II. VẬT LIỆUVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆUVÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu
Vật liệu
Các mẫu động vật, thực vật và một số mẫu thực phẩm chay được thu thập ngẫu nhiên từ các công ty sản xuất thực phẩm chay
như công ty thực phẩm chay Âu Lạc, từ chợ Thủ Dầu Một và siêu thị.
Thiết kế mồi
Trình tự mồi TP1-TP2 được thiết kế bắt cặp đặc hiệu trên trình tự gen 16S rDNA ty thể của các loài động vật thu thập từ ngân
hàng Genbank (NCBI:
http://ncbi.nlm.nih.gov) bằng các phần mềm trực tuyến như Primer3 (v.0.4.0) (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0), Annhyb. Mồi CLO1 và CLO2 sử dụng làm chứng nội, được thu thập từ nghiên cứu của Taberlet P. và cs (1991), cặp mồi này bắt cặp đặc hiệu
với trình tự gen khơng mã hóa của lục lạp. Mồi sau khi thu thập và thiết kế được đánh giá các thông số vật lý như độ dài, nhiệt độ nóng chảy, %GC, năng lượng hình thành các cấu trúc bậc hai…bằng phần mềm trực tuyến IDT
(http://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/ OligoAnalyzer). Đồng thời tính đặc hiệu của cặp mồi được kiểm tra bằng chương trình BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
Tách chiết DNA
DNA được tách chiết theo phương pháp Phenol-Chloroform có sự biến đổi pH = 4 thành pH = 8. Các mẫu trước khi được tiến hành tách chiết DNA, các mẫuđược rửa sạch cắt và giã nhuyễn thành một mẫu đồng nhất. Lấy 2,0 g mẫu dịch này huyền phù với 4 mL dung dịch đồng nhất mẫu (NaCl 5M, Tris-
HCl 1M, EDTA 0.5M, ddH2O). Sau khi đồng nhất, hút 750 µL dịch chuyển vào ống eppendorf mới, bổ sung 20 µL SDS 10% và 20 µL proteinase K (1 mg/mL), ủ qua đêm ở nhiệt độ 65°C. Sau đó, 250 µL NaCl bão hịa được bổ sung, và ủ mẫu ở 4°C trong 30 phút, đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút.
Chuyển 500 µL dịch vào ống eppendorf mới và bổ sung 500 µL hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalkohol (25:41:1) đảo nhẹ ống, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút (lặp lại 2-3 lần), thêm 500 µL Chloroform, đảo nhẹống và ly tâm 13.000 vịng/phút trong 10 phút. Q trình tủa được
thực hiện với NH4OAc và Isopropanol ở nhiệt độ -20°C trong vòng 2 giờ. Sau đó, tiến hành ly tâm thu tủa và lưu giữ DNA trong dung dịch TE cho những thí nghiệm sau này. Nồng độ DNA được xác định thông qua phương pháp đo OD và kiểm tra độ tinh sạch của mẫu thông qua trị sốA260/A280.
Phản ứng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: 1 chu kỳ với nhiệt độ 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳvới nhiệt độ95°C trong 30 giây, 67°C trong 1 phút, 72°C trong 1 phút; 1 chu kỳ 72°C trong 5
phút, 4°C tới ∞. Thành phần phản ứng PCR được thể hiện ở Bảng 1. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% và giải trình tự tại cơng ty Nam Khoa.
Bảng 1. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Thành phần Lượng (µL) Phản ứng PCR Multiplex PCR Master mix (2X) 7.5 7.5 Mồi TP1(10 µM) 0.5 0.5 MồiTP2 (10 µM) 0.5 0.5 Mồi CLO1 0.5 Mồi CLO2 0.5 DNA khuôn 1.0 1.0 ddH2O 5.5 4.5 Tổng thể tích 15.0 15.0 Chu trình nhiệt
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Khảo sát đặc tính mồi sử dụng trong nghiên cứu
Các đặc tính vật lý của mồi được đánh giá bằng phần mềm IDT thể hiện ở Bảng 2.
