẫu dò Taq-Man thiết kế đặc trưng cho nhóm gene với kênh màu khác (Cy5, FAM, Texas Red, HEX) để phát nhóm gene bla OXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 gene 16S rRNA tương ứng phản ứng Phản ứng multiplex real-time PCR tối ưu để đạt hiệu suất nhân tốt cho tất gene đích cần phát Kết quả: Kết cho thấy quy trình có khả phát xác gene blaOXA-23, bla OXA-51 blaOXA-58 đặc trưng A baumannii với độ nhạy (4 sao/phản ứng) độ đặc hiệu cao, không cho tín hiệu dương tính với DNA nhiều lồi vi khuẩn thường thấy bệnh viện Kết luận: Chúng tơi xây dựng thành cơng quy trình Taq-Man real-time PCR phát số nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-51 blaOXA-58 A baumannii Quy trình sử dụng để đồng thời phát nhanh chủng A baumannii số nhóm gene kháng kháng sinh chúng Quy trình ứng dụng để nghiên cứu dịch tễ học phân tử diện số nhóm gene blaOXA phổ biến A baumannii Từ khóa: A baumannii, β-lactamase, carbapenemase, OXA, real-time PCR, Taq-Man ABSTRACT DEVELOPMENT OF A TAQ-MAN REAL-TIME PCR ASSAY FOR THE DETECTION OF SEVERAL blaOXA GENES IN ACINETOBACTER BAUMANNII Nguyen Tuan Anh*, Huynh Minh Tuan*, Nguyen Kim Huyen, Nguyen Vu Hoang Yen, Trinh Thi Thoa, Huynh Kim Ngan, Vo Thi Tuyet Nga, Nguyen Van Vinh Chau, Ho Huynh Thuy Duong Backgrounds: Acinetobacter baumannii currently is one of the most leading and dangerous factors causing nosocomial infections In addition, A baumannii harbouring several blaOXA genes could express the ability of multidrug resistance, especially with carbapenem Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 78 Objectives: To set up a Taq-Man real-time PCR protocol for the detection of several typical bla OXA genes in A baumannii, including blaOXA-23, blaOXA-51 and blaOXA-58 genes Methods: The process using Taq-Man probes was designed specifically to individual genes with distinguish flourophores (Cy5, FAM, Texas Red, HEX) to detect blaOXA-23, blaOXA-51, bla OXA-58 and 16S rRNA correspondingly in one reaction The multiplex Taq-Man real-time PCR was optimized to get the highest amplification efficiency for all targeted genes Results: The results showed that the protocol could detect precisely blaOXA-23, blaOXA-51 and bla OXA-58 genes specific to A baumannii with high sensitivity (4 copies/reaction) and specificity, not reacting with DNA of many common bacteria in hospital environment Conclusions: We built up a Taq-Man real-time PCR protocol successfully for the detection of bla OXA-23, blaOXA-51 and blaOXA-58 genes in A baumannii The protocol can also be used to identify A baumannii rapidly and their antimicrobial resistant blaOXA genes Potentially, the protocol might become a tool to study molecular epidemiology of blaOXA genes popularly in A baumannii Keywords: A baumannii, β-lactamase, carbapenemase, OXA, real-time PCR, Taq-Man TỔNG QUAN Acinetobacter baumannii (A baumannii) có cấu trúc cầu trực khuẩn Gram âm, nguồn