3.5.1 Ưu điểm
- Quy trình thực hiện đơn giản - Độ đặc hiệu và độ nhạy cao - Hiệu quả cao
- Có thể phân tích đồng thời mà không cần xử lý trước mẫu phức tạp - An toàn và thân thiện với môi trường
- Giá thành thấp.
3.5.2 Nhược điểm
- Sử dụng nhiều lao động và tốn kém trong việc chuẩn bị kháng thể - Yêu cầu kỹ thuật phức tạp và môi trường nuôi cấy đắt tiền
- Khả năng dương tính/âm tính giả cao
- Việc ngăn chặn không đủ kháng nguyên cố định dẫn đến kết quả sai - Kháng thể không ổn định
CHƯƠNG 4: PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) 4.1 Nguyên tắc (Nassonova E. S., 2008)
Điện di trên gel trường xung (PFGE) là một kỹ thuật cho phép tách các phân tử DNA trong gel agarose bằng cách sử dụng hai điện trường xen kẽ, với các vectơ hướng tới nhau ở góc tù.
PFGE phân đoạn các phân tử DNA lớn có kích thước từ 10 kb đến 10 Mb. Trong phạm vi này là DNA nhiễm sắc thể của sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân thực bậc thấp; do đó, có thể điều khiển DNA của toàn bộ nhiễm sắc thể hoặc các đoạn lớn của chúng (đối với sinh vật bậc cao). Đó là lý do mà kỹ thuật này là một công cụ quan trọng trong hệ gen hiện đại.
Hình 4.1 Sơ đồ thể hiện cơ chế phân đoạn DNA trong quá trình điện di trên gel trường xung
Khi chuyển đổi điện trường, các phân tử DNA đầu tiên bắt đầu chuyển động ngược lại trong gel được dẫn đầu bởi các đuôi trước của chúng. Mỗi phân tử di chuyển về phía sau một khoảng tỷ lệ với kích thước (a), (b) của nó. Sau đó, các phân tử bắt đầu chuyển động trong một trường mới (c). Kết quả là, các phân tử dài hơn nằm sau các phân tử ngắn hơn. Với mỗi chuyển đổi trường mới, sự chậm lại của các phân tử dài
hơn trở nên sâu sắc hơn (d), (e), (f). E1, E2 là vectơ cường độ điện trường; các mũi tên dài và ngắn lần lượt cho biết các phân tử DNA dài và ngắn. Các đầu mũi tên cho biết hướng di chuyển của các phân tử và do đó, vị trí của các đầu cuối của chúng. Các đường đứt nét hiển thị các dấu vết của sự di chuyển phân tử trong gel.
4.2 Thiết bị và quy trình thực hiện (Nassonova E. S., 2008)
Điện trường được chuyển đổi trong những khoảng thời gian nhất định ở một góc 90°.
Gel được đặt vào buồng để điện di ngang. Một điện trường là đồng nhất và được tạo ra bởi hai hàng điểm điện cực. Trường còn lại là không đồng nhất và được tạo ra bởi một số điểm điện cực làm cực âm và một điểm điện cực làm cực dương. Hệ thống này được gọi là “điện di gradient trường xung” (PFGE).
Hình 4.2 Giản đồ thể hiện hình dạng điện cực trong các dụng cụ thường dùng cho điện di gel trường xung
Các tác giả coi gradient điện thế là điều kiện tiên quyết để các phân tử DNA được tách ra trong trường xung. Do đó, họ đã sử dụng các cấu hình điện cực cuối cùng tạo ra
một trường không đồng nhất. Trong hệ thống này, góc giữa các vectơ cường độ trường thay đổi ở các vùng gel khác nhau (110° –150°).
Các phân tử có kích thước bằng nhau di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào vị trí ban đầu của chúng trong gel; điều này làm phức tạp việc so sánh các di động điện di của các DNA chạy trên các làn đường viền khiến không thể ước tính chính xác kích thước.
4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp (Nassonova E. S.,2008) 2008)
4.3.1 Thời gian xung (thời gian chuyển đổi, khoảng thời gian chuyển đổi)
Thời gian xung là khoảng thời gian chuyển hướng của trường. Các thí nghiệm đầu tiên về phân đoạn ADN trong điện trường xung cho thấy thời gian xung là thông số quan trọng nhất để phân tách phân tử.
Kích thước của các phân tử phân đoạn càng lớn thì việc chuyển đổi điện trường càng ít.
Với một thời gian xung nhất định, chỉ các phân tử thuộc một loại kích thước cụ thể mới xuất hiện trong điều kiện tối ưu để tách và có thể được phân đoạn một cách hiệu quả. Do đó, để phân đoạn DNA trong một phạm vi kích thước rộng, cần phải tìm ra chế độ tăng tuần tự của thời gian xung.
