Phân lập vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh có trong dịch chiết các mẫu mơ cây mía đã khử trùng bề mặt phát triển trong cột môi trường LGI bán đặc tạo thành màng mỏng như mô tả của Perin và ctv. (2006), Nguyễn Thị Thu Hà và ctv. (2009) (Hình 1). Sau khi được cấy chuyển sang mơi trường LGI khơng đạm đặc và làm thuần, các dịng vi khuẩn được tiếp tục cấy chéo sang môi trường NBRIP đặc chứa orthophosphate. Kết quả thu được là 75 dòng vi khuẩn có cùng lúc hai khả năng cố định đạm và hịa tan lân.
Trong đó, có 46 dịng có nguồn gốc từ rễ mía (61,33%) và 29dịng có nguồn gốc từ (38,67%). Nhiều tác giả khác khi nghiên cứu vi khuẩn nội sinh cũng nhận thấy số dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ rễ thường nhiều hơn so với phân lập từ thân cây, điều này ủng hộ một trong những giả thuyết về nguồn gốc vùng rễ (rhizophere) của vi khuẩn nội sinh (Rosenblueth và Martínez-Romero, 2006).
Hình 1. Vi khuẩn nội sinh phát triển trên môi trường LGI bán đặc (B)
và đối chứng âm gồm dịch chiết từ mẫu mơ mía đã hấp tiệt trùng (A)
Đặc tính khuẩn lạc và tế bào
Về hình thái khuẩn lạc, đa số các dịng vi khuẩn phân lập được có dạng trịn (90,67%), số cịn lại có dạng khơng đều (9,33%). Khuẩn lạc có màu trắng đục chiếm 38,67%, màu trắng trong chiếm 25,33%, màu trắng ngà chiếm 28% và màu là vàng nhạt
chiếm 8%. Đa số các dòng thu được tạo khuẩn lạc có dạng bìa ngun (92%) và độ nổi mơ (96%), cịn lại là dạng bìa răng cưa (8%) và độ nổi lài (4%). Đường kính khuẩn lạc của các dòng thu được nằm trong khoảng từ 0,5 đến 5mm (Hình 2).
Hình 2. Hình thái khuẩn lạc của một số dịng vi khuẩn nội sinh
Qua quan sát được dưới kính hiển vi quang học, nhận thấy chủ yếu các dịng có tế bào hình que ngắn, nhỏ và tất cả đều có khả năng chuyển động. Qua kết quả kiển tra Gram cho thấy các dòng Gram (-) chiếm 56% và Gram (+) chiếm 44% (Hình 3). Kết quả này tương tự như các kết quả nghiên cứu vi khuẩn
nội sinh trong một số cây một lá mầm khác như khóm (Nguyễn Thị Thu Hà và ctv., 2009), các loại cỏ chăn nuôi (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi, 2009), ngô (Dang Thi Ngoc Thanh và Cao Ngoc Diep, 2014) và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Đồng Nai (Hoang Minh Tam và Cao Ngoc Diep, 2014).
Hình 3.Kết quả nhuộm Gram của một số dòng vi khuẩn nội sinh Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA
Bảng 1 sau đây trình bày nguồn gốc và khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của 10 dòng tốt nhất trong số 75
dòng vi khuẩn nội sinh cây mía đã phân lập được.
Bảng 1.Kết quả định lượng sự cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA của 10 dòng vi
khuẩn nổi trội
STT Dòng Dòng vi khuẩn Nguồn gốc NH4+ (mg/L)* P2O5 (mg/L)* IAA (mg/L)*
1 CT4 Thân, An Cơ - Châu Thành 1,507 e 57,892 a 18,212 b 2 DR2 Rễ, Hảo Đức - Châu Thành 1,248 f 40,687 c 9,019 f
3 KT1
Thân, Đồng Khởi - Châu
Thành 1,625
d 42,458 c 5,562 gh
4 KT2
Thân, Đồng Khởi - Châu
Thành 1,059
g 30,170 d 17,450 c
5 LT2
Thân, Thành Long - Châu
Thành 1,465
c 22,887 e 10,307 d 6 TVT1 Thân, Trà Vong - Tân Biên 2,079 b 46,639 b 6,304 g 7 TVT4 Thân, Trà Vong - Tân Biên 1,197 fg 41,625 c 5,296 h 8 TDT8 Thân, Thạnh Đông - Tân Biên 1,207 fg 26,870 d 5,929 gh 9 GBR5 Rễ, Gia Bình - Trảng Bàng 0,254 h 61,315 a 10,413 e 10 HTR8 Rễ, Hưng Thuận - Trảng Bàng 2,654 a 58,417 a 18,836 a 11 Đối chứng 0,000 i 0,000 f 0,000 i CV (%) 6,391 5,911 5,050
*Số liệu trình bày trong bảng là bình quân của 4 đợt đo mẫu với 3 lần lặp: 2, 4, 6, 8 ngày sau khi cấy đối với NH4+ và IAA; 5, 10, 15, 20 ngày sau khi chủng đối với P2O5.
Những số (trong cùng một cột) được theo sau bởi cùng chữ cái khơng có sự khác biệt ý nghĩa ở mức 5%.
Qua đó, nhận thấy lượng đạm cố định của 10 dòng tốt nhất dao động từ 0,254 – 2,654 mg/L NH4+, lượng lân hòa tan trong khoảng 22,87 – 61,315 mg/ L P2O5 và lượng IAA đạt từ 5,296 – 18,836 mg/L. Kết quả định lượng này tương tự như nghiên cứu của một số tác giả tiến hành trên đối tượng vi khuẩn nội sinh cây mía (Ngơ Hồng Thanh và ctv., 2014; Hoàng Minh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2014; Hoang Minh Tam
và Cao Ngoc Diep, 2014) và một số cây trồng khác (Mikanová và ctv., 1997; Cassán và ctv., 2009; Szilagyi-Zecchin và ctv., 2014). Vi khuẩn nội sinh có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua các cơ chế cố định đạm, hòa tan phosphate và tổng hợp IAA đã được thông báo (Ryan và ctv., 2008; Puente và ctv., 2009; de-Bashan và ctv., 2008).
