II. VẬT LIỆUVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
XÂY DỰNG QUY TRÌNH TAQ-MAN REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ NHÓM GENE blaOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANN
NHÓM GENE blaOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII
Nguyễn Tuấn Anh1*, Huỳnh Minh Tuấn2, Nguyễn Kim Huyền2, Nguyễn Vũ Hoàng Yến2, Trịnh Thị Thoa2, Huỳnh Kim Ngân2, Võ Thị Tuyết Nga2, Nguyễn Văn Vĩnh Châu3, Hồ
Huỳnh Thùy Dương14
1 Công ty TNHH Cơng nghệ Sinh học Khoa Thương 2 Khoa Kiểm sốt Nhiễm khuẩn, Bệnh viện Đại học Y Dược
3 Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
4 Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh * Nguyễn Tuấn Anh, Email: ntanhbio@gmail.com
TÓM TẮT
Tổng quan: Acinetobacter baumannii là một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện
nguy hiểm hàng đầu hiện nay. Đặc biệt, các chủng A. baumannii sở hữu một số nhóm gene blaOXA, có khả năng biểu hiện tính đa kháng kháng sinh, nhất là đối với carbapenem.
Mục đích: Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình Taq-Man real-time PCR phát hiện một số
nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-51 và blaOXA-58 điển hình ở A. baumannii.
Phương pháp: Quy trình sử dụng các mẫu dị Taq-Man được thiết kế đặc trưng cho từng nhóm
gene với các kênh màu khác nhau (Cy5, FAM, Texas Red, HEX) để phát hiện các nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 và gene 16S rRNA tương ứng trong cùng một phản ứng. Phản ứng multiplex real-time PCR này được tối ưu để đạt hiệu suất nhân bản tốt nhất cho tất cả các gene đích cần phát hiện.
Kết quả: Kết quả cho thấy quy trình có khả năng phát hiện chính xác các gene blaOXA-23, blaOXA-51 và blaOXA-58 đặc trưng của A. baumannii với độ nhạy (4 bản sao/phản ứng) và độ đặc hiệu cao, khơng cho tín hiệu dương tính với DNA của nhiều lồi vi khuẩn thường thấy trong bệnh viện.
Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành cơng quy trình Taq-Man real-time PCR phát hiện một
số nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-51 và blaOXA-58 ở A. baumannii. Quy trình có thể được sử dụng để đồng thời phát hiện nhanh các chủng A. baumannii và một số nhóm gene kháng kháng sinh của chúng. Quy trình có thể được ứng dụng để nghiên cứu dịch tễ học phân tử về sự hiện diện một số nhóm gene blaOXA phổ biến ở A. baumannii.
Từ khóa: A. baumannii, β-lactamase, carbapenemase, OXA, real-time PCR, Taq-Man
ABSTRACT
DEVELOPMENT OF A TAQ-MAN REAL-TIME PCR ASSAY FOR THE DETECTION OF SEVERAL blaOXA GENES IN ACINETOBACTER BAUMANNII
Nguyen Tuan Anh*, Huynh Minh Tuan*, Nguyen Kim Huyen, Nguyen Vu Hoang Yen, Trinh Thi Thoa, Huynh Kim Ngan, Vo Thi Tuyet Nga, Nguyen Van Vinh Chau,
Ho Huynh Thuy Duong
Backgrounds: Acinetobacter baumannii currently is one of the most leading and dangerous
factors causing nosocomial infections. In addition, A. baumannii harbouring several blaOXA genes could express the ability of multidrug resistance, especially with carbapenem.
Objectives: To set up a Taq-Man real-time PCR protocol for the detection of several typical
blaOXA genes in A. baumannii, including blaOXA-23, blaOXA-51 and blaOXA-58 genes.
Methods: The process using Taq-Man probes was designed specifically to individual genes
with distinguish flourophores (Cy5, FAM, Texas Red, HEX) to detect blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 and 16S rRNA correspondingly in one reaction. The multiplex Taq-Man real-time PCR was optimized to get the highest amplification efficiency for all targeted genes.
Results: The results showed that the protocol could detect precisely blaOXA-23, blaOXA-51 and blaOXA-58 genes specific to A. baumannii with high sensitivity (4 copies/reaction) and
specificity, not reacting with DNA of many common bacteria in hospital environment.