Bảng 2. Các đặc tính vật lý của mồi TP1-TP2 và CLO1-CLO2
Mồi Trình tự (5’ - 3’) Chiều dài %GC Tm(°C) (1) (2) (3) TP1 CCYAGGGATAACAGC GCAATC 21 54,7 55,5 0,81 - 1,47 - 1,5 7 TP2 TCCGGTCTGAACTCAG ATCAC 21 52,4 56.2 - 2,00 - 1,34 CLO1 GGTTCAAGTCCCTCTA TCCC 20 54,4 55 0,36 - 3,07 - 8,7 6 CLO2 ATTTGAACTGGTGACA CGAG 20 52,8 45 - 0,32 - 3,61 Ghi chú:
(1): là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hairpin loop (kcal/mole) (2): là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc selfdimer (kcal/mole) (3): là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc heterodimer (kcal/mole)
Dựa trên kết quả Bảng 2, các giá trị vật lý về chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm) và sự chênh lêch nhiệt độ nóng chảy (∆Tm) đều thỏa mãn các yêu cầu trong thiết kế mồi. Về giá trị ΔG phần lớn đều thỏa mãn lớn hơn -9 Kcal/mol, ngoại trừ năng lượng hình thành cấu trúc tự bắt cặp của mồi TP1-TP2. Tuy nhiên, khi tiến hành kiểm tra bằng phần mềm trực tuyến IDT, cấu trúc tự bắt cặp xảy ra ở đầu 5’ và giá trị này không chênh lệch quá nhiều so với yêu cầu. Do đó, cặp mồi này vẫn được sử dụng và kiểm tra tính đặc hiệu.
Tính đặc hiệucủa cặp mồi được kiểm tra bằng chương trình BLAST, kết quả cho thấy cả hai cặp mồi đều bắt cặp đặc hiệu với trình
tự gen đích, độ bao phủ đạt 100%, các giá trị E-value, Max Score, Total Score, Ident đều đạt độ in cậy rất cao. Đồng thời, khả năng bắt cặp của mồi được xác định bằng chương trình Annhyb và ClustalX, kết quả cho thấy cặp mồi TP1-TP2 bắt cặp đặc hiệu với gen 16S rDNA ty thể động vật, kích thước sản phẩm khuếch đại là 154 bp, cặp mồi CLO1-CLO2 bắt cặp đặc hiệu với trình tự gen khơng mã hóa ở lục lạp, kích thước sản phẩm khuếch đại là 426 bp. Dựa trên những kết quả thu nhận được, cặp mồi TP1-TP2 và CLO1-CLO2 được chọn để sử dụng cho cácnghiên cứu thực nghiệm sau này.
(A)
(B)
(C)
Hình 1. (A) Sự bắt cặp của TP1 và TP2 lên trình tự 16S rDNA của Sus scrofa (Mã số truy cập
trên Genbank: KC208030). Vị trí Y trong cặp mồi TP1 tương thích với nucleotide C trong trình tự bắt cặp; Kết quả BLAST (B) cặp mồi TP1 và (C) TP2 thể hiện tính đặc hiệu của mồi
(A)
(B)
(C)
Hình 2. (A) Sự bắt cặp của CLO1 và CLO2 lên trình tự DNA khơng mã hóa của Lactuca
sativa(Mã số truy cập trên Genbank: AP007232); Kết quả BLAST (B) cặp mồi CLO1 và (C)
CLO2 thể hiện tính đặc hiệu của cặp mồi
Kết quả kiểm tra 23 mẫu thực phẩm chay trên thị trường
Khảo sát 23 mẫu thực phẩm chay trên thị trường (12 mẫu thực phẩm chay từ siêu thị, 3 mẫu thu thập từ chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương, 5 mẫu của cơng ty thực phẩm chay Âu Lạc, 3 mẫu thực phẩm chay từ quán cơm chay
tại Thủ Dầu Một) và 2 mẫu động vật (heo, gà) làm đối chứng dương, 1 mẫu thực vật (cải bắp) làm đối chứng âm. Kết quả điện di được thể hiện ở hình 3.
(A)
Chú thích: 1, 2, 3, 4, 5: mẫu thực phẩm chay từ công ty Âu Lạc (thứ tự:đùi gà xả chay, thịt nạc kho chay, sườn ram chay, bò kho chay, pate gan ngỗng chay). 6, 7, 8: mẫu thực phẩm chay từ quán cơm chay tại Thủ Dầu Một(thứ tự mẫu: heo chiên chay, chả trứng vịt chay, chả cá chay). 12, 13, 14: mẫu thực phẩm chay từ chợ Thủ Dầu Một (thứ tự: gà cục chay, bột xù, thịt gà xé chay). 9: Mẫu động vật (thịt heo). 10: mẫu thực vật (cải bắp) Mẫu động
vật (thịt heo). 11: Mẫu động vật (thịt gà). 15: mẫu hỗn hợp (tỉ lệ heo:gà:thực vật: 1:1:1). 16, 17, 18, 19, 20:mẫu hỗn hợp (thực phẩm chay Âu Lạc:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1). 21, 22, 23: Mẫu hỗn hợp (thực phẩm chay từ chợ Thủ Dầu Một:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1). 24, 25, 26: Mẫu hỗn hợp (nguồn cung cấp ngoài:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1). M: Thang chuẩn 100 bp.