Hình 4.Phản ứng màu với thuốc thử của một số dòng vi khuẩn nổi trộikhi đo lượng lân hòa
tan vào 5 ngày sau khi chủng
Kết quả giải trình tự một phần đoạn gen 16S rRNA của dịng vi khuẩn nổi trội và dị tìm dịng tương đồng
Dịng HTR8 có nguồn gốc từ rễ cây mía trồng tại xã Hưng Thuận, huyện Trảng Bàng thể hiện tốt cả 3 đặc tính nêu trên đã được tuyển chọn để tiếp tục nhận diện bằng phương pháp sinh học phân tử. Kết quả giải trình tự một phần đoạn gen 16S rRNA và dị tìm dịng tương đồng có trong cơ sở dữ liệu của
NCBIcho thấy dịng HTR8 có sự tương đồng 96% với vi khuẩn Labrys portucalensis strain F11(NR_042863.1) (Hình 5). Labrys portucalensis là một Proteobacteriacó hình
que và thuộc nhóm Gram âm phù hợp với kết quả khảo sát hình thái và nhuộm Gram của dịng HTR8.
Hình 5.Kết quả dị tìm dịng tương đồng trình tự một phần gen 16S rRNA của dịng HTR8
Nhiều loài mới trong chi Labrysđã được phân lập từ rễ cây trồng ở nhiều nước (Islam và ctv., 2007; Nguyen và ctv., 2015). Tuy vậy,
Labrys portucalensis sp. nov. là một lồi có
khả năng phân hủy fluorobenzene được phân lập lần đầu từ trầm tích bị ơ nhiễm do công nghiệp ở Bồ Đào Nha (Carvalho và ctv.,
2008). Mới đây, Inui-Kishi và cộng sự (2012) đã thơng báo về khả năng hịa tan phosphate và tổng hợp IAA khá tốt của một dòng tương đồng với Labrys portucalensistrong tổng số
60 dòng vi khuẩn được phân lập từ vùng rễ cây mía trồng tại Brazil.
KẾT LUẬN
Có 75 dịng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ rễ và thân cây mía trồng tại tỉnh Tây Ninh. Trong đó, dịng vi khuẩn HTR8 có lượng đạm cố định, lượng lân hòa tan và lượng IAA sinh ra cao nhất. Căn cứ vào các kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA và dị tìm
dịng tương đồng, có thể xem HTR8 như vi khuẩn Labrys portucalensis (giả định). Dịng vi khuẩn này có tiềm năng ứng dụng như một vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật cho cây mía.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Ái Chi và Cao Ngọc Điệp, 2009. Phân lập và đặc tính vi khuẩn nội sinh cây khóm (Ananas comosus L.) trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An. Tuyển
tập hội nghị Cơng nghệ sinh học phía Namnăm 2009, tại thành phố Hồ Chí Minh từ
ngày 23-24 tháng 10, năm 2009.
2. Cao Ngọc Điệp, 2011. Sách chuyên khảo Vi khuẩn nội sinh thực vật. Nhà xuất bản Đại Học Cần Thơ, Cần Thơ.
3. Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp, 2009. Phân lập và đặc tính của vi khuẩn nội sinh ở một số loại cỏ chăn ni. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2): 241- 250.
4. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm cơng nghệ
sinh học (tập 2): Thí nghiệm vi sinh vật học. Nxb. Đại học Quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh.
5. Hồng Minh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2014. Xác định đặc tính và nhận diện vi khuẩn nội sinh Gluconacetobacter diazotrophicus trong cây mía ở hai tỉnh Bến Tre và Long An.
Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn 24: 68-74.
6. Ngơ Hồng Thanh, Hồng Minh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2014. Xác định tính vi khuẩn nội sinh trong cây mía trồng ở tỉnh Bến Tre và Long An. Tạp chí Nơng nghiệp và Phát
triển Nơng thơn 2: 41-48.
7. Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phương Trang và Phạm Thị Hồng Tươi, 2001. Thực tập vi sinh vật học. Nxb. Ðại học Quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh.
8. Phạm Văn Toản và Trương Hợp Tác, 2004. Phân bón vi sinh trong nơng nghiệp. Nhà xuất
bản Nông nghiệp, Hà Nội.
9. Tổng cục thống kê Việt Nam, 2015. (https://www.gso.gov.vn/Default.aspx?tabid=217) 10. Cassán F., Perrig D., Sgroy V., Masciarelli O., Penna C., and Luna V., 2009.
Azospirillumbrasilense Az39 and Bradyrhizobium japonicum E109, inoculated singly or in combination, promote seed germination and early seedling growth in corn (Zea
mays L.) and soybean (Glycine max L.). Eur. J. Soil Biol. 45:28-35.
11. Dang Thi Ngoc Thanh and Cao Ngoc Diep, 2014. Isolation, characterization and identification of endophytic bacteria in maize (Zea mays L.) cultivated on acrisols of the Southeast of Vietnam. American Journal of Life Sciences2(4): 224-233. (Published online: Aug. 30, 2014. DOI: 0.11648/j.ajls.20140204.16)
12. [de-Bashan L.E., Antoun H., and Bashan Y., 2008. Involvement of indole-3-acetic acid produced by the growth-promoting bacterium azospirillum spp. in promoting growth of