Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm

Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm

lOMoARcPSD|12201492 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC TIỂU LUẬN MƠN: HĨA SINH THỰC PHẨM Đề tài: CÁC KỸ THUẬT HÓA SINH HỌC VIÊN: Cao Hồ Kim Ngân Mã học viên: 2070083 GVHD: TS Võ Đình Lệ Tâm Tháng 12 /2020 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH i CHƯƠNG I: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY – HPLC) 1.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng .1 1.2 Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.1 Pha động sắc ký lỏng 1.2.2 Bộ phận khử khí (degasser) 1.2.3 Bơm (pump) 1.2.4 Injector, Autosampler 1.2.5 Cột sắc ký .2 1.2.6 Đầu dò (detector) 1.2.7 Bộ xử lý liệu 1.2.8 Dung môi thải .4 1.2.9 Dây nối 1.2.10 Thiết kế gradients .4 1.3 Phân tích HPLC 1.3.1 Phân tích định tính .6 1.3.2 Phân tích định lượng 1.3.3 Phương pháp nội chuẩn 1.4 Chuẩn bị mẫu .7 1.4.1 Chiết lỏng - lỏng 1.4.2 Chiết pha rắn 1.5 Ưu nhược điểm phương pháp 1.5.1 Ưu điểm .9 1.5.2 Nhược điểm 1.6 Sự cố xử lý .9 1.6.1 Đường bị nhiễu 1.6.2 Trôi đường sở 10 1.6.3 Hình dạng đỉnh 10 CHƯƠNG 2: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 11 2.1 Nguyên tắc phương pháp PCR 11 2.1.1 Giai đoạn biến tính .11 2.1.2 Giai đoạn lai ghép 12 2.1.3 Giai đoạn kéo dài .12 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 2.2 Thành phần chủ yếu phương pháp PCR .14 2.2.1 Đoạn mồi (primers) 14 2.2.2 DNA polymerase (Taq polymerase) 14 2.2.3 Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) 14 2.2.4 DNA đích từ mẫu .15 2.2.5 Dung dịch đệm 15 2.2.6 Magie clorua (MgCl2) 15 2.3 Phát phân tích sản phẩm PCR 15 2.4 Ưu nhược điểm phương pháp 15 2.4.1 Ưu điểm .15 2.4.2 Nhược điểm 16 2.5 Sự cố xử lý cố 16 2.5.1 Không khuếch đại DNA .16 2.5.2 Sản phẩm không đặc hiệu 17 CHƯƠNG 3: ENZYMEE-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 17 3.1 Nguyên tắc chung ELISA 17 3.2 Các loại ELISA 18 3.2.1 ELISA trực tiếp 18 3.2.2 ELISA cạnh tranh .19 3.2.3 ELISA gián tiếp 20 3.2.4 ELISA cạnh tranh gián tiếp 21 3.2.5 Sandwish ELISA 22 3.4 Quy trình thực kiểm tra mẫu kit ELISA 24 3.4.1 Chuẩn bị chất chuẩn 24 3.4.2 Chuẩn bị dung dịch rửa 24 3.4.3 Các bước phân tích .24 3.4.4 Giai đoạn đọc kết 25 3.5 Ưu nhược điểm phương pháp ELISA 26 3.5.1 Ưu điểm .26 3.5.2 Nhược điểm 26 CHƯƠNG 4: PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) .26 4.1 Nguyên tắc 26 4.2 Thiết bị quy trình thực 27 4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ xác phương pháp .28 4.3.1 Thời gian xung (thời gian chuyển đổi, khoảng thời gian chuyển đổi) 28 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 4.3.2 Cường độ trường 30 4.3.3 Định hướng lại góc .30 4.3.4 Nồng độ agarose gel 31 4.3.5 Thành phần nhiệt độ đệm điện di 31 4.4 Ưu nhược điểm phương pháp 31 4.4.1 Ưu điểm .31 4.4.2 Nhược điểm 31 CHƯƠNG 5: SẮC KÝ KHÍ (GC) .32 5.1 Nguyên tắc sắc ký khí 32 5.2 Chọn điều kiện chạy sắc ký 34 5.2.1 Cột 34 5.2.2 Lựa chọn khí mang .34 5.2.3 Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ lị cột .35 5.2.4 Tối ưu hóa loại đầu phun, nhiệt độ thể tích tiêm 35 5.2.5 Lựa chọn pha tĩnh .36 5.2.6 Tối ưu hóa đầu dị nhiệt độ đầu dị 36 5.3 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu 37 5.4 Ưu nhược điểm phương pháp 37 5.4.1 Ưu điểm .37 5.4.2 Nhược điểm 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cột sắc ký lỏng hiệu cao .3 Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC .5 Hình 1.3 Sắc ký đồ mẫu chạy đẳng dòng Hình 1.4 So sánh hai giản đồ phân tách chế độ đẳng dòng (trái) gradient (phải) Hình 1.5 Quy trình chiết pha rắn Hình 2.1 Giai đoạn biến tính DNA mẫu .12 