Khử trùng mẫu và phân lập vi khuẩn
Có hai mươi sáu mẫu thân và rễ của cây mía (Saccharum officinarum L.)trong giai đoạn vừa trổ cờ được thu thập ở các ruộng mía tại 13 xã thuộc 3 huyện Châu Thành, Trảng Bàng và huyện Tân Biên của tỉnh Tây Ninh.
Mẫu được tiến hành khử trùng qua các giai đoạn như mô tả của Hoang Minh Tam và Cao Ngoc Diep (2014) với sự tăng nồng độ cồn lên 96º cũng như tăng thời gian khử mẫu và xác nhận hiệu quả khử trùng qua kiểm tra nước rửa cuối trên môi trường TYGA (Tryptone Yeast Glucose Agar). Mẫu sau khi
khử trùng bề mặt thành công được tiến hành thu lấy dịch chiết và chủng vào môi trường LGI (Cavalcante và Dưbereiner, 1988) khơng đạm bán đặc. Sau 24 – 48 giờ ủ, sự xuất hiện của màng mỏng (pellicle) cách bề mặt mơi trường 1 – 4 mm chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh. Cấy ria lớp dịch này sang môi trường LGI đặc và tiếp tục cấy chuyển cho đến khi thu được các khuẩn lạc thật sự thuần nhất để lưu trữ, bảo quản như các dòng phân lập (isolates) theo mô tả của Cao Ngọc Điệp (2011).
Xác định đặc tính khuẩn lạc và tế bào
Mơ tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào theo Cao Ngọc Điệp (2011) và Trần Linh Thước và ctv.(2001). Xác định Gram của các dòng thu được bằng phương pháp nhuộm
Gram theo Nguyễn Đức Lượng và ctv. (2003) kết hợp với kiểm tra nhanh bằng phương pháp “KOH String Test” (von Graevenitz và Bucher, 1983).
Khảo nghiệm khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA
Các dòng mọc trên môi trường phân lập là LGI không đạm được cấy chuyển sang mơi trường NBRIP chứa orthophosphate khó tan. Dịng nào phát triển được trên cả hai loại mơi trường này chứng tỏ có khả năng cố định đạm và hòa tan lân. Các dòng này tiếp tục được đánh giá khả năng tổng hợp NH4+ trong môi trường Burk’s (Park và ctv, 2005) không đạm
lỏng, khả năng hịa tan lân khó tan trong mơi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) lỏng, đồng thời xác định khả năng sinh IAA trong môi trường LGI lỏng có bổ sung 100 mg tryptophan/L theo các phương pháp dựa trên phản ứng màu kết hợp đo mật độ quang như mô tả của Hoang Minh Tam và Cao Ngoc Diep (2014).
Định danh dịng có khả năng cố định đạm, hịa tan lân và tổng hợp IAA tốt nhất
Chọn dịng vi khuẩn có đặc tính tốt nhất để định danh bằng giải trình tự một phần gen
16S rRNA (gửi mẫu cho Công ty Nam Khoa, Tp. Hồ Chí Minh).
Phương pháp xử lý số liệu
Dựa vào phương trình được chuẩn và trị số OD đo được để xác định lượng NH4+, P2O5 (tương đương) và IAA có trong mẫu. Tính
tốn và xử lý thống kê bằng Microsoft Excel 2010 và SPSS 16.0.
Sử dụng chương trình blast n của NCBI để so sánh trình tự 16S rDNA đã giải với các trình tự có trong cơ sở dữ liệu của GenBank.
Tìm dịng có chỉ số tương đồng cao, từ đó giả định tên lồi của dịng vi khuẩn đã tuyển chọn.