(B) (C)
Chú thích:1, 2, 3, 4, 5, 6: Lúa mạch nâu hạt, lúa mạch vàng khúc, Amila vàng lát nhỏ, Amila bạch kê cục, bột nêm bào ngư, bột nêm gà thuần chay.7: Động vật (heo). 8: Mẫu trộn heo: cải (tỉ lệ 1:1).TV: thực vật (cải).Chứng (- ): khơng DNA.
Chú thích:1, 2, 3, 4, 5, 6: Bột nêm gà chay 1, bột nêm gà chay 2, bạch kim kê, burger tiêu đen, dăm bông chay, chả lụa Vegan. ĐV: Động vật (heo). 7: Mẫu trộn heo: cải (tỉ lệ 1:1).TV: thực vật (cải).Chứng (-): khơng DNA.
Hình 3. Kết quả kiểm tra sự tạp nhiễm thành phần động vật trên các mẫu thực nghiệm
Tổng số mẫu phát hiện chứa DNA động vật là 9/23 mẫu (39,13%) trong đó có 5 mẫu từ siêu thị, 3 mẫu từ quán cơm chay và 1 mẫu từ thị trường chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương.Các giếng có xuất hiện vạch sản phẩm 154 bp chính là DNA động vật. Độ sáng không đồng đều của các vạch ở các mẫu bị nhiễm được giải thích là do hàm lượng DNA
động vật nhiễm trong các mẫu khác nhau, nồng độ DNA tách được không giống nhau, dẫn đến sự khuếch đại các vạch có độ sáng khác nhau. Đối với các mẫu chứng dương hồn tồn xuất hiện vạch với kích thước 154 bp sáng, mẫu chứng âm khơng xuất hiệnvạch sản phẩm 154 bp.Để xác định mẫu đã nhiễm DNA loài nào, sản phẩm PCR của một mẫu
được chọn đại diện để giải trình tự tại cơng ty Nam Khoa (mẫu 8-Hình 3A).
Hình 4. Kết quả giải trình tự mạch xuôi (mồi TP1) của sản phẩm PCR mẫu 8
Dựa vào kết quả giải trình tự (hình 4), chúng tơi đã xác định lồi đã nhiễm của mẫu 8 nghi ngờ chứa DNA động vật tương đồng với trình tự gen ty thể của lồi gà Gallus gallus với mã số truy cập là KF981434 cho thấy mẫu bị nhiễm gà trong quá trình chế biến (Dữ liệu khơng trình bày).
Kết quả kiểm tramột số mẫu thực phẩm chay với phương pháp Multi-PCR (kết hợp
cặp mồi chứng nội). Áp dụng quy trình multi- PCR với cặp mồi TP1-TP2 đặc hiệu cho vùng gen 16S rDNA của động vật và cặp mồi CLO1-CLO2 khuếch đại đặc hiệu cho vùng gen không mã hóa ở lục lạp được sử dụng làm chứng nội.
Khảo sát được thực hiện trên 1 mẫu thực vật, 1 mẫu động vật và 4 mẫu thực phẩm chay trên thị trường
.
Hình 5. Kết quả kiểm tra một số mẫu trên trị trường bằng Multi-PCR
Chú thích: 1: Lúa mạch nâu hạt, 2: Bột gà nêm thuần chay, 3: Amila vàng lá nhỏ,4: Amila bạch kê cục,5: Bột nêm bào ngư,ĐV: Động vật (heo),TV: Thực vật (cải bắp),(-): Chứng âm,L: Thang chuẩn 100 bp
Giếng TV xuất hiện 1 vạch sản phẩm chứng nội ở vị trí 426 bp, phù hợp với kết quả khảo sát in silico của cặp mồi CLO1-CLO2. Giếng ĐV xuất hiện 1 vạchkích thước 154 bp đúng với sản phẩm khuếch đại trình tự 16S rDNA của cặp mồi TP1-TP2. Giếng 1, 3, 4 xuất hiện 1 vạch sản phẩm chứng nội ở vị trí
426 bp, không xuất hiện vạch ở vị trí 154 bpchứng tỏ 3 mẫu này âm tính (khơng nhiễm DNA động vật). Giếng 2 không xuất hiện vạch sản phẩm 154 bp, tuy nhiên khơng thể kết luận được mẫu âm tính thực sự vì khơng xuất hiện vạch sản phẩm chứng nội 426 bp, chứng tỏ trong mẫu kiểm tra có thành phần phụ gia ức chế phản ứng PCR, do đó mẫu này cần phải có những phân tích sau này, đặc biệt là phải tìm hiểu thành phần phụ gia trong quá trình chế biến có ảnh hưởng đến q trình khuếch đại hay không? Giếng 5 xuất hiện 2 vạch mờ, 1
vạch ở vị trí 154 bp và 1 vạch ở vị trí 426 bp chứng tỏ mẫu này dương tính (bị nhiễm DNA động vật).