gốc từ thiên nhiên (đất, nước), hiếu khí tuyệt đối dễ mọc môi trường thông thường Khuẩn lạc nhẵn, màu xám trắng, nhầy, đường kính khoảng từ 1,5 - mm A baumannii có khả thích ứng với điều kiện mơi trường sống đa dạng, tồn lâu môi trường bệnh viện, đặc biệt dụng cụ y tế Nhờ khả tạo màng sinh học (biofilm) với tính bám dính cao, vi khuẩn A baumannii gắn chặt vào bề mặt dụng cụ, môi trường, da người khỏe mạnh, đặc biệt nhân viên chăm sóc sức khỏe, tạo điều kiện cho vi khuẩn dễ dàng lây lan tồn lâu dài, thu nhận, tích lũy nhiều gene kháng kháng sinh từ trở thành tác nhân đa kháng, gây khó khăn điều trị kiễm sốt nhiễm khuẩn Có nhiều lồi Acinetobacter tất chúng có khả gây bệnh cho người, A baumannii chiếm 80% trường hợp bị nhiễm chủng thuộc Acinetobacter Sự nguy hiểm A baumannii chỗ có khả kháng lại tất loại kháng sinh Và thế, đặc biệt nguy hiểm cho bệnh nhân nằm viện lâu ngày, phải dùng biện pháp can thiệp ống thở hay kim truyền liên tục, dùng nhiều kháng sinh bị suy giảm miễn dịch A baumannii trở thành loại vi khuẩn siêu kháng thuốc, lên tác nhân hàng đầu gây nhiễm trùng bệnh viện giới [7] Carbapenem thường sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn A baumannii, đặc biệt chủng kháng thuốc, thường khơng cịn hiệu trỗi dậy chủng đa kháng (multidrug resistance – MDR) đa kháng mở rộng (extensive drug resistance - XDR) [9] Nhiều chế kháng liên quan đến tính kháng carbapenem A baumannii sản xuất carbapenemase, bất hoạt kháng sinh, protein màng bị biến đổi, tăng biểu bơm màng hay kênh màng / thay đổi tính thấm màng Tính kháng với carbapenem A baumannii liên quan chủ yếu tới biểu β-lactamase / carbapenemase; chế khác đóng vai trị thứ yếu [8] Bên cạnh đó, carbapenemase phổ biến A baumannii β-lactamase mã hóa blaOXA [10] Nhóm gene oxacilinase (blaOXA) nhóm gene kháng kháng sinh β-lactam A baumannii có khả giúp vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau, đặc biệt carbapenem [5] Nhóm gene thường mã hóa plasmid giúp tính kháng lan truyền chủng vi khuẩn Sản phẩm nhóm gene enzyme oxacilinase, có khả thủy phân Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 carbapenem [6] Nhóm gene chia thành nhóm phụ, có nhóm phát A baumaniii blaOXA-23, bla OXA-24, blaOXA-51 blaOXA-58 [2] Dịch tễ học phân tử cho thấy nhóm gene bla OXA phổ biến tùy khu vực khác giới [1, 8, 10] 79 Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình Taq-Man real-time PCR phát đồng thời gene blaOXA-23, -51, -58 phản ứng, giúp nhanh chóng dễ dàng cơng tác nghiên cứu dịch tễ học phân tử gene Từ đó, có sở xác định chủng nguy hiểm, nguy cao gây nhiễm trùng bệnh viện VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Vi khuẩn A baumannii chuẩn (ATCC 19606) mang gene blaOXA-51 mẫu vi khuẩn A baumannii phân lập khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh thời gian từ tháng 01/2012 đến tháng 12/2013 Chọn lựa thiết kế mồi Các cặp mồi/mẫu dị đặc hiệu cho nhóm