Xử lý mẫu
Mục tiêu của nghiên cứu là phát triển một phương pháp phân tích nhanh, chi phí thấp và phù hợp để phân tích hàm lượng vết. Một lượng muối 10% (so với khối lượng mẫu) được cho vào trong quá trình xử lý mẫu để làm tăng hiệu quả của quá trình chiết tách aflatoxin M1 từ sữa (A. Biancardi và ctv, 2013; Nicolás Michlig và ctv, 2015; Luca Campone và ctv, 2013). Muối là chất điện ly mạnh nên khi cho vào trong quá trình chiết tách sẽ làm tăng độ mạnh ion giúp chất phân tích di chyển vào pha hữu cơ tốt hơn. Dung mơi dùng để chiết mẫu là ethyl acetate có độ phân cực vừa sẽ hòa tan các chất phân cực vừa nên không cần bước làm sạch bằng SPE để
loại bỏ các hợp chất phân cực mạnh như phương pháp QuEChERS. Hơn nữa, ethyl acetate được xem là rất thân thiện với môi trường, giá thành rẻ hơn so với các loại dung mơi khác.
Thí nghiệm ban đầu được tiến hành theo các tài liệu tham khảo. Tuy nhiên, kết quả không như mong muốn do sữa bị đông tụ. Rất nhiều thí nghiệm sau đó được tiến hành với sự thay đổi tỉ lệ thể tích dung mơi so với thể tích mẫu và kết quả thu được khả quan (xin xem phần đánh giá phương pháp).
Khoảng tuyến tính của đường chuẩn và ảnh hưởng nền mẫu
Hình 2 trình bày đường chuẩn gồm 5 điểm với nồng độ 0,025 μg/L; 0,05 µg/L; 0,5 µg/L; 1 µg/L và 2,0 μg/L trong dung môi và trong nền mẫu.
Hình 2: Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu lên đường chuẩn Hình 2 cho thấy khơng có sự khác biệt đáng
đáng kể giữa 2 đường chuẩn trong nền dung môi và trong nền mẫu. Đường chuẩn tuyến
tính trong khoảng nồng độ khảo sát với hệ số tương quan R2 = 0,999 và 0,998 tương ứng trong nền dung môi và nền mẫu.
Đánh giá phương pháp
Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Bảng 2 trình bày kết quả phân tích lặp lại 7 lần
mẫu trắng (sữa tươi khơng phát hiện AFM1) có thêm chuẩn AFM1 nồng độ 0,025 μg/L. Bảng 2: Độ thu hồi của AFM1 trong sữa thô tại nồng độ 0,025 μg/L
STT Kết quả thu được (μg/L) Độ thu hồi, (%) Độ thu hồi trung bình , (%) RSD (%) S/N Ion định lượng/ion định tính 1 0,02438 97,55 11,2 2,32 2 0,02393 95,74 12,6 2,40 3 0,02195 87,79 10,3 2,37 4 0,02293 91,73 95,04 4,24 10 2,87 5 0,02478 99,12 17,1 2,62 6 0,02456 98,24 14 2,34 7 0,02378 95,11 11,3 2,32 C (µg/L) Peak Area
Từ kết quả tỉ lệ S/N, LOD phương pháp tính được khoảng 0,01 μg/L và LOQ là 0,025 μg/L. Mức LOD đã đáp ứng được yêu cầu của FAO về đánh giá phương pháp dựa vào MRL (LOD = 1/5 MRL, MRL ở đây là 0,05 μg/L – theo tiêu chuẩn châu Âu, vậy LOD = 0,01 μg/L là phù hợp).
Độ chính xác
Độ chính xác được xác định bằng cách phân tích lặp lại 7 lần mẫu trắng thêm chuẩn ở 3
mức nồng độ là 0,05 ng/ml, 0,5 μg/L và 5 μg/L. Độ lặp lại tốt ở cả 3 nồng độ (% RSD 6,08; 5,78; 4,60 lần lượt ở nồng độ là 0,05 ppb, 0,5 ppb và 5 ppb). Độ thu hồi thu được cũng rất cao (từ 82% - 96%) đáp ứng được qui định của Châu Âu. Ở nồng độ càng lớn thì sự sai lệch giữa lần lặp lại ít hơn thơng qua %RSD càng thấp khi nồng độ càng lớn.
Phân tích một số mẫu thực
Hình 4 trình bày sắc ký đồ AFM1 trong chuẩn và mẫu sữa dương tính AFM1.
Hình 4a: Sắc ký đồ LC-MS/MS của AFM1 mẫu dương tính
Hình 4b. Sắc ký đồ LC-MS/MS của AFM1 trong chuẩn Kết quả phân tích 20 mẫu sữa thơ ở Củ chi được trình bày trong bảng 3.