Hình 2.2 Giai đoạn lai 12 Hình 2.3 Giai đoạn kéo dài 13 Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp bước phương pháp PCR 14 Hình 3.1 Nguyên lý hoạt động phương pháp ELISA 18 Hình 3.2 ELISA trực tiếp để phát kháng nguyên (a) kháng thể (b) 18 Hình 3.3 ELISA cạnh tranh để phát kháng nguyên (a) kháng thể (b) 19 Hình 3.4 ELISA gián tiếp để phân tích kháng thể 21 Hình 3.5 ELISA cạnh tranh gián tiếp để phát kháng nguyên 22 Hình 3.6 Sandwich ELISA để phát kháng nguyên đặc hiệu .23 Hình 3.7 Máy rửa (a), đầu đọc kết (b) máy in (c) sử dụng quy trình ELISA 25 Hình 4.1 Sơ đồ thể chế phân đoạn DNA trình điện di gel trường xung 27 Hình 4.2 Giản đồ thể hình dạng điện cực dụng cụ thường dùng cho điện di gel trường xung 28 Hình 4.3 Ví dụ phân đoạn xác định kích thước DNA nhiễm sắc thể điện di gel trường xung với đoạn dốc thời gian xung 29 Hình 5.1 Sơ đồ hệ thống sắc ký khí .33 i Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 CHƯƠNG I: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY – HPLC) 1.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng (Meyer, 2005) Sắc ký lỏng trình tách xảy cột tách với pha tĩnh chất rắn chất lỏng pha động chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng - lỏng) Mẫu phân tích chuyển lên cột tách dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, chất phân tích phân bố liên tục pha động pha tĩnh Trong hỗn hợp chất phân tích, cấu trúc phân tử tính chất lí hố chất khác nhau, nên khả tương tác chúng với pha tĩnh pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác tách khỏi 1.2 Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (Meyer, 2005) 1.2.1 Pha động sắc ký lỏng Pha động chất rửa giải dung mơi có độ tinh khiết cao hỗn hợp dung môi Các chất phụ gia muối, axit, bazơ, thuốc thử, hòa tan pha động phải tan hoàn toàn Chất rửa giải cần phải lọc qua màng 0,45μm, để giữ lại hạt mịn lớn 0,5 µm màng Nó khơng can thiệp vào phương pháp phát hiện; ví dụ, sử dụng máy dị UV pha động cần phải suốt mặt quang học bước sóng chọn Nên mua dung mơi có chun dụng cho máy HPLC Ngay nước, thành phần phổ biến chất rửa giải, phải đạt cấp HPLC phịng thí nghiệm khơng trang bị hệ thống lọc nước tạo nước siêu tinh khiết Các chất phụ gia phải tương thích với máy dị Pha động chia làm loại: - Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu nước, nhiên để phân tích chất hữu cơ, cần thêm dung mơi để giảm độ phân cực Pha động loại dùng sắc ký pha ngược - Pha động có độ phân cực thấp: dung mơi phân cực cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene… Để tách nhóm chất thơng thường pha động thành phần không đáp ứng khả rửa giải, người ta thường phối hợp hay dung mơi để có Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 dung mơi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động đơi diễn theo thời gian, trường hợp người ta gọi gradient pha động 1.2.2 Bộ phận khử khí (degasser) Bộ khử khí phần thiết bị HPLC Khử khí cho phép máy bơm máy dị hoạt động bình thường Ngồi ra, làm giảm nhiễu đường sở sắc ký đồ, khử khí bắt buộc phân tích vết Nó thực cách sử dụng hệ thống chân khơng dịng chảy có màng thấm khí cách làm bình chứa dung mơi heli 1.2.3 Bơm (pump) Quá trình phân tách HPLC thực áp suất 50–300 bar (0,5–3 × 107 Pa) Tốc độ dòng chảy thường nằm khoảng từ 0,5 đến ml/phút (hoặc khoảng 0,1 ml /phút sử dụng cột có lỗ hẹp) Máy bơm phải cung cấp dịng pha động xác tốc độ dịng mà khơng có xung nhịp, độ nhớt dung môi áp suất ngược cột 1.2.4 Injector, Autosampler Thể tích mẫu thường sử dụng để phân tích HPLC từ 10 đến 100 µl Mẫu bơm thủ cơng vào van tiêm sử dụng lấy mẫu tự động Bộ lấy mẫu tự động sử dụng phổ biến hầu hết thiết bị HPLC Các mẫu cần