gene blaOXA-23, -51, -58 A baumannii cặp mồi/mẫu dò đặc hiệu cho gene 16S rRNA (Acinetobacter spp.) làm chứng nội phản ứng chọn từ số nghiên cứu trước [3, 4] thiết kế sau O23-P: Cy5 – TTGCGCGACGTATCGGTCTTGATC BHQ2; O58-P: Texas Red – TTTACTTTGGGCGAAGCCATGCAAG BHQ2 Mồi mẫu dị đặt tổng hợp cơng ty IDT (Integrated DNA Technologies, USA) Phương pháp tách chiết DNA A baumannii Khuẩn lạc đặc trưng A baumannii thu nhận tăng sinh môi trường LB điều kiện 370C 24 Sau kết thúc tăng sinh, DNA gene A baumannii tách chiết theo nguyên tắc hấp phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica) kit tách chiết “DNA column-based extraction kit” (Khoa Thương) Tất thao tác thực theo hướng dẫn kit nhà sản xuất Thành phần phản ứng multiplex Taq-Man real-time PCR Hỗn hợp phản ứng multiplex Taq-Man real-time PCR tối ưu có thành phần gồm1X buffer, mM MgCl2, 400 nM dNTPs 2X hTaq DNA polymerase (Solgent), 200 nM cho cặp mồi O23-F/R, O51-F/R O58-F/R, 100 nM cho mẫu dò O23-P, O51-P O58-P, 400 nM cho cặp mồi 16S-F/R 200 nM cho mẫu dị 16S-P (IDT), với µl DNA tổng thể tích 25µl Chu trình nhiệt cho phản ứng multiplex Taq-Man real-time PCR: 15 phút – 95oC 30 chu kỳ lập lại gồm 10 giây - 95oC 15 giây - 60oC Tín hiệu thu nhận với bốn màu huỳnh quang đặc trưng FAM (510-530 nm), HEX (560-580 nm), Texas Red (597-616 nm) Cy5 (646-669 nm) Quy trình thực dịng máy luân nhiệt Stratagene Mx3000P Mx3005P (Agilent) Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 80 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tối ưu điều kiện phản ứng monoplex real-time PCR Từng mồi/mẫu dò tối ưu hiệu nhân với phản ứng monoplex realtime PCR mẫu DNA tổng hợp nhân tạo đoạn gene tương ứng với nồng độ nhau: 2x102, 2x104, 2x106 2x108 sao/µl Các thơng số nhiệt độ lai (Ta) mồi/mẫu dò, thành phần phản ứng tối ưu Điều kiện để phản ứng realtime PCR tối ưu hiệu suất phản ứng (E) từ 90% - 105% hệ số tương quan (R2) > 0,980 Bảng Giá trị Ct tối ưu phản ứng monoplex real-time PCR [DNA]* 4x102 4x104 4x106 4x108 E R2 OXA-23 OXA-51 OXA-58 16S rRNA 31,8±0,4 32,6±0,9 33,8±0,5 34,8±0,3 24,9±0,1 26,6±0,0 27,2±0,2 28,6±0,4 18,1±0,2 18,7±0,2 20,4±0,1 20,7±0,4 10,3±0,1 11,3±0,1 12,2±0,1 13,7±0,0 90,8 90,2 90,3 90,0 0,998 0,995 0,997 0,997 * Nồng độ mẫu DNA: sao/phản ứng Kết (Bảng 1) cho thấy phản ứng monoplex real-time PCR đạt điều kiện tối ưu theo tiêu chí (E = 90% - 105% R2 ≥ 0,980) Đây điều kiện chuẩn để so sánh phản ứng multiplex real-time PCR tối ưu sau Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex real-time PCR Để cho thuận tiện việc phát đồng thời gene blaOXA A baumannii vi khuẩn khác lồi Acinetobacter spp., chúng tơi kết hợp mồi/mẫu dò phát blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 16S rRNA phản ứng Các thông số nồng độ enzyme, nồng độ MgCl2 nồng độ mồi/mẫu dò tối ưu mẫu DNA tổng hợp nhân tạo Bảng Giá trị Ct tối ưu phản ứng multiplex real-time PCR [DNA]* 4x102 4x104 4x106 4x108 E R2 