Vật liệu
Tuyến trùng Heterorhabditis indica CP 16 do TS. Nguyễn Ngọc Châu, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Việt Nam cung cấp. Vi khuẩn chỉ thị Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella sp., sâu khoang Spodoptera litura và sâu xanh da láng Spodoptera exiguado Phịng thí nghiệm Đại học Công nghệ TP.HCM cung cấp.
Phương pháp nghiên cứu Phân lập và định danh
Phân lập vi khuẩntừ tuyến trùng Heterorhabditis indica CP 16được tiến hành dựa vào phương pháp của Akhurst (1980) trên môi trường MacConkey và NBTA. Chủng phân lập được khảo sát hình thái, sinh lý và sinh hóa bằng phương pháp vi sinh thông thường và sử dụng Kit API 20E (Biomerieux), giải trình tự gene 16S rRNA (Công ty Namkhoa Biotek). Kết quả giải trình tự được tra cứu trên ngân hàng Gene sử dụng phần
mềm BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Trích ly và phân tích sắc tố
Tăng sinh vi khuẩn phân lập tổng hợp sắc tố trong môi trường NB 24 giờ, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Thử nghiệm trích ly sắc tố từ tế bào và canh trường bằng các hệ dung môi: chloroform 100% và ether dầu hỏa 100%, choloroform 100% và ether dầu hỏa:nước muối bão hoà (1:1; v/v), methanol:HCl 1N (95:5; v/v) và ether dầu hỏa 100% (1:1, v/v), methanol: HCl 1N (95:5; v/v) và Ether dầu hỏa : nước muối bão hoà (1:1; v/v). Quan sát sự tách pha để lựa chọn hệ dung mơi trích ly sắc tố.
Phân tích sắc tố bằng phương pháp quét phổ hấp thụ trong khoảng 400 – 700 nm để xác định λmax, sắc ký bản mỏng TLC trong ethyl acetate 100%; ether dầu hỏa : acetone (7:3; v:v), khối lượng phân tử bằng phương pháp khối phổ ion hoá phun điện tử (ESI – MS). Khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng 1- 14 đến phổ hấp thụ của sắc tố và độ bền nhiệt của sắc tố ở nhiệt độ phòng, 37 oC, 50 oC, 65 oC, 85 oC và 100 oC trong 15 phút.
Khảo sát quá trình tổng hợp sinh khối và sắc tố của vi khuẩn
Tăng sinh chủng vi khuẩn được chọn trong môi trường NB, cấy giống 1 %, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng 72 giờ. Theo dõi mật độ tế bào và nồng độ sắc tố tổng hợp được.
Để khảo sát ảnh hưởng của oxy lên tổng hợp sắc tố, thực hiện như trên trong điều kiện kỵ khí, khơng lắc, lắc 150 vịng/phút và lắc 180 vòng/phút 48 giờ. Để khảo sát ảnh hưởng pH dùng NaOH hoặc HCl điều chỉnh pH môi trường ban đầu. Để chọn môi trường tổng hợp prodigiosin cao nhất các môi trường môi trường NB, PG, môi trường dịch chiết protein hạt đậu phộng và môi trường dịch chiết protein hạt mè được sử dụng. Xác định hàm lượng sắc tố vi khuẩn tổng hợp được trong mỗi nghiệm thức của mỗi thí nghiệm.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của sắc tố
Vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong mơi trường NB, lắc 150 vịng/phút ở nhiệt độ phòng, 24 giờ, điều chỉnh mật mật độ tế bào về 4 x 107 cfu/ml.
Khảo sát hoạt tính diệt sâu của sắc tố Sâu khoang Spodoptera litura vàSpodoptera exigua được đưa vào thí nghiệm. Mỗi hộp thí nghiệm chứa 30 sâu tuổi 3 và 3 lá thầu dầu, quét lên bề mặt mỗi lá 200 μl sắc tố ở các nồng độ pha loãng. Mẫu đối chứng thay prodigiosin bằng 200 μl dung dịch pha lỗng PBS. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và theo dõi sâu chết theo thời gian đến khi hộp đối chứng chuyển sang nhộng.