phân tích cho vào lọ nhỏ (có thể tích ví dụ ml), đậy nắp để vào giá đựng mẫu Giá đỡ làm mát có sẵn thị trường để khảo sát mẫu không bền nhiệt Lượng mẫu tối thiểu cần thiết cho lấy mẫu tự động từ 10 µl (trong trường hợp tối ưu thể tích mẫu bơm vào khơng cao 1–3 µl) 50 µl, tùy thuộc vào cấu tạo chi tiết lọ Khơng có thiết bị lấy mẫu tự động bơm tồn lượng chất lỏng có lọ; phần để lại Tiêm mẫu thủ cơng lựa chọn khơng có đủ mẫu Thay lọ, tiêm trực tiếp từ đĩa giếng sử dụng giá đỡ thích hợp 1.2.5 Cột sắc ký Cột phần quan trọng máy sắc ký phân tách diễn Nó ống thép khơng gỉ có đường kính – 4,6 mm chiều dài 5–30 cm Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 Cột nhồi hạt có cở đường kính 3, 4, 5, 10 µm Chất nhồi cột thường silicagen silicagen có bọc gắn hóa học màng mỏng chất hữu Bên cạnh silicagen người ta dùng Al2O3, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion Các cột vi mơ có đường kính nhỏ mm có sẵn nên sử dụng với thiết bị HPLC vi mô thiết kế đặc biệt Cột lắp đặt van kim phun đầu báo Hình 1.1 Cột sắc ký lỏng hiệu cao Hầu hết cột khơng có hướng dịng chảy định trước cột sử dụng, dịng chảy khơng đảo ngược Tiền cột phận gắn kim phun cột để bảo vệ cột khỏi bụi bẩn chất gây tắc nghẽn Tiền cột rẻ thay cần thiết Đối với nhiều phân tách, cần phải kiểm soát nhiệt độ cột làm việc nhiệt độ cao Do đó, lị cột phần tiêu chuẩn nhiều thiết bị HPLC, chúng lắp đặt sau 1.2.6 Đầu dò (detector) Trong HPLC, mẫu bơm vào đầu cột peak tách rửa giải đầu Do nồng độ thấp dải rửa giải hẹp nên cần thiết bị có độ tinh vi cao để phát chúng Một số máy dị đo đặc tính phần lớn chất rửa giải chiết suất độ dẫn điện Tuy nhiên, hầu hết máy dò xây dựng để phát hợp chất có đặc tính định Một số đầu dị thơng dụng UV/VIS, huỳnh quang, số khúc xạ, độ dẫn điện, điện hóa, tán xạ ánh sáng bay (đối với hợp chất khơng bay hơi) máy dị phân cực Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 Ngồi ra, ghép nối trực tuyến HPLC với phổ khối phổ MS phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Máy dị biến đổi tượng quan sát thành tín hiệu điện, thường điện áp 1.2.7 Bộ xử lý liệu Các tín hiệu máy dị trình bày hình giấy dạng đồ thị cường độ so với thời gian Những sắc ký đồ cung cấp thơng tin định tính (có peak rửa giải không, chúng xuất thời điểm nào?) Và thơng tin định lượng (kích thước pic bao nhiêu?) Việc xác định tính tốn kích thước pic cần thiết thường thực máy tính, sử dụng để điều khiển tồn thiết bị HPLC 1.2.8 Dung mơi thải Một nhược điểm HPLC đắt tiền số trường hợp phải sử dụng dung môi độc hại có hại cho mơi trường Cách tốt để giữ cho khối lượng dung dịch rửa giải lượng dung môi thải mức thấp sử dụng cột có đường kính bên nhỏ, ví dụ: 3, mm thay cột 4,6 mm thường sử dụng 1.2.9 Dây nối Các phận khác máy sắc ký nối với ống mao dẫn có đường kính 0,25 0,18 mm phụ kiện thích hợp Chúng làm từ thép không gỉ nhựa chịu hóa chất Khơng phải tất vật liệu tương thích với tất pha động có, nhựa có giới hạn áp suất định tùy thuộc vào thành phần hóa học, độ dày thành pha động sử dụng 1.2.10 Thiết kế gradients Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Hình 1.2 cho thấy có bình chứa dung mơi, chế độ chạy gọi phân tách đẳng dòng Trong chế độ này, thành phần pha động khơng đổi tồn thời gian sắc ký đồ Đỉnh muộn hình dạng rộng cao Hình 1.3 Sắc ký đồ mẫu chạy đẳng dòng Việc tách hình 1.3 thực cách sử dụng chế độ chạy đẳng dòng Số lượng hợp chất tách bị hạn chế Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 Ngay sau thêm dung dịch dừng, phải đọc kết vòng 10 phút bước sóng 450 nm Trước đọc, nồng độ chất chuẩn phải nhập vào máy đọc ELISA Do đó, thiết bị vẽ đồ thị đường cong tiêu chuẩn tự động tính tốn nồng