OXA-23 OXA-51 OXA-58 16S rRNA 33,6±0,6 33,8±0,0 33,7±0,6 35,4±1,3 27,7±0,6 27,8±1,0 29,3±0,4 28,1±0,6 21,0±0,1 20,3±0,7 20,0±0,6 20,8±1,6 12,2±0,2 12,8±0,9 13,3±0,4 14,2±0,8 90,5 90,3 90,7 90,8 0,991 0,991 0,981 0,984 * Nồng độ mẫu DNA: sao/phản ứng Kết (Bảng 2) cho thấy phản ứng multiplexreal-time PCR đạt điều kiện tối ưu theo tiêu chí phản ứng real-time PCR Hơn nữa, giá trị Ct nồng độ mẫu phản ứng multiplex real-time PCR gần tương đương với phản ứng monoplex real- time PCR (Bảng 1) Vì thế, phản ứng multiplex real-time PCR cho tối ưu thành công để phát đồng thời gene bla OXA A baumannii vi khuẩn Acinetobacterspp khác phản ứng Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 81 Đánh giá quy trình multiplex real-time PCR Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu phản ứng multiplex real-time PCR phát A baumannii vừa tối ưu xác định cách thực phản ứng mẫu DNA có nguồn gốc từ chủng A baumannii (ATCC 19606) số chủng A baumannii lâm sàng, đồng thời với DNA từ chủng vi khuẩn khác như: Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, E coli (ATCC 25922, 35218, 35401), Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Salmonella typhimurium (ATCC 29946), Salmonella para typhimurium, Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Shigella boydii (ATCC 8700), Shigella flexneri (ATCC 15391), Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802) Kết cho thấy có DNA chủng A baumannii cho tín hiệu dương tính, mẫu DNA vi khuẩn khác khơng cho tín hiệu dương tính với với màu huỳnh quang quy trình Chứng tỏ quy trình xây dựng đặc hiệu với gene blaOXA A baumannii Một số sản phẩm PCR gene blaOXA tương ứng giải trình tự Kết hồn tồn phù hợp với trình tự gene blaOXA khác cơng bố ngân hàng liệu NCBI Độ nhạy Để đánh giá độ nhạy phản ứng multiplex real-time PCR, DNA mẫu vi khuẩn A baumannii TN19 (1,78x106 sao/μl) mang gene blaOXA-51 blaOXA-58 mẫu A baumannii YD132 (2,76x106 sao/μl) TN19* 3,56x10-1 3,56x100 3,56x101 3,56x102 3,56x103 3,56x104 3,56x105 3,56x106 E R2 mang gene blaOXA-23 blaOXA-51 pha loãng bậc 10 thành nồng độ nhỏ Thành phần chương trình nhiệt tối ưu phản ứng multiplex real-time PCR sử dụng Bảng Giá trị Ct độ nhạy phản ứng multiplex real-time PCR blaOXAblaOXAblaOXA16S 16S YD132* 51 58 rRNA 23 51 rRNA 5,52x10N/A N/A N/A N/A N/A N/A blaOXA- 36,6±0,9 34,4±0,8 30,6±0,3 26,9±0,4 23,0±0,2 19,3±0,2 16,0±0,0 90,8 0,995 36,1±0,4 37,1±0,2 5,52x100 34,4±0,3 34,5±0,5 35,1±0,1 5,52x101 31,4±0,5 30,6±0,6 31,4±0,3 5,52x102 27,6±0,4 26,9±0,2 28,1±0,2 5,52x103 23,7±0,3 22,9±0,6 24,6±0,2 5,52x104 20,0±0,6 19,4±0,3 19,7±0,0 5,52x105 16,6±0,2 15,8±0,2 16,5±0,0 5,52x106 13,3±0,5 90,4 90,0 E 0,997 0,992 0,992 R 90,2 * Đơn vị nồng độ mẫu: sao/phản ứng Kết (Bảng 3) cho thấy độ nhạy đạt quy trình multiplex real-time PCR phát gene OXA A Baumannii khoảng sao/phản ứng 34,2±0,2 31,6±0,3 28,3±1,1 25,8±0,8 21,8±0,2 18,2±0,2 15,4±0,7 0,99 104,2 35,4±0,1 34,4±0,4 