Xã STT Hàm lượng (μg/L)
1 KPH
2 KPH
3 KPH
4 < LOQ
Tân Thạnh Đông 5 < LOQ
6 KPH 7 < LOQ 8 < LOQ 9 KPH 10 < LOQ 1 < LOQ 2 < LOQ Tân Thạnh Tây 3 0,044 4 < LOQ 5 < LOQ 1 < LOQ 2 0,034 Trung An 3 0,064 4 < LOQ 5 < LOQ
Kết quả có 15% mẫu có phát hiện AFM1 (3/20 mẫu) với nồng độ từ 0,034 μg/L – 0,064 μg/L. Khơng có mẫu nào vượt q giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn Việt Nam (MRL = 0,5 μg/L) và chỉ có 1 mẫu vượt quá giới hạn cho phép
theo tiêu chuẩn Châu Âu (MRL = 0,05 μg/L). Kết quả phân tích bước đầu cho thấy AFM1 có hiện diện trong sữa thơ tại Củ Chi với nồng độ thấp (vẫn còn nằm trong giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn Việt nam).
KẾT LUẬN
Đề tài nghiên cứu phân tích aflatoxin M1 trong sữa thơ bằng LC-MS/MS kết hợp với kỹ thuật chiết lỏng lỏng bằng dung môi thân thiện với
môi trường là ethyl acetate (8 mL) và có thêm một lượng 10% muối để hỗ trợ quá trình chiết. Phương pháp xử lý mẫu đơn giản, nhanh
chóng và hiệu quả trong việc phân tích AFM1 trong sữa thô ở hàm lượng vết. Phương pháp đã được đánh giá với LOD = 0,01 μg/L, LOQ = 0,025 μg/L, độ thu hồi trung bình là 88% và % RSD trong các nồng độ khảo sát đều nhỏ hơn 7.
Phương pháp nghiên cứu đã được ứng dụng trong phân tích 20 mẫu sữa bị thơ lấy tại 20 hộ gia đình khác nhau tại Củ chi trong mùa
khô khoảng từ tháng 12/2015 đến 02/2016. Kết quả phân tích 3/20 mẫu phát hiện AFM1 với nồng độ dưới giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn Việt nam. Aflatoxin trong thức ăn chăn ni có thể thay đổi rất nhiều vào sự thay đổi thời tiết, nhất là khí hậu nóng ẩm vào mùa mưa. Nghiên cứu tiếp theo sẽ tiến hành phân tích hàm lượng AFM1 trong sữa thô vào mùa mưa.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Biancardi.A ,Piro.R, Dall’asta.C & Galaverna.G (2013) A simple and reliable liquid chromatographytandem mass spectrometry method for the determination of aflatoxin M1 in milk, Food Additives & Contaminants: Part A,30:2, 381-388.
2. Bakirci, I. (2001). A study on the occurrence of aflatoxin M1 in milk and milk products produced in Van province of Turkey. Food Control, 12-47.
3. Chen WL, Hsu TF, Chen CY (2011) J AOAC Int 94(3):872–877
4. Galvano F, Galofaro V and Galvano G, 1996. Occurrence and stability of aflatoxin M1 in milk and milk products: a worldwide review. Journal of Food Protection 1996; 59: 1079-1090.
5. Gong YY, Hounsa A, Egal S, Turner PC and Sutcliffe AE, 2004. Postweaning exposure to aflatoxin results to impaired child growth: a longitudinal study In Bennin, West Africa. Academic journal article from Environmental Health Perspectives, Vol. 112, No. 13.
6. Hamid Mohammadi, 2011. A Review of Aflatoxin M1, Milk, and Milk Products.
Aflatoxins - Biochemistry and Molecular Biology. ISBN 978-953-307-395-8.
7. Hao Wang, Xiang-Juan Zhou*, Yan-Qin Liu, Hong-Mei Yang, and Qi-Lei Guo(
2011).Simultaneous Determination of Chloramphenicol and Aflatoxin M1Residues in Milk by Triple Quadrupole Liquid Chromatography−Tandem Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem., 2011, 59 (8), pp 3532–3538.
8. Iha. M. H, Barbosa. C.B ,Fávaro. R. M. D, Trucksess. M. W, 2011. Chromatographic method for aflatoxin M1 in cheese, yoghurt and dairy drinks. Journal of AOAC International, 94 (5) (2011).
9. Whitlow. L. W and Hagler.W .M , Jr, 2010. Mycotixin Effects in Dairy Cattle. 2010 Penn State Dairy Cattle Nutrition Workshop
10. Luca Campone & Anna Lisa Piccinelli & Rita Celano & Mariateresa Russo & Luca Rastrelli. 2013. Rapid analysis of aflatoxin M1 in milk using dispersive liquid–liquid microextraction coupled with ultrahigh pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry. Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013.
11. Manetta, A. C., Giuseppe, L. D., Giammarco, M., Fusaro, I., Simonella, A., Gramenzi, A., & Formigoni, A. (2005). High-performance liquid chromatography with post- column derivatisation and fluorescence detection for sensitive determination of aflatoxin M1 in milk and cheese. Journal of Chromatography A, Vol.1083, No.1, pp. 219-222.
12. Nicolás Michlig, María Rosa Repetti, Carolina Chiericatti, Silvia R. García, Mónica Gaggiotti, Juan C. Basílico, Horacio R. Beldoménico (2015). Multiclass Compatible Sample Preparation for UHPLC–MS/MS Determination of Aflatoxin M1 in Raw Milk.
Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2015.
13. Stubblefield, R. D. (1979) The rapid determination of aflatoxin M1 in dairy products.