Hình 4.3 Ví dụ về phân đoạn và xác định kích thước của DNA nhiễm sắc thể bằng điện di trên gel trường xung với đoạn dốc thời gian xung
Sự thay đổi của thời gian xung trong quá trình điện di được gọi là “tăng dần”. Tham số này có thể được tăng lên trong suốt quá trình chạy liên tục hoặc không liên tục trên một phạm vi giá trị rời rạc. Sự gia tăng liên tục của thời gian xung từ nhỏ nhất đến lớn nhất của các giá trị xác định trong một khoảng thời gian nhất định được gọi là "nội suy". Một biến thể thay thế, thời gian xung tăng lên từng bước, được gọi là "bước".
Sự phân giải phân tử trong gel được đặc trưng bởi khoảng cách dải và độ sắc nét của dải. Vùng trong gel nơi đạt được hiệu quả phân tách DNA được gọi là “vùng phân giải” hay “cửa sổ phân giải”. Sự phụ thuộc giữa tốc độ di chuyển DNA và kích thước phân tử là tuyến tính trong vùng phân giải; do đó, có thể ước tính chính xác kích thước của các phân tử DNA trong vùng này.
4.3.2 Cường độ trường
Độ phân giải là hàm của cả thời gian xung và cường độ điện trường. Nhìn chung, cường độ trường càng cao thì tốc độ di chuyển phân tử càng cao. Tuy nhiên, kích thước phân tử càng cao thì sự phụ thuộc này càng lệch khỏi hàm tuyến tính.
Để tách các phân tử nhỏ hơn 1 Mb, cường độ trường áp dụng là 6 –10 V/cm. Cường độ trường càng thấp, độ phân giải càng cao; tuy nhiên, phạm vi kích thước của các phân tử được phân tách hẹp hơn.
Cường độ trường cao quá mức (cao hơn 10 V/cm) dẫn đến sự phân tách phân tử yếu và xuất hiện cái gọi là “vết bẩn”, tức là các vùng nhuộm DNA đồng nhất với các dải đơn không xác định bằng mắt thường.
Đối với các phân tử lớn (hơn 1 Mb), cường độ trường cao dẫn đến “hiệu ứng bẫy”, tức là sự cố định phân tử vĩnh viễn tự phát trong gel do những thay đổi cụ thể không thể đảo ngược của cấu trúc của chúng. Các phân tử như vậy được ưu tiên phân đoạn ở cường độ trường thấp (1–3 V/cm).
Thời gian xung và cường độ trường là các yếu tố có liên quan lẫn nhau. Độ phân giải PFGE được xác định bằng “hàm Window” sau:
W = E1,4 × Tp
Trong đó E là cường độ điện trường và Tp là thời gian xung.
Giá trị của hàm càng cao, kích thước của các phân tử DNA càng lớn để có thể phân tách hiệu quả. Rõ ràng là có thể đạt được sự phân tách các phân tử DNA có cùng dải kích thước với thời gian xung khác nhau nếu cường độ trường được thay đổi sao cho giá trị hàm W không đổi.
4.3.3 Định hướng lại góc
Tham số này trong một số thiết bị PFGE là cố định. Ở những thiết bị khác, nó thay đổi từ 90 đến 180°. Người ta chứng minh rằng sự thay đổi của góc định hướng lại không ảnh hưởng đáng kể đến sự di chuyển của các phân tử nhỏ hơn 1 Mb. Độ linh động của các phân tử lớn hơn tăng khi góc giảm; tuy nhiên, độ phân giải dải trong gel ngày càng giảm. Theo kinh nghiệm, người ta thấy rằng sự phân tách tốt nhất đạt được với giá trị góc hơn 110°. Hầu hết các dụng cụ thương mại có sẵn cho PFGE sử dụng một góc cố định 120°.
4.3.4 Nồng độ agarose trong gel
Nồng độ agarose trong gel ít ảnh hưởng đến tính di động của các phân tử DNA trong quá trình điện di trong trường xung hơn là trong trường không đổi.
Người ta thấy rằng độ phân giải có phần tốt hơn đối với gel agarose 1,2% so với gel 0,9%. Việc tăng thêm nồng độ agarose chỉ làm giảm tính linh động và do đó làm
tăng thời gian chạy mà không cải thiện độ phân giải. Trong thực tế, để tách các phân tử có kích thước nhỏ hơn 3 Mb, gel agarose 1,0–1,5% thường được sử dụng.