31,3±0,1 26,8±0,8 22,7±1,0 19,2±0,8 15,2±1,3 0,997 91,0 Tổng hợp kết khảo sát mẫu DNA tổng hợp nhân tạo mẫu DNA gene số vi khuẩn A baumannii cho thấy khoảng động học phản ứng multiplex Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 82 real-time PCR ổn định từ 4x100 – 4x108 sao/phản ứng Độ ổn định Quy trình xác định tính ổn định cách thực lập lại ba lần nồng độ mẫu DNA tổng hợp nhân tạo, ba thời điểm khác nhau, cách tuần, có nồng độ 2x101 2x108 sao/µl Bảng 4.Giá trị Ct độ ổn định phản ứng multiplex real-time PCR Thời điểm [DNA]* blaOXA-23 blaOXA-51 blaOXA-58 16S rRNA 4x108 12,9±0,1 13,0±0,2 13,8±0,1 14,2±0,2 4x10 35,4±0,7 36,1±0,9 35,8±0,3 36,5±0,5 4x108 13,1±1,0 13,5±0,6 14,0±0,0 15,4±0,5 4x10 34,7±0,9 34,7±1,5 35,0±1,9 35,4±1,2 4x108 14,0±0,8 14,1±0,3 15,6±0,8 15,2±1,2 4x10 34,9±0,2 35,8±0,9 37,0±0,4 34,6±0,1 * Nồng độ mẫu DNA: sao/phản ứng Kết (Bảng 4) cho thấy quy trình ổn định qua lần lập lại thời điểm khác mẫu DNA tổng hợp nhân tạo có nồng độ cao nồng độ thấp Thử nghiệm quy trình multiplex real-time PCR Quy trình multiplex real-time PCR áp dụng thử nghiệm 117 mẫu vi khuẩn thu thập bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Sản phẩm PCR số mẫu DNA có tín hiệu dương tính gene blaOXA 16S rRNA giải trình tự để kiểm chứng Bảng Kết phát gene blaOXA 16S rRNA A baumannii Acinetobacter spp phương pháp multiplex real-time PCR Gen Kết Dương tính Âm tính Tổng blaOXA-23 n 39 26 65 % 60 40 100 blaOXA-51 blaOXA-58 n 46 19 65 n 62 65 Kết (Bảng 5) cho thấy mẫu vi khuẩn thu thập được, có 65 (55,6%) chủng xác định Acinetobacter spp qua diện gene 16S rRNA Trong chủng Acinetobacter spp này, có 46 (70,8%), 39 (60%) (4,6%) chủng mang gene blaOXA-51, blaOXA-23 % 70,8 29,2 100 % 4,6 95,4 100 16S rRNA n % 65 55,6 52 44,4 117 100 OXA-58 Các chủng mang gene blaOXA-51 cho chủng A baumannii mà nghiên cứu tìm kiếm Tất cả chủng A baumannii đồng thời mang thêm gene blaOXA-23 (39/46), không chủng mang blaOXA-58 (0/46) Số chủng mang gene bla OXA-58 thuộc vào nhóm khơng có bla Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 OXA-51, xếp vào nhóm Acinetobacter spp Kết giải trình tự xác nhận tính đặc hiệu sản phẩm nhân tương ứng xác cho gene phát quy trình multiplex real-time PCR bla Hiện nay, phương pháp phát A baumannii chủ yếu phương pháp ni cấy truyền thống, A baumannii dễ nuôi cấy Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp thời gian để phân lập, định danh vi khuẩn Hình thái (que ngắn, nhầy) đặc tính khó tẩy màu làm dễ bị định danh nhầm với vi khuẩn Gram (-) (+) hình cầu khác Hơn nữa, hệ vi khuẩn A Calcoaceticus - A baumannii lại giống với Enterobacteriaceae Ngoài ra, để định danh xác A baumannii, phương pháp lai DNA-DNA phương pháp tiêu chuẩn Tuy nhiên, phương pháp tốn cơng lao động khó ứng dụng thường qui chẩn đoán lâm sàng Một số phương pháp sinh học phân tử phát triển sử dụng để định danh xác chủng Acinetobacter phân tích phân đoạn cắt giới