KẾT LUẬN
Chúng tôi bước đầu thành công xây dựng cơ sở khoa học để phát hiện thành phần tạp nhiễm động vật trong thực phẩm chay dựa trên việc khuếch đại gen 16S rDNA ty thể động vật kết hợp với khuếch đại gen lục lạp sử dụng làm chứng nội cho phản ứng. Đồng thời, chúng tôi tiến hành thử nghiệm thành công việc kiểm tra 23 mẫu thực phẩm chay trên thị
trường, kết quả phát hiện 9/23 (39,13%) mẫu nhiễm DNA động vật. Từ kết quả khảo sát in silico đến in vitro đã cho thấy kit PCR của chúng tơi hồn toàn đủ cơ sở khoa học để kết luận bước đầu thành công xây dựng bộ kit phát hiện thành phần động vật trong thực phẩm chay, đồng thời có thể tiến hành thử nghiệm trên một lượng lớn mẫu thực phẩm chay
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Anderson, J., Prior, S. 2012.Vegetarian diets. Food science and human nutrition, the Colorado State University.
2. Booton, G.C., Carmichael, J.R., Visvesvara, G.S., Byers, T.J., Fuerst, P.A.2003. ‘Identification of Balamuthia mandrillaris by PCR Assay Using the Mitochondrial 16S rRNA Gene as a Target’Journal of Clinical Microbiology41(1): pp.453-455.
3. Chomczynski, P., Sacchi, N. 2006. ‘The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on’Nature Protocols1(2): pp.581-585.
4. Chomczynski, P., Sacchi, N. 1987. ‘Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction’ Analytical Biochemistry 162: pp.156-159.
5. Claude, C., Hermann, S., Eilber, U., Steindorf, K. 2005. ‘Lifestyle determinants and mortality in German vegetarians and health-conscious persons: Results of a 21-year follow-up’Cancer Epideminol Biomarkers Prev14: pp. 963-968.
6. Girish, P.S., Anjaneyulu, A.S.R., Viswas, K.N., Anand, M., Rajkumar, N., Shivakumar, B.M., Bhaskar, S. 2004. ‘Sequence analysis of mitochondrial 12S rRNA gene can identify meat species’Meat Science66: pp.551-556
7. Heulin, Surget-Groba, Y., Guiller, A., Guillaume, C.P., Deunff, J. 1999. ‘Comparisons of mitochondrial DNA (mtDNA) sequences (16S rRNA gene) between oviparous and viviparous strains of Lacerta vivipara: a preliminary study’ Molecular Ecology8: pp.1627-1631.
8. Hsieh, H.M., Tsai, C.C., Tsai, L.C., Chiang, H.L. 2005. ‘Species identification of meat products using the cytochrome b gene’Forensic Science Journal4: pp.29-36.
9. Ishizaki, S., Sakai, Y., Yano, T., Nakano, S., Yamada, T., Nagashima, Y., Shiomi, K., Nakao, Y., Akiyama, H. 2012. ‘Specific detection by the polymerase chain reaction of potentially allergenic salmonid fish residues in processed foods’Biosci Biotechnol Biochem 76(5): pp.980-985.
10. Karabudak, E., Kiziltan, G., Cigerim, N. 2008. ‘A comparison of some of the cardiovascular risk factors in vegetarian and omnivorous Turkish females’J Hum Nutr Diet21: pp.13-22.
11. Key, T.J., Appleby, P.N., Rosell, M.S. 2006. ‘Health effects of vegetarian and vegan diets’Proc Nutr Soc65: pp.35-41.
12. Melton, T., Holland, C. 2007. ‘Routine Forensic Use of the Mitochondrial 12S Ribosomal RNA Gene for Species Identification’J Forensic Sci62: pp.250-257.
13. Michael, T.C., Brandon, S.G., Gerald, H.L., Jr, and Brian, R.M. 1994. ‘Rates and patterns of chloroplast DNA evolution’Proceedings of the National Academy of Sciences USA 91: pp.6795-6801.
14. Misener, S., Krawetz, S.A. 1999. ‘Methods in Molecular Biology’, © Humana Press132: pp. 365-386.
15. Mitanin, T., Akane, A. 2009. ‘Identification of animal species using the partial sequences in the mitochondrial 16S rRNA gene’Internationl Symposium Advances in legal Medicine11(1): pp.449-450.