độ mẫu Tính tốn in Trong phịng thí nghiệm chúng tôi, thiết bị ELISA ELX800 sử dụng để đọc Bộ đọc, máy in vòng đệm sử dụng phương pháp ELISA trình bày hình 3.7 Hình 3.7 Máy rửa (a), đầu đọc kết (b) máy in (c) sử dụng quy trình ELISA 3.5 Ưu nhược điểm phương pháp ELISA (Sakamoto S cộng sự, 2017) 3.5.1 Ưu điểm - Quy trình thực đơn giản - Độ đặc hiệu độ nhạy cao - Hiệu cao - Có thể phân tích đồng thời mà khơng cần xử lý trước mẫu phức tạp - An toàn thân thiện với môi trường - Giá thành thấp 3.5.2 Nhược điểm - Sử dụng nhiều lao động tốn việc chuẩn bị kháng thể - Yêu cầu kỹ thuật phức tạp môi trường nuôi cấy đắt tiền - Khả dương tính/âm tính giả cao - Việc ngăn chặn không đủ kháng nguyên cố định dẫn đến kết sai - Kháng thể không ổn định - Cần phải vận chuyển bảo quản tủ lạnh kháng thể protein 26 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 CHƯƠNG 4: PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) 4.1 Nguyên tắc (Nassonova E S., 2008) Điện di gel trường xung (PFGE) kỹ thuật cho phép tách phân tử DNA gel agarose cách sử dụng hai điện trường xen kẽ, với vectơ hướng tới góc tù PFGE phân đoạn phân tử DNA lớn có kích thước từ 10 kb đến 10 Mb Trong phạm vi DNA nhiễm sắc thể sinh vật nhân sơ sinh vật nhân thực bậc thấp; đó, điều khiển DNA toàn nhiễm sắc thể đoạn lớn chúng (đối với sinh vật bậc cao) Đó lý mà kỹ thuật công cụ quan trọng hệ gen đại Hình 4.1 Sơ đồ thể chế phân đoạn DNA trình điện di gel trường xung Khi chuyển đổi điện trường, phân tử DNA bắt đầu chuyển động ngược lại gel dẫn đầu đuôi trước chúng Mỗi phân tử di chuyển phía sau khoảng tỷ lệ với kích thước (a), (b) Sau đó, phân tử bắt đầu chuyển động trường (c) Kết là, phân tử dài nằm sau phân tử ngắn Với chuyển đổi trường mới, chậm lại phân tử dài 27 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 trở nên sâu sắc (d), (e), (f) E1, E2 vectơ cường độ điện trường; mũi tên dài ngắn cho biết phân tử DNA dài ngắn Các đầu mũi tên cho biết hướng di chuyển phân tử đó, vị trí đầu cuối chúng Các đường đứt nét hiển thị dấu vết di chuyển phân tử gel 4.2 Thiết bị quy trình thực (Nassonova E S., 2008) Điện trường chuyển đổi khoảng thời gian định góc 90° Gel đặt vào buồng để điện di ngang Một điện trường đồng tạo hai hàng điểm điện cực Trường lại không đồng tạo số điểm điện cực làm cực âm điểm điện cực làm cực dương Hệ thống gọi “điện di gradient trường xung” (PFGE) Hình 4.2 Giản đồ thể hình dạng điện cực dụng cụ thường dùng cho điện di gel trường xung Các tác giả coi gradient điện điều kiện tiên để phân tử DNA tách trường xung Do đó, họ sử dụng cấu hình điện cực cuối tạo 28 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 trường không đồng Trong hệ thống này, góc vectơ cường độ trường thay đổi vùng gel khác (110° –150°) Các phân tử có kích thước di chuyển với tốc độ khác tùy thuộc vào vị trí ban đầu chúng gel; điều làm phức tạp việc so sánh di động điện di DNA chạy đường viền khiến khơng thể ước tính xác kích thước 4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ xác phương pháp (Nassonova E S., 2008) 4.3.1 Thời gian xung (thời gian chuyển đổi, khoảng thời gian chuyển đổi) Thời gian xung khoảng thời gian chuyển hướng trường Các thí nghiệm phân đoạn ADN điện trường xung cho thấy thời gian xung thông số quan trọng để phân tách phân tử Kích thước phân tử phân đoạn lớn việc chuyển đổi điện trường Với thời gian xung định, phân tử thuộc loại kích thước cụ thể xuất điều kiện tối ưu để tách phân đoạn cách hiệu Do đó, để phân đoạn DNA phạm vi kích thước rộng, cần phải tìm chế độ tăng thời gian xung 29 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 Hình 4.3 Ví dụ phân đoạn xác định kích thước DNA nhiễm sắc