hạn gen 16S rRNA (ARDRA), phương pháp phân tích đa hình phân đoạn gen nhân bản, ribotyping, phân tích trình tự vùng spacer gen 16S-23S rRNA Tất phương pháp thời gian, sử dụng chủ yếu phòng thí nghiệm Những nghiên cứu gần cho thấy khả phát nhanh A baumannii real-time PCR dựa nhóm gen blaOXA-51, gen thể vi khuẩn Ưu điểm phương pháp đỡ tốn thời gian thực quy trình kỹ thuật, khả thực nhiều mẫu lúc, hạn chế ngoại nhiễm độ nhạy độ đặc hiệu cao Hơn nữa, quan điểm lâm sàng kiểm soát nhiễm khuẩn, điều cần thiết phải phát phân biệt A baumannii lồi Acinetobacter khác, khơng phải A baumannii lồi Acinetobacter khác đối tượng quan tâm cơng tác kiểm sốt nhiễm khuẩn thường nhạy với nhiều loại kháng sinh việc nhiễm khuẩn gây loài vi khuẩn thường không đáng lo ngại Trên quan điểm nghiên cứu, việc xác định xác A baumannii giúp hiểu rõ dịch tễ học lâm 83 sàng chế sinh bệnh vi khuẩn gây Hệ enzyme β-lactamase tạo cách đặn tồn tự nhiên A baumannii thường bao gồm AmpC oxacillinase có hoạt tính carbapenemase Cùng với enzyme tự nhiên này, vài βlactamase thu nhận từ ngồi xác định có hoạt tính carbarpenemase, enzyme thuộc lớp B (Metallo β-lactamase) lớp D (OXA β-lactamase) theo hệ thống phân loại Ambler, yếu tố quan trọng giúp A baumannii có khả kháng lại carbapenem (imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem) Mặc dù Metallo β-lactamse có hoạt tính carbapenemase mạnh cho khơng thường xun diện A.baumannii, cịn oxacillinase có khả phân giải carbapenem, lại ln diện A baumannii Carbapenemase phổ biến A.baumannii nhóm OXA β-lactamase Hiện nay, bốn nhóm OXA β-lactamase đươc xác định A baumannii là: blaOXA-23, blaOXA24, blaOXA-51 blaOXA-58 Trong đó, bla OXA-51 enzyme mã hóa nhiễm sắc thể đặc trưng cho A baumannii; bla OXA-23, blaOXA-24 blaOXA-58 enzyme mã hóa plasmid, nguyên nhân giúp chúng lan truyền mạnh cộng đồng Nghiên cứu dựa đặc tính sở hữu gene blaOXA-51 để định danh xác A baumannii đồng thời phát số gene blaOXA điển hình khác A baumannii blaOXA-23 blaOXA-58 nhằm đánh giá tính phổ biến gene blaOXA quần thể chủng vi khuẩn A baumannii thu thập Qui trình tạo nghiên cứu khơng bao gồm blaOXA-24 tác giả thực nghiên cứu khảo sát trước diện gene; kết cho thấy không phát gene 252 chủng vi khuẩn Acinetobacter spp khảo sát (kết đây) Kết khảo sát phổ biến gene blaOXA nghiên cứu cho thấy diện blaOXA-51 / A baumannnii nhóm vi khuẩn Acinetobacter spp / 16S rRNA+ chiếm 70,8% Kết phù hợp Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 tương nhận định “A baumannii chiếm 80% trường hợp bị nhiễm chủng thuộc Acinetobacter” Hơn nữa, tất chủng A baumannnii mang gene blaOXA23 Điều xác định tính phổ biến gene 84 quần thể vi khuẩn A baumannnii thu thập Các hướng nghiên cứu cần tiến hành để đánh giá vai trò gene tính đa kháng sinh A baumannii KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Quy trình multiplex real-time PCR xây dựng cho phép phát loài vi khuẩn Acinetobacter