4.3.5 Thành phần và nhiệt độ của đệm điện di
Bộ đệm có độ bền ion cao, Tris-borate (0,5 × TBE) hoặc Tris-acetate (1 × TAE) thường được sử dụng cho PFGE.
Tính linh động điện di của các phân tử DNA trong trường xung phụ thuộc mạnh mẽ vào nhiệt độ đệm. Nhiệt độ càng cao, tốc độ di chuyển phân tử càng cao.
PFGE thường được thực hiện ở 12–16°C. Ở nhiệt độ đệm cao hơn, các dải trở nên rộng và khuếch tán. Nó làm giảm đáng kể độ phân giải và sự xuất hiện của vết bẩn.
4.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp (Olive D. M., 1999)4.4.1 Ưu điểm 4.4.1 Ưu điểm
PFGE đã được chứng minh là vượt trội so với hầu hết các phương pháp khác để phân tích sinh hóa và phân tử. Nó có tính phân biệt cao và ưu việt hơn hầu hết các phương pháp phân tích Escherichia coli, enterococci kháng vancomycin, S. aureus,
loài Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa và M. avium.
PFGE hiệu quả hơn trong việc phân biệt các chủng S. aureus kháng methicillin so với các phương pháp khác được thử nghiệm.
PFGE cũng có tính phân biệt cao hơn so với PCR dựa trên trình tự yếu tố lặp lại (Rep-PCR) để phân biệt các chủng của Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii phức hợp, cầu khuẩn ruột kháng vancomycin, Neisseria gonorrhoeae và P. aeruginosa.
4.4.2 Nhược điểm
Một trong những yếu tố đã hạn chế việc sử dụng PFGE là thời gian hoàn thành phân tích. Mặc dù các bước thủ tục đơn giản nhưng thời gian cần thiết để hoàn thành thủ tục có thể từ 2 đến 3 ngày. Điều này có thể làm giảm khả năng phân tích số lượng lớn mẫu của phòng thí nghiệm.
CHƯƠNG 5: SẮC KÝ KHÍ 5.1 Nguyên tắc của sắc ký khí (Al-Bukhaiti W. Q., 2017)
Cơ sở của sự phân tách là sự chậm lại của các thành phần riêng lẻ khi chúng được di chuyển qua một cột dài bởi khí mang, thường là heli hoặc nitơ.
Cột bao gồm một ống thép hoặc thủy tinh chứa đầy vật liệu đóng gói trơ như thủy tinh hoặc hạt gốm.
Hình 5.1 Sơ đồ của hệ thống sắc ký khí
Trong sắc ký khí-lỏng (GLC), chúng được phủ một lớp chất lỏng dễ bay hơi, do đó diện tích bề mặt của chất lỏng tiếp xúc với khí là lớn.
Đối với một số ứng dụng, bao bì có thể là chất rắn mà không có bất kỳ lớp phủ chất lỏng nào được gọi là sắc ký khí-rắn (GSC), nhưng phương pháp này ít được sử dụng rộng rãi hơn GLC.
Mẫu được bơm vào dòng khí mang. Khi nó di chuyển qua cột với khí mang, các phân tử của mỗi chất có trong mẫu sẽ phân bố giữa chất khí và chất lỏng. Các phân tử riêng lẻ sẽ liên tục chuyển động giữa chất khí và chất lỏng ở trạng thái cân bằng động. Khi một phân tử ở trong pha khí, nó sẽ đi dọc theo cột, trong khi vẫn hòa tan trong chất lỏng, nó sẽ đứng yên. Một chất càng dễ bay hơi, thì tỷ lệ thời gian các phân tử của nó chuyển động trong khí mang càng lớn, và do đó, nó sẽ ra khỏi cột càng sớm. Bằng cách này, mỗi chất sẽ tách ra trong cột và tách ra theo thời gian ở cuối.
Thời gian từ khi tiêm đến khi peak hiện lên được gọi là thời gian lưu (Rt), và đặc trưng cho từng chất trong bất kỳ tập hợp điều kiện nhất định nào. Nó phụ thuộc vào độ bay hơi của chất, cũng như nhiệt độ của cột và chiều dài và đường kính của nó. Nhiều chất có thời gian lưu giữ lâu ở nhiệt độ phòng một cách bất tiện và điều này được khắc phục bằng cách nung cột trong lò.
Sau khi tách các thành phần trong cột để chúng nổi lên riêng lẻ, cần có một số phương pháp phát hiện và đo lường chúng. Hai loại detector thường được sử dụng: dẫn nhiệt và ion hóa ngọn lửa.