thể điện di gel trường xung với đoạn dốc thời gian xung Sự thay đổi thời gian xung trình điện di gọi “tăng dần” Tham số tăng lên suốt q trình chạy liên tục không liên tục phạm vi giá trị rời rạc Sự gia tăng liên tục thời gian xung từ nhỏ đến lớn giá trị xác định khoảng thời gian định gọi "nội suy" Một biến thể thay thế, thời gian xung tăng lên bước, gọi "bước" Sự phân giải phân tử gel đặc trưng khoảng cách dải độ sắc nét dải Vùng gel nơi đạt hiệu phân tách DNA gọi “vùng phân giải” hay “cửa sổ phân giải” Sự phụ thuộc tốc độ di chuyển DNA kích thước phân tử tuyến tính vùng phân giải; đó, ước tính xác kích thước phân tử DNA vùng 4.3.2 Cường độ trường Độ phân giải hàm thời gian xung cường độ điện trường Nhìn chung, cường độ trường cao tốc độ di chuyển phân tử cao Tuy nhiên, kích thước phân tử cao phụ thuộc lệch khỏi hàm tuyến tính 30 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 Để tách phân tử nhỏ Mb, cường độ trường áp dụng –10 V/cm Cường độ trường thấp, độ phân giải cao; nhiên, phạm vi kích thước phân tử phân tách hẹp Cường độ trường cao mức (cao 10 V/cm) dẫn đến phân tách phân tử yếu xuất gọi “vết bẩn”, tức vùng nhuộm DNA đồng với dải đơn không xác định mắt thường Đối với phân tử lớn (hơn Mb), cường độ trường cao dẫn đến “hiệu ứng bẫy”, tức cố định phân tử vĩnh viễn tự phát gel thay đổi cụ thể đảo ngược cấu trúc chúng Các phân tử ưu tiên phân đoạn cường độ trường thấp (1–3 V/cm) Thời gian xung cường độ trường yếu tố có liên quan lẫn Độ phân giải PFGE xác định “hàm Window” sau: W = E1,4 × Tp Trong E cường độ điện trường Tp thời gian xung Giá trị hàm cao, kích thước phân tử DNA lớn để phân tách hiệu Rõ ràng đạt phân tách phân tử DNA có dải kích thước với thời gian xung khác cường độ trường thay đổi cho giá trị hàm W khơng đổi 4.3.3 Định hướng lại góc Tham số số thiết bị PFGE cố định Ở thiết bị khác, thay đổi từ 90 đến 180° Người ta chứng minh thay đổi góc định hướng lại khơng ảnh hưởng đáng kể đến di chuyển phân tử nhỏ Mb Độ linh động phân tử lớn tăng góc giảm; nhiên, độ phân giải dải gel ngày giảm Theo kinh nghiệm, người ta thấy phân tách tốt đạt với giá trị góc 110° Hầu hết dụng cụ thương mại có sẵn cho PFGE sử dụng góc cố định 120° 4.3.4 Nồng độ agarose gel Nồng độ agarose gel ảnh hưởng đến tính di động phân tử DNA trình điện di trường xung trường không đổi Người ta thấy độ phân giải có phần tốt gel agarose 1,2% so với gel 0,9% Việc tăng thêm nồng độ agarose làm giảm tính linh động làm 31 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 tăng thời gian chạy mà không cải thiện độ phân giải Trong thực tế, để tách phân tử có kích thước nhỏ Mb, gel agarose 1,0–1,5% thường sử dụng 4.3.5 Thành phần nhiệt độ đệm điện di Bộ đệm có độ bền ion cao, Tris-borate (0,5 × TBE) Tris-acetate (1 × TAE) thường sử dụng cho PFGE Tính linh động điện di phân tử DNA trường xung phụ thuộc mạnh mẽ vào nhiệt độ đệm Nhiệt độ cao, tốc độ di chuyển phân tử cao PFGE thường thực 12–16°C Ở nhiệt độ đệm cao hơn, dải trở nên rộng khuếch tán Nó làm giảm đáng kể độ phân giải xuất vết bẩn 4.4 Ưu nhược điểm phương pháp (Olive D M., 1999) 4.4.1 Ưu điểm PFGE chứng minh vượt trội so với hầu hết phương pháp khác để phân tích sinh hóa phân tử Nó có tính phân biệt cao ưu việt hầu hết phương pháp phân tích Escherichia coli, enterococci kháng vancomycin, S aureus, loài Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa M avium PFGE hiệu việc phân biệt chủng S aureus kháng methicillin so với phương pháp khác thử nghiệm PFGE có tính phân biệt cao so với PCR dựa trình tự yếu tố lặp lại (Rep-PCR) để phân biệt chủng Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii phức hợp, cầu khuẩn ruột kháng