spp phát xác A baumannii dựa gene blaOXA-51, đồng thời xác định xem chủng vi khuẩn có mang thêm gene blaOXA khác, phổ biến A baumannii hay không, bla OXA-23 blaOXA-58 TÀI LIỆU THAM KHẢO HIGGINS, P.G., DAMMHAYN, C., HACKEL, M., SEIFERT, H., (2010) Global spread of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii J Antimicrob Chemother 65 (2) 233-238 MA, Z., ZHOU, L.Q., WANG, H., LUO, L.P., (2015) Investigation on the genomic diversity of OXA from isolated Acinetobacter baumannii International Journal of Clinical and Experimental Medicine (3) 4429-4432 NGUYỄN, T.A., HUỲNH, M.T., NGUYỄN, V.V.C., HỒ, H.T.D., (2014) Xây dựng qui trình EvaGreen real-time PCR phát gene blaOXA Acinetobacter baumannii Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh 18 (5) 197-201 NGUYỄN, T.A., ĐÀO, M.Y., HUỲNH, T.T.H., HỒ, H.T.D., (2015) Xây dựng đánh giá quy trình phát Acinetobacter baumannii real-time PCR Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh 19 (5) 194-199 NIGRO, S., HALL, R.M., (2015) Distribution of the blaOXA-23-containing transposons Tn2006 and Tn2008 in Autralian carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolates Journal of Antimicobial Chemotherapy Research letter NORDMANN, P., POIREL, L., (2002) Emerging carbapenemases in Gram-negative aerobes Clin Microbiol Infect (6) 321-31 OIKONOMOU, O., SARROU, S., PAPAGIANNITSIS, C.C, GEORGIADOU, S., MANTZARLIS, K., ZAKYNTHINOS, E., DALEKOS, G.N., PETINAKI, E., (2015) Rapid dissemination of colistin and carbapenem resistant Acinetobacter baumannii in central Greece: mechanisms of resistance, molecular identification and epidemiological data BMC infectious diseases 15 (1) 559 POIREL, L., NORDMANN, P., (2006) Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology Clin Microbiol Infect 12 (9) 826-836 PEREZ, F., HUJER, A.M., HUJER, K.M., DECKER, B.K., RATHER, P.N., BONOMO, R.A., (2007) Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Antimicrob Agents Chemother 51 (1) 3471-84 10 ZARRILLI, R., GIANNOULI, M., TOMASONE, F., TRIASSI, M., TSAKRIS, A., (2009) Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: the molecular epidemic features of an emerging problem in health care facilities J Infect Dev Ctries (5) 335341 ... 0, 023 93 95,74 12, 6 2, 40 0, 021 95 87,79 10,3 2, 37 0, 022 93 91,73 10 2, 87 0, 024 78 99, 12 17,1 2, 62 0, 024 56 98 ,24 14 2, 34 0, 023 78 95,11 11,3 2, 32 95,04 4 ,24 Bản tin Khoa học Trẻ số 2( 1) ,20 16 Từ kết tỉ... 600 400 40,000 20 0 20 ,000 Số rùa mẹ lên đẻ trứng Số tổ đẻ thành công Số lượng trứng Số rùa nở xuống biển 20 14 20 13 20 12 2011 20 10 20 09 20 08 20 07 20 06 20 05 20 04 20 03 20 02 2001 20 00 1999 1998 1997... 19941995199619971998199 920 0 020 0 120 022 00 320 0 420 0 520 0 620 0 720 0 820 0 920 1 020 1 120 122 01 320 14 Hình 1: Biểu đồ số lượng Vích mẹ lên sinh sản Từ biểu đồ cho ta thấy theo thời giai đoạn 1981-1990 từ 80- 125 , gian, số lượng