Máy dò độ dẫn nhiệt (TCD) dựa trên sự thay đổi độ dẫn nhiệt của khí rời khỏi cột. Khí mang helium tinh khiết đi qua một dây tóc vonfram-helium nóng, làm cho nó nguội đi, vì heli có độ dẫn nhiệt rất cao. Khi một chất hóa học xuất hiện cùng với khí
mang, quá trình làm mát sẽ ít hơn và nhiệt độ của dây tóc sẽ tăng lên. Như với hầu hết các kim loại, điện trở của nó tăng theo nhiệt độ và điều này có thể được đo và ghi lại.
Phát hiện ion hóa ngọn lửa (FID) thường gặp hơn trong các ứng dụng thực phẩm, vì nhiều hợp chất đang được khảo sát là hữu cơ (có chứa cacbon) và FID nhạy hơn khoảng một nghìn lần so với phát hiện độ dẫn nhiệt đối với các chất hữu cơ. Khí thoát ra khỏi cột được đốt cháy với hỗn hợp hydro và không khí. Điều này tạo thành các ion, dẫn một dòng điện có thể được khuếch đại và ghi lại trên một máy ghi biểu đồ. Mặc dù số lượng ion được tạo thành theo cách này là nhỏ, có lẽ chỉ bằng 0,0001% tổng số nguyên tử cacbon có trong mẫu, tỷ lệ được tạo ra luôn không đổi. Điều này có nghĩa là tổng tín hiệu được ghi trên bộ ghi biểu đồ tỷ lệ với lượng hóa chất hiện diện.
5.2 Chọn điều kiện chạy sắc ký (Al-Bukhaiti W. Q., 2017)5.2.1 Cột 5.2.1 Cột
Tất nhiên, cột là phần khởi đầu và trung tâm của một máy sắc ký. Cột được lựa chọn thích hợp có thể tạo ra sự phân tách sắc ký tốt để cung cấp phân tích chính xác và đáng tin cậy.
Cột được sử dụng không đúng cách thường có thể tạo ra sự phân tách khó hiểu, không đầy đủ và kém, có thể dẫn đến kết quả không hợp lệ hoặc phức tạp để diễn giải. Có hơn 10, 000 hợp chất có thể được phân tích bằng GC và hơn 400 cột mao quản GC. Các lựa chọn ban đầu của cột và thiết bị hỗ trợ có ảnh hưởng sâu sắc đến khả năng và kết quả cuối cùng của việc tối ưu hóa phân tách. Thao tác các thông số của cột (pha tĩnh, đường kính trong, chiều dài và độ dày màng) cho phép máy sắc ký kiểm soát hiệu quả của cột, độ phân giải và tốc độ phân tích.
Trong sắc ký khí, thứ tự rửa giải của chất phân tích bị chi phối bởi một số yếu tố như áp suất hơi tiềm ẩn, khả năng hòa tan trong pha tĩnh và xu hướng tương tác phân tử trong pha tĩnh. Tất cả các hiệu ứng này thay đổi theo nhiệt độ và hiệu ứng phối hợp của chúng cuối cùng xác định sự phân bố cân bằng của các phân tử chất tan giữa pha động và pha tĩnh.
5.2.2 Lựa chọn khí mang
Việc xác định vận tốc tuyến tính trung bình tốt nhất khá dễ dàng và chỉ liên quan đến một lượng nhỏ thử và sai.
Helium cung cấp độ phân giải tương tự, nhưng ở thời gian phân tích lâu hơn. Khi sử dụng heli làm khí mang, hãy thử vận tốc tuyến tính trung bình ban đầu là 30 cm/giây.
Nitơ không được khuyến khích sử dụng với cột mao quản do thời gian phân tích quá dài.
Việc lựa chọn khí được sử dụng làm pha động trong sắc ký khí chịu ảnh hưởng của các yêu cầu và cân nhắc sau: Trơ, Khô, oxy tự do, an toàn, chi phí và tính sẵn có.
5.2.3 Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ lò cột
Cột được đặt trong tủ sấy và nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của quá trình tách sắc ký, là một yếu tố cực kỳ quan trọng được sử dụng để kiểm soát GC.
Trong nhiều trường hợp, đẳng nhiệt không phải là chế độ nhiệt độ hiệu quả nhất để tách mẫu; trong những trường hợp như vậy, chương trình nhiệt độ có thể được sử dụng. Hầu hết các chương trình nhiệt độ GC có nhiệt độ ban đầu, một đoạn đường nối (độ tăng mỗi phút) và nhiệt độ cuối cùng.
Sử dụng chương trình nhiệt độ tuyến tính làm điểm bắt đầu nếu thông tin phân tích trước đó không có sẵn để sử dụng làm hướng dẫn, bước phát triển chương trình