vancomycin, Neisseria gonorrhoeae P aeruginosa 4.4.2 Nhược điểm Một yếu tố hạn chế việc sử dụng PFGE thời gian hồn thành phân tích Mặc dù bước thủ tục đơn giản thời gian cần thiết để hồn thành thủ tục từ đến ngày Điều làm giảm khả phân tích số lượng lớn mẫu phịng thí nghiệm 32 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 CHƯƠNG 5: SẮC KÝ KHÍ 5.1 Nguyên tắc sắc ký khí (Al-Bukhaiti W Q., 2017) Cơ sở phân tách chậm lại thành phần riêng lẻ chúng di chuyển qua cột dài khí mang, thường heli nitơ Cột bao gồm ống thép thủy tinh chứa đầy vật liệu đóng gói trơ thủy tinh hạt gốm 33 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 Hình 5.1 Sơ đồ hệ thống sắc ký khí Trong sắc ký khí-lỏng (GLC), chúng phủ lớp chất lỏng dễ bay hơi, diện tích bề mặt chất lỏng tiếp xúc với khí lớn Đối với số ứng dụng, bao bì chất rắn mà khơng có lớp phủ chất lỏng gọi sắc ký khí-rắn (GSC), phương pháp sử dụng rộng rãi GLC Mẫu bơm vào dịng khí mang Khi di chuyển qua cột với khí mang, phân tử chất có mẫu phân bố chất khí chất lỏng Các phân tử riêng lẻ liên tục chuyển động chất khí chất lỏng trạng thái cân động Khi phân tử pha khí, dọc theo cột, hòa tan chất lỏng, đứng yên Một chất dễ bay hơi, tỷ lệ thời gian phân tử chuyển động khí mang lớn, đó, khỏi cột sớm Bằng cách này, chất tách cột tách theo thời gian cuối Thời gian từ tiêm đến peak lên gọi thời gian lưu (Rt), đặc trưng cho chất tập hợp điều kiện định Nó phụ thuộc vào độ bay chất, nhiệt độ cột chiều dài đường kính Nhiều chất có thời gian lưu giữ lâu nhiệt độ phòng cách bất tiện điều khắc phục cách nung cột lò Sau tách thành phần cột để chúng lên riêng lẻ, cần có số phương pháp phát đo lường chúng Hai loại detector thường sử dụng: dẫn nhiệt ion hóa lửa Máy dò độ dẫn nhiệt (TCD) dựa thay đổi độ dẫn nhiệt khí rời khỏi cột Khí mang helium tinh khiết qua dây tóc vonfram-helium nóng, làm cho nguội đi, heli có độ dẫn nhiệt cao Khi chất hóa học xuất với khí 34 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 mang, q trình làm mát nhiệt độ dây tóc tăng lên Như với hầu hết kim loại, điện trở tăng theo nhiệt độ điều đo ghi lại Phát ion hóa lửa (FID) thường gặp ứng dụng thực phẩm, nhiều hợp chất khảo sát hữu (có chứa cacbon) FID nhạy khoảng nghìn lần so với phát độ dẫn nhiệt chất hữu Khí khỏi cột đốt cháy với hỗn hợp hydro khơng khí Điều tạo thành ion, dẫn dòng điện khuếch đại ghi lại máy ghi biểu đồ Mặc dù số lượng ion tạo thành theo cách nhỏ, có lẽ 0,0001% tổng số nguyên tử cacbon có mẫu, tỷ lệ tạo không đổi Điều có nghĩa tổng tín hiệu ghi ghi biểu đồ tỷ lệ với lượng hóa chất diện 5.2 Chọn điều kiện chạy sắc ký (Al-Bukhaiti W Q., 2017) 5.2.1 Cột Tất nhiên, cột phần khởi đầu trung tâm máy sắc ký Cột lựa chọn thích hợp tạo phân tách sắc ký tốt để cung cấp phân tích xác đáng tin cậy Cột sử dụng khơng cách thường tạo phân tách khó hiểu, khơng đầy đủ kém, dẫn đến kết không hợp lệ phức tạp để diễn giải Có 10, 000 hợp chất phân tích GC 400 cột mao quản GC Các lựa chọn ban đầu cột thiết bị hỗ trợ có ảnh hưởng sâu sắc đến khả kết cuối việc tối ưu hóa phân tách Thao tác thơng số cột (pha tĩnh, đường kính trong, chiều dài độ dày màng) cho phép máy sắc ký kiểm soát hiệu cột, độ phân giải tốc độ phân tích Trong sắc ký khí, thứ tự rửa giải chất phân tích bị chi phối số yếu tố áp suất tiềm ẩn, khả hòa tan pha tĩnh xu hướng tương tác phân tử pha tĩnh Tất hiệu ứng thay đổi theo nhiệt độ hiệu ứng phối hợp chúng cuối xác định phân bố cân phân tử chất tan pha động pha tĩnh 5.2.2 Lựa chọn khí mang Việc xác định vận tốc tuyến tính trung bình tốt dễ dàng liên quan đến lượng nhỏ thử sai Hydro cung cấp độ phân giải tốt khoảng thời gian ngắn 35 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 