Conclusions: We built up a Taq-Man real-time PCR protocol successfully for the detection of
blaOXA-23, blaOXA-51 and blaOXA-58 genes in A. baumannii. The protocol can also be used to identify A. baumannii rapidly and their antimicrobial resistant blaOXA genes. Potentially, the protocol might become a tool to study molecular epidemiology of blaOXA genes popularly in
A. baumannii.
Keywords: A. baumannii, β-lactamase, carbapenemase, OXA, real-time PCR, Taq-Man
TỔNG QUAN
Acinetobacter baumannii (A.
baumannii) có cấu trúc của một cầu trực
khuẩn Gram âm, nguồn gốc từ thiên nhiên (đất, nước), hiếu khí tuyệt đối và dễ mọc trên các mơi trường thông thường. Khuẩn lạc nhẵn, màu xám trắng, đơi khi hơi nhầy, đường kính khoảng từ 1,5 - 3 mm. A. baumannii có khả năng thích ứng với điều kiện và môi trường sống đa dạng, tồn tại lâu trong môi trường bệnh viện, đặc biệt trên những dụng cụ y tế. Nhờ khả năng tạo màng sinh học (biofilm) với tính bám dính cao, vi khuẩn A. baumannii có thể gắn chặt vào bề mặt dụng cụ, môi trường, và trên da người khỏe mạnh, đặc biệt là nhân viên chăm sóc sức khỏe, tạo điều kiện cho vi khuẩn dễ dàng lây lan và tồn tại lâu dài, thu nhận, tích lũy nhiều gene kháng kháng sinh và từ đó có thể trở thành tác nhân đa kháng, gây khó khăn trong điều trị và kiễm sốt nhiễm khuẩn. Có nhiều lồi Acinetobacter và tất cả chúng đều có khả năng gây bệnh cho người, trong đó A. baumannii chiếm hơn 80% trường hợp bị nhiễm bởi các chủng thuộc
Acinetobacter. Sự nguy hiểm của A. baumannii ở chỗ nó có khả năng kháng lại tất
cả các loại kháng sinh hiện nay. Và vì thế, đặc biệt nguy hiểm cho những bệnh nhân nằm viện lâu ngày, phải dùng các biện pháp can thiệp như ống thở hay kim truyền liên tục, dùng quá nhiều kháng sinh hoặc bị suy giảm miễn dịch. A. baumannii đã và đang trở thành
loại vi khuẩn siêu kháng thuốc, nổi lên như tác nhân hàng đầu gây nhiễm trùng tại các bệnh viện trên thế giới [7].
Carbapenem thường được sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn do A. baumannii, đặc
biệt đối với các chủng kháng thuốc, nhưng hiện nay thường khơng cịn hiệu quả bởi sự trỗi dậy của các chủng đa kháng (multidrug resistance – MDR) hoặc đa kháng mở rộng (extensive drug resistance - XDR) [9]. Nhiều cơ chế kháng liên quan đến tính kháng carbapenem ở A. baumannii như sản xuất
carbapenemase, bất hoạt kháng sinh, các protein màng bị biến đổi, tăng biểu hiện các bơm màng hay sự mất các kênh màng / thay đổi tính thấm của màng. Tính kháng với carbapenem ở A. baumannii liên quan chủ yếu
tới sự biểu hiện của β-lactamase / carbapenemase; trong khi những cơ chế khác chỉ đóng vai trị thứ yếu [8]. Bên cạnh đó, carbapenemase phổ biến nhất ở A. baumannii là β-lactamase mã hóa bởi blaOXA [10].
Nhóm gene oxacilinase (blaOXA) là một trong những nhóm gene kháng kháng sinh β-lactam của A. baumannii có khả năng giúp vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau, đặc biệt carbapenem [5]. Nhóm gene này thường được mã hóa trên plasmid giúp tính kháng có thể lan truyền giữa các chủng vi khuẩn. Sản phẩm của nhóm gene này là enzyme oxacilinase, có khả năng thủy phân
carbapenem [6]. Nhóm gene này được chia thành 8 nhóm phụ, trong đó có 4 nhóm đã được phát hiện ở A. baumaniii là blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 và blaOXA-58 [2]. Dịch tễ học phân tử cho thấy các nhóm gene blaOXA phổ biến tùy khu vực khác nhau trên thế giới [1, 8, 10].
Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình Taq-Man real-time PCR phát hiện đồng thời các gene blaOXA-23, -51, -58 trong cùng một phản ứng, giúp nhanh chóng và dễ dàng trong cơng tác nghiên cứu dịch tễ học phân tử các gene này. Từ đó, có cơ sở xác định những chủng nguy hiểm, nguy cơ cao gây nhiễm trùng bệnh viện.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Vật liệu
Vi khuẩn A. baumannii chuẩn (ATCC 19606) mang gene blaOXA-51 và các mẫu vi khuẩn A. baumannii được phân lập bởi khoa
Kiểm soát nhiễm khuẩn của bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 01/2012 đến tháng 12/2013.
Chọn lựa và thiết kế mồi
Các cặp mồi/mẫu dò đặc hiệu cho từng nhóm gene blaOXA-23, -51, -58 của A. baumannii và cặp mồi/mẫu dò đặc hiệu cho
gene 16S rRNA (Acinetobacter spp.) làm chứng nội phản ứng được chọn từ một số nghiên cứu trước [3, 4] và thiết kế mới như sau
O23-P: Cy5 –
TTGCGCGACGTATCGGTCTTGATC -
BHQ2; O58-P: Texas Red –
TTTACTTTGGGCGAAGCCATGCAAG - BHQ2. Mồi và mẫu dò được đặt tổng hợp tại công ty IDT (Integrated DNA Technologies, USA).
Phương pháp tách chiết DNA của A. baumannii
Khuẩn lạc đặc trưng của A. baumannii được thu nhận và tăng sinh trong môi trường LB ở điều kiện 370C trong 24 giờ. Sau khi kết thúc tăng sinh, DNA bộ gene của A. baumannii được tách chiết theo nguyên tắc
hấp phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica) bằng bộ kit tách chiết “DNA column-based extraction kit” (Khoa Thương). Tất cả mọi thao tác đều được thực hiện theo đúng hướng dẫn trong bộ kit của nhà sản xuất.
Thành phần phản ứng multiplex Taq-Man real-time PCR
Hỗn hợp phản ứng multiplex Taq-Man real-time PCR tối ưu có thành phần gồm1X buffer, 3 mM MgCl2, 400 nM dNTPs và 2X h- Taq DNA polymerase (Solgent), 200 nM cho từng cặp mồi O23-F/R, O51-F/R và O58-F/R, 100 nM cho từng mẫu dò O23-P, O51-P và O58-P, 400 nM cho cặp mồi 16S-F/R và 200 nM cho mẫu dị 16S-P (IDT), với 2 µl DNA trong tổng thể tích là 25µl. Chu trình nhiệt cho
phản ứng multiplex Taq-Man real-time PCR: 15 phút – 95oC và 30 chu kỳ lập lại gồm 10 giây - 95oC và 15 giây - 60oC. Tín hiệu được thu nhận với bốn màu huỳnh quang đặc trưng là FAM (510-530 nm), HEX (560-580 nm), Texas Red (597-616 nm) và Cy5 (646-669 nm). Quy trình được thực hiện trên các dịng máy ln nhiệt Stratagene Mx3000P hoặc Mx3005P (Agilent).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tối ưu điều kiện phản ứng monoplex real-time PCR
Từng bộ mồi/mẫu dò được tối ưu hiệu quả nhân bản với phản ứng monoplex real- time PCR bằng mẫu DNA tổng hợp nhân tạo của 4 đoạn gene tương ứng với 4 nồng độ như nhau: 2x102, 2x104, 2x106 và 2x108 bản
sao/µl. Các thơng số như nhiệt độ lai (Ta) của từng bộ mồi/mẫu dò, thành phần phản ứng lần lượt được tối ưu. Điều kiện để phản ứng real- time PCR tối ưu là hiệu suất phản ứng (E) từ 90% - 105% và hệ số tương quan (R2) > 0,980.
Bảng 1. Giá trị Ct tối ưu của phản ứng monoplex real-time PCR
[DNA]* OXA-23 OXA-51 OXA-58 16S rRNA
4x102 31,8±0,4 32,6±0,9 33,8±0,5 34,8±0,3 4x104 24,9±0,1 26,6±0,0 27,2±0,2 28,6±0,4 4x106 18,1±0,2 18,7±0,2 20,4±0,1 20,7±0,4 4x108 10,3±0,1 11,3±0,1 12,2±0,1 13,7±0,0 E 90,8 90,2 90,3 90,0 R2 0,998 0,995 0,997 0,997
*Nồng độ mẫu DNA: bản sao/phản ứng
Kết quả (Bảng 1) cho thấy các phản ứng monoplex real-time PCR đã đạt điều kiện tối ưu theo như tiêu chí (E = 90% - 105% và
R2 ≥ 0,980). Đây là điều kiện chuẩn để so sánh khi phản ứng multiplex real-time PCR được tối ưu sau này.
Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex real-time PCR
Để cho thuận tiện trong việc phát hiện đồng thời các gene blaOXA của A. baumannii và các vi khuẩn khác trong lồi Acinetobacter spp., chúng tơi kết hợp 4 bộ mồi/mẫu dò phát hiện blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 và
16S rRNA trong cùng một phản ứng. Các thông số như nồng độ enzyme, nồng độ MgCl2 và nồng độ từng bộ mồi/mẫu dò được tối ưu trên nền mẫu DNA tổng hợp nhân tạo như trên.
Bảng 2. Giá trị Ct tối ưu của phản ứng multiplex real-time PCR
[DNA]* OXA-23 OXA-51 OXA-58 16S rRNA
4x102 33,6±0,6 33,8±0,0 33,7±0,6 35,4±1,3 4x104 27,7±0,6 27,8±1,0 29,3±0,4 28,1±0,6 4x106 21,0±0,1 20,3±0,7 20,0±0,6 20,8±1,6 4x108 12,2±0,2 12,8±0,9 13,3±0,4 14,2±0,8 E 90,5 90,3 90,7 90,8 R2 0,991 0,991 0,981 0,984
*Nồng độ mẫu DNA: bản sao/phản ứng
Kết quả (Bảng 2) cho thấy phản ứng multiplexreal-time PCR đã đạt điều kiện tối ưu theo như tiêu chí của phản ứng real-time PCR. Hơn nữa, giá trị Ct tại 4 nồng độ mẫu của phản ứng multiplex real-time PCR gần tương đương với phản ứng monoplex real-
time PCR (Bảng 1). Vì thế, phản ứng multiplex real-time PCR được cho là đã tối ưu thành công để phát hiện đồng thời các gene blaOXA của A. baumannii và các vi khuẩn Acinetobacterspp. khác trong cùng một phản
Đánh giá quy trình multiplex real-time PCR
Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu của phản ứng multiplex real-time PCR phát hiện A. baumannii vừa tối ưu được xác định bằng cách thực hiện phản ứng trên mẫu DNA có nguồn gốc từ chủng A.
baumannii (ATCC 19606) và một số chủng A. baumannii lâm sàng, đồng thời với DNA từ
các chủng vi khuẩn khác như: Campylobacter
coli, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, E. coli (ATCC 25922, 35218, 35401), Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Salmonella typhimurium (ATCC 29946), Salmonella para typhimurium, Staphylococcus aureus (ATCC 12600),
Shigella boydii (ATCC 8700), Shigella
flexneri (ATCC 15391), Vibrio cholerae và
Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802). Kết
quả cho thấy chỉ có DNA của các chủng A. baumannii cho tín hiệu dương tính, các mẫu
DNA của các vi khuẩn khác khơng cho tín hiệu dương tính với với bất cứ màu huỳnh quang nào của quy trình. Chứng tỏ quy trình được xây dựng đặc hiệu với các gene blaOXA của A. baumannii. Một số sản phẩm PCR của các gene blaOXA tương ứng được giải trình tự. Kết quả hồn toàn phù hợp với các trình tự gene blaOXA khác đã được cơng bố trên ngân hàng dữ liệu NCBI.
Độ nhạy
Để đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex real-time PCR, DNA mẫu vi khuẩn
A. baumannii TN19 (1,78x106 bản sao/μl) mang gene blaOXA-51 và blaOXA-58 và mẫu
A. baumannii YD132 (2,76x106 bản sao/μl)
mang gene blaOXA-23 và blaOXA-51 được pha loãng bậc 10 thành 7 nồng độ nhỏ hơn. Thành phần và chương trình nhiệt tối ưu của phản ứng multiplex real-time PCR được sử dụng. Bảng 3. Giá trị Ct độ nhạy của phản ứng multiplex real-time PCR
TN19* blaOXA- 51 blaOXA- 58 16S rRNA YD132 * blaOXA- 23 blaOXA- 51 16S rRNA
3,56x10-1 N/A N/A N/A 5,52x10
-
1 N/A N/A N/A
3,56x100 36,6±0,9 36,1±0,4 37,1±0,2 5,52x100 34,4±0,3 34,2±0,2 35,4±0,1 3,56x101 34,4±0,8 34,5±0,5 35,1±0,1 5,52x101 31,4±0,5 31,6±0,3 34,4±0,4 3,56x102 30,6±0,3 30,6±0,6 31,4±0,3 5,52x102 27,6±0,4 28,3±1,1 31,3±0,1 3,56x103 26,9±0,4 26,9±0,2 28,1±0,2 5,52x103 23,7±0,3 25,8±0,8 26,8±0,8 3,56x104 23,0±0,2 22,9±0,6 24,6±0,2 5,52x104 20,0±0,6 21,8±0,2 22,7±1,0 3,56x105 19,3±0,2 19,4±0,3 19,7±0,0 5,52x105 16,6±0,2 18,2±0,2 19,2±0,8 3,56x106 16,0±0,0 15,8±0,2 16,5±0,0 5,52x106 13,3±0,5 15,4±0,7 15,2±1,3 E 90,8 90,4 90,0 E 0,997 0,99 0,997 R2 0,995 0,992 0,992 R 90,2 104,2 91,0
* Đơn vị nồng độ mẫu: bản sao/phản ứng
Kết quả (Bảng 3) cho thấy độ nhạy đạt được của quy trình multiplex real-time PCR phát hiện các gene OXA của A. Baumannii
khoảng 4 bản sao/phản ứng.