Xử lý số liệu
Phân tích ANOVA bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân lập, định danh vi khuẩn từ tuyến trùng Heterorhabditis indica CP 16
Sau khi phân lập trên môi trường NBTA và MacConkey, chủng vi khuẩn phân lập được đặt tên chủng SH1. Quan sát hình thái, sinh lý, sinh hóa cho phép nghi ngờ đây là Serratia marcescens. Kết quả thử nghiệm API 20E Kit cho kết quả định danh là Serratia marcescens với tỉ lệ tương đồng 97,4 %. Giải trình tự gene 16S rRNA của chủng vi khuẩn phân lập được và so sánh với các trình tự trên Genbank của NCBI cho thấy tỷ lệ tương đồng của SH1 với các chủng thuộc loài Serratia marcescens 99,7 - 100%. Như vậy, chủng phân lập được gọi tên
là Serratia marcescens SH1 và có thể truy cập trên ngân hàng gene NCBI với mã số truy cập là KF534508.
Tách chiết và phân tích sắc tố
Dung mơi trích ly: methanol: HCl 1N (95:5; v:v) và ether dầu hỏa: nước muối bão hồ (1:1; v:v) trích ly sắc tố từ tế bào vi sinh vật tỏ ra thích hợp cho tách pha tốt, màu nằm hoàn toàn trong pha hữu cơ.
Phổ hấp thụ của sắc tốtừ 400 nm đến 700 nm cho thấy trong dung mơi ethanol: HCl bước sóng hấp thụ cực đại là 535 nm, phù hợp báo cáo của Giri và đồng tác giả (2004).
Sắc ký bản mỏng sắc tố trong hai hệ dung môi ether dầu hỏa: acetone (7:3; v/v) và ethyl acetate chỉ thu 1 vạch sắc tố hồng với Rf lần lượt là 0,68 và 0,84.
Kết quả phân tích khối phổ cho thấy [M + H]+ = 324,8 Da. Các peak tiếp theo là [M+2H+H]+=326,8 Da, [M+4H+H]+=328,8 Da và [M+6H+H]+=330,8 Da có thể do sự hydro hóa 1,2 hoặc 3 vịng pyrrole tạo thành các pyrrolidine. Các kết quả trên đây chứng minh sắc tố màu đỏ do S. marcescens SH1 tổng hợp là prodigiosin.
Sự bền nhiệt của sắc tốthể hiện ở 100 oC 15 phút thì sắc tố vẫn không đổi màu và định lượng cho thấy không giảm.
Các yếu tố ảnh hưởng lên sinh tổng hợp sắc tố
Động học tổng hợp sinh khối và sắc tố được trình bày trên hình 1A. Có thể thu nhận sắc tố từ 40-60 giờ. Hình 1B cho thấy vận tốc lắc tối thiểu là 150 vòng/phút để bảo đảm oxy cho sinh tổng hợp prodigiosin. Hình 1C cho thấy S. marcescens tổng hợp sắc tố prodigiosin tốt nhất ở pH 7,5. Trong số các môi trường thử nghiệm, môi trường protein hạt đậu phộng và hạt mè làm tăng tổng hợp prodigiosin lên thêm 68,9 % và 122,0 % tương ứng so với môi trường NB, phù hợp nghiên cứu trước đó (Giri et al., 2004). Môi trường peptone glycerol (PG) cho nồng độ sắc tổ tổng hợp cao nhất, vượt môi trường NB 163,0 %, cao hơn môi trường protein đậu phộng và mè tương ứng 55,7 % và 18,5 % và đạt nồng độ 10,575 mg/ml sắc tố (Hình 1D)
.