Helium cung cấp độ phân giải tương tự, thời gian phân tích lâu Khi sử dụng heli làm khí mang, thử vận tốc tuyến tính trung bình ban đầu 30 cm/giây Nitơ khơng khuyến khích sử dụng với cột mao quản thời gian phân tích dài Việc lựa chọn khí sử dụng làm pha động sắc ký khí chịu ảnh hưởng yêu cầu cân nhắc sau: Trơ, Khô, oxy tự do, an tồn, chi phí tính sẵn có 5.2.3 Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ lị cột Cột đặt tủ sấy nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hiệu trình tách sắc ký, yếu tố quan trọng sử dụng để kiểm soát GC Trong nhiều trường hợp, đẳng nhiệt chế độ nhiệt độ hiệu để tách mẫu; trường hợp vậy, chương trình nhiệt độ sử dụng Hầu hết chương trình nhiệt độ GC có nhiệt độ ban đầu, đoạn đường nối (độ tăng phút) nhiệt độ cuối Sử dụng chương trình nhiệt độ tuyến tính làm điểm bắt đầu thơng tin phân tích trước khơng có sẵn để sử dụng làm hướng dẫn, bước phát triển chương trình thử chương trình nhiệt độ tuyến tính, đơn giản Để cải thiện độ phân giải pic rửa giải sớm hơn, giảm nhiệt độ ban đầu tăng thời gian giữ ban đầu Giảm nhiệt độ ban đầu thường dẫn đến cải thiện độ phân giải lớn nhất, thời gian phân tích tăng lên Độ phân giải peak rửa giải sắc ký đồ bị thay đổi thay đổi tốc độ dốc Nếu có độ phân giải đỉnh mức, tốc độ đường nối tăng lên để giảm độ phân giải thời gian phân tích Nếu khơng đủ độ phân giải, giảm tốc độ đường nối, tăng thời gian phân tích Độ phân giải tốt đỉnh rửa giải sau thường xảy giảm tốc độ dốc 5.2.4 Tối ưu hóa loại đầu tiêm, nhiệt độ thể tích tiêm Đưa mẫu vào hệ thống GC bước quan trọng trình phân tách Độ tái lập lượng mẫu bơm vào quan trọng để đảm bảo độ tái lập kết Mẫu bơm thủ cơng vào hệ thống cách sử dụng hệ thống lấy mẫu tự động Một lỗi lớn GC kỹ thuật tiêm 36 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 Nhiệt độ kim phun để tách Nhiệt độ kim phun sử dụng để hóa nhanh chóng mẫu lỏng thành pha khí đưa sang cột để tách Trong sắc ký khí mao quản vi đóng gói (GC), có bốn kỹ thuật để làm bay mẫu chuyển vào đầu vào cột phân tích: tiêm tách, khơng tách, trực tiếp cột Trong phương pháp này, tiêm tách tiêm không tách lớp kỹ thuật sử dụng phổ biến Tiêm tách chọn để phân tích mẫu có nồng độ cao Trong chế độ tiêm phân chia, phần nhỏ mẫu hóa chuyển lên đầu cột Phần cịn lại mẫu hóa đưa khỏi cổng tiêm qua đường thông phân chia Chỉ nên sử dụng cách tiêm phân chia nồng độ mẫu đủ cao để loại bỏ phần mẫu trình tiêm, trì đủ nồng độ chất phân tích máy dị để tạo dấu hiệu 5.2.5 Lựa chọn pha tĩnh Khi chọn cột, trước tiên xác định đặc tính mẫu để phù hợp với pha tĩnh cột Pha tĩnh nói chung chia thành loại: thứ không phân cực, thứ hai cực thứ ba có cực Pha tĩnh phân loại thêm Siloxan (không phân cực trung cực) Polyethylene glycol (PEG phân cực) G1, G2 G38 (100% Methyl Polysiloxan) không trải qua tương tác liên kết hydro Sự thay đổi thứ tự rửa giải Hexanol Phenol với G14, G15, G16, G20, G39 G47 (Polyetylen glycol) kết hợp tương tác liên kết lưỡng cực liên kết hydro 5.2.6 Tối ưu hóa đầu dị nhiệt độ đầu dò Nhiều loại đầu dò bán thị trường để sử dụng với GC, loại có hạn chế ưu điểm riêng Đầu dị sử dụng phổ biến GC đầu dị ion hóa lửa Nhiệt độ đầu dị tốc độ dịng chảy tương đối khí mang, hydro khơng khí vào đầu dị thơng số vận hành Một loạt tiêu chuẩn xác định để đánh giá thông số máy dị độ trơi, độ ồn, độ nhạy, dải tuyến tính, dải động Sự thay đổi phản ứng đầu dò với tốc độ dòng phụ thuộc vào việc đầu dò phụ thuộc vào nồng độ hay khối lượng 37 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 Đối với tách sóng phụ thuộc nồng độ (ví dụ, phát độ dẫn nhiệt, tách sóng ion hóa ảnh), việc giảm tốc độ dịng chảy không ảnh