Tổng hợp kết quả khảo sát trên mẫu DNA tổng hợp nhân tạo cũng như mẫu DNA bộ gene của một số vi khuẩn A. baumannii cho thấy khoảng động học của phản ứng multiplex
real-time PCR ổn định từ 4x100 – 4x108 bản sao/phản ứng.
Độ ổn định
Quy trình được xác định tính ổn định bằng cách thực hiện lập lại ba lần trên 2 nồng độ mẫu DNA tổng hợp nhân tạo, tại ba thời
điểm khác nhau, cách nhau 1 tuần, có nồng độ 2x101 và 2x108 bản sao/µl.
Bảng 4.Giá trị Ct độ ổn định của phản ứng multiplex real-time PCR
Thời điểm [DNA]* blaOXA-23 blaOXA-51 blaOXA-58 16S rRNA
1 4x108 12,9±0,1 13,0±0,2 13,8±0,1 14,2±0,2 4x101 35,4±0,7 36,1±0,9 35,8±0,3 36,5±0,5 2 4x108 13,1±1,0 13,5±0,6 14,0±0,0 15,4±0,5 4x101 34,7±0,9 34,7±1,5 35,0±1,9 35,4±1,2 3 4x108 14,0±0,8 14,1±0,3 15,6±0,8 15,2±1,2 4x101 34,9±0,2 35,8±0,9 37,0±0,4 34,6±0,1
*Nồng độ mẫu DNA: bản sao/phản ứng
Kết quả (Bảng 4) cho thấy quy trình ổn định qua các lần lập lại tại các thời điểm khác
nhau trên những mẫu DNA tổng hợp nhân tạo có nồng độ cao và nồng độ thấp.
Thử nghiệm quy trình multiplex real-time PCR
Quy trình multiplex real-time PCR được áp dụng thử nghiệm trên 117 mẫu vi khuẩn đã thu thập tại bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Sản phẩm
PCR của một số mẫu DNA có tín hiệu dương tính đối với các gene blaOXA và 16S rRNA được giải trình tự để kiểm chứng.
Bảng 5. Kết quả phát hiện các gene blaOXA và 16S rRNA của A. baumannii và Acinetobacter spp. bằng phương pháp multiplex real-time PCR
Kết quả (Bảng 5) cho thấy trong các mẫu vi khuẩn thu thập được, có 65 (55,6%) chủng được xác định là Acinetobacter spp.
qua sự hiện diện của gene 16S rRNA. Trong các chủng Acinetobacter spp. này, có 46
(70,8%), 39 (60%) và 3 (4,6%) chủng lần lượt mang các gene blaOXA-51, blaOXA-23 và
blaOXA-58. Các chủng mang gene blaOXA-51 được cho là các chủng A. baumannii mà
nghiên cứu đang tìm kiếm. Tất cả cả các chủng
A. baumannii này đều đồng thời mang thêm
gene blaOXA-23 (39/46), không chủng nào mang blaOXA-58 (0/46). Số chủng mang gene blaOXA-58 đều thuộc vào nhóm khơng có
Gen blaOXA-23 blaOXA-51 blaOXA-58 16S rRNA
Kết quả n % n % n % n %
Dương tính 39 60 46 70,8 3 4,6 65 55,6 Âm tính 26 40 19 29,2 62 95,4 52 44,4