Hình 1. A) Đường cong tăng trường và tổng hợp săc tố của SH1. B) Ảnh hưởng của oxy
đến quá trình tổng hợp sắc tố. C) Ảnh hưởng của pH mơi trường lên q trình tổng hợp sắc tố. D) Ảnh hưởng của mơi trường lên q trình tổng hợp sắc tố.
Hoạt tính kháng khuẩn của sắc tố Khả năng kháng khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli và
Salmonella sp. của prodigiosin phụ thuộc vào nồng độ, kết quả được trình bày trong Hình 2
.
Hình 2. Khả năng kháng khuẩn của prodigiosin.
Khả năng kháng khuẩn của sắc tố đối với vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus và vi khuẩn Gram âm Escherichia coli và Salmonella sp. là tương tự nhau, khơng hồn tồn khớp với báo cáo của Chandni và đồng tác giả (2012) cho rằng prodigiosin có khả năng kháng vi khuẩn Gram dương mạnh hơn so với vi khuẩn Gram âm.
Hiệu lực diệt sâu của prodigiosin Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura
Sau 120 giờ cho ăn, liều lượng 27,66 ng/cm2 và 24,40 ng/cm2 gây chết gần 90 % sâu khoang S. litura và 80 % sâu xanh da láng
S. exigua, thể hiện hiệu lực diệt sâu mạnh nhất (Hình 3). Đặc biệt đây chỉ là các liều lượng trung bình trong thí nghiệm, điều này có thể liên quan đến tính kị nước của prodigiosin. Sâu sống sót hóa nhộng và hóa bướm, tuy nhiên 60% nhộng khơng thể hóa bướm và chết ở giai đoạn đó, số nhộng hóa bướm bị dị tật ở cánh và bụng không thể bay và sinh sản. LC¬50 của Cry 1C protein đối với Spodoptera litura mới nở từ 2 – 5 ng/cm2, Spodoptera litura tuổi 2 là 70 ng/cm2 thử nghiệm trong 5 ngày (Lereclus et al., 2005), chứng tỏ prodigiosin trong thí nghiệm này có hiệu lực diệt sâu khoang mạnh hơn Cry 1C protein.
Hình 3. Tỷ lệ chết của sâu khoang Spodoptera litura A) và sâu xanh da láng Spodoptera
exigua B) khi cho ăn lá thầu dầu tẩm prodigiosin. Như vậy sắc tố prodigiosin của vi khuẩn
S. marcescens SH1 có nhiều tiềm năng trong
việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học.
KẾT LUẬN
Tóm lại, kết quả nghiên cứu trên cho thấy prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn SH1 phân lập từ tuyến trùng diệt sâu Heterorhabditis indica CP16 có hoạt tính
kháng khuẩn Gram dương và Gram âm, đặc biệt diệt sâu rất mạnh khi cho ăn. Prodigiosin hứa hẹn trở thành tác nhân kiểm soát sinh học mới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Akhurst R. J., 1980. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus, bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis. Microbiology, 121: 303-309.
2. Chadni G., Sourav B. và Arijit D., 2012. Assessment pf process parameters influencing the enhanced production of prodigiosin form Serratia marcescens and evaluation of its antimicrobial, antiozidant and dyeing potentials, Malaysian Journal of Microblology, vol 8: 116-122.
3. Giri A.V., Anandkumar N., Muthukumaran G. and Pennathur G., 2004. A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil, BMC Microbiology, 4: 11.
4. Bravo A., Lereclus D., Agaisse H., Salamitou S., Sanchis V (2000). Strains of Bacillus thuringiensis and pesticide composition containing them. US 6096306 A.
5. Tsuji R.F., Yamamoto M., Nakamura A., Kataoka T., Magae J., Nagai K., Yamasaki M., 1990. Selective immunosuppression of prodigiosin 25-C and FK506 in the murine immune system, J Antibiot, 43: 1293-1301.