hưởng đến chiều cao peak, giá trị gần không đổi Tuy nhiên, chiều rộng peak diện tích peak tăng lên Ngược lại, hệ thống phát dịng khối lượng (ví dụ, phát ion hóa lửa, phát trắc quang lửa, phát phốt nitơ) phản ứng tỷ lệ nghịch với thời gian lưu 5.3 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu (Al-Bukhaiti W Q., 2017) Sắc ký khí chủ yếu sử dụng để phân tích hợp chất dễ bay bền nhiệt Tuy nhiên, xử lý mẫu khơng bay hơi, phản ứng hóa học thực mẫu để tăng độ bay hợp chất Các hợp chất có chứa nhóm chức OH, NH, CO 2H SH khó phân tích GC chúng khơng đủ bay hơi, bị hút mạnh vào pha tĩnh không bền nhiệt Hầu hết phản ứng tạo dẫn xuất phổ biến sử dụng cho GC chia thành ba loại: - Silylation - Acylation - Alkyl hóa & Este hóa Các mẫu tạo dẫn xuất trước phân tích để: - Tăng độ bay giảm độ phân cực hợp chất - Giảm suy thoái nhiệt - Tăng độ nhạy cách kết hợp nhóm chức dẫn đến tín hiệu dị cao - Cải thiện phân tách giảm gắn đuôi 5.4 Ưu nhược điểm phương pháp (Al-Bukhaiti W Q., 2017) 5.4.1 Ưu điểm - Độ phân giải tốt, thể đỉnh sắc nét đối xứng - Độ lặp lại cao độ tái lập thời gian lưu - Độ xác cao độ xác định lượng dựa phép đo diện tích peak, tức khơng có phân biệt thành phần thông qua độ bay hơi, độ phân cực nồng độ 38 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 5.4.2 Nhược điểm - Chỉ phân tích cấu tử nhẹ - Mơi trường mẫu phải có độ bay chất phân tích TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) lOMoARcPSD|12201492 [1] Al-Bukhaiti W Q., Noman A., Qasim A S., & Al-Farga A (2017), Gas chromatography: Principles, advantages and applications in food analysis, International Journal of Agriculture Innovations and Research, 6(1), page 123-128 [2] Aydin S (2015), A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA, Peptides, 72, 4-15 DOI: https://doi.org/10.1016/j.peptides.2015.04.012 [3] Dey P (2018), Polymerase Chain Reaction: Principle, Technique and Applications in Pathology, Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology, page 201 – 211 DOI: https://doi.org/10.1007/978-981-10-8252-8_20 [4] Karim Kadri (2019), Polymerase Chain Reaction (PCR): Principle and Applications, Synthetic Biology - New Interdisciplinary Science DOI: 10.5772/intechopen.86491 [5] Meyer V.R (2005), High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), Practical Methods in Cardiovascular Research, page 661 – 685 DOI: https://doi.org/10.1007/3540-26574-0_35 [6] Nassonova E S (2008), Pulsed field gel electrophoresis: theory, instruments and application, Cell and Tissue Biology, 2(6), 557 [7] Olive D M., & Bean P (1999), Principles and applications of methods for DNAbased typing of microbial organisms, Journal of clinical microbiology, 37(6), page 1661-1669 DOI: 10.1128/JCM.37.6.1661-1669.1999 [8] Sakamoto S., Putalun W., Vimolmangkang S., Phoolcharoen W., Shoyama Y., Tanaka H., & Morimoto S (2018), Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites, Journal of natural medicines, 72(1), page 32-42 DOI: 10.1007/s11418-017-1144-z 40 Downloaded by Hiep Khach Giang Ho (hiepkhachhcm2015@gmail.com) ... chất phân tích cần định lượng Nếu peak chất phân tích phân giải tốt khỏi peak lân cận sử dụng hợp chất chuẩn tinh khiết Nếu không, tốt sử dụng chất đối chiếu hỗn hợp với lượng chất phân tích. .. ký Ban đầu, chất nội chuẩn thêm vào mẫu thử mẫu tham chiếu với lượng giống hệt Từ tỷ lệ khối lượng nồng độ biết chất nội chuẩn chất phân tích mẫu chuẩn, tính lượng "thực" chất phân tích mẫu cách... diện tích peak chiều cao peak để định lượng Mối quan hệ lượng chất phân tích bơm vào kích thước peak mơ tả hệ số đáp ứng thực nghiệm, cần phải thực phân tách hiệu chuẩn với lượng nồng độ biết chất