- Cần bổ sung một lượng thích hợp đệm EIA vào các giếng NSB.
- Cần thêm lượng thích hợp dung dịch tiêu chuẩn vào các giếng tiêu chuẩn; - Một lượng thích hợp của các giải pháp kiểm soát chất lượng liên quan phải được đặt trong các giếng đối chứng 1 (QC1) và QC2.
- Các giếng mẫu phải được bổ sung các chất pha loãng mẫu liên quan.
- Tất cả các giếng trừ giếng mù phải được bổ sung một lượng kháng thể sơ cấp. - Đĩa phải được phủ bằng parafilm và để ủ ở nhiệt độ phòng trong một thời gian.
- Tất cả các giếng phải được rửa trong máy rửa ELISA sử dụng một lượng đệm rửa thích hợp.
- Mẫu được lắc bằng máy lắc quỹ đạo (350 vòng/phút) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Rửa trong máy rửa ELISA với đệm rửa như được hướng dẫn trên danh mục. - Cần thêm một lượng nhất định peptit được đánh dấu biotin vào tất cả các giếng, ngoại trừ mẫu trắng.
- Đĩa phải được phủ bằng parafilm và để ủ ở nhiệt độ phòng trong một khoảng thời gian được nêu trên danh mục.
- Cần gỡ bỏ lớp parafilm trên đĩa và làm sạch chất chứa trong giếng.
- Rửa lại trong máy rửa ELISA sử dụng dung dịch đệm rửa, sau đó sẽ được loại bỏ.
- Dung dịch SA-HRP nên được thêm vào tất cả các giếng.
- Đĩa phải được phủ bằng parafilm một lần nữa và để ủ trong máy lắc quỹ đạo (350 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định.
- Sau khi loại bỏ parafilm trên đĩa, tất cả các giếng phải được rửa trong máy rửa ELISA sử dụng một lượng đệm rửa thích hợp.
- Dung dịch TMB nên được thêm vào tất cả các giếng, sau đó sẽ được ủ. Ở giai đoạn này, đĩa nên được che để tránh ánh sáng.
- Đĩa sẽ được phủ parafilm một lần nữa và ủ.
- Cần loại bỏ parafilm và thêm axit (HCl 2N) vào từng giếng để dừng phản ứng. Sau khi thêm dung dịch dừng, màu xanh lam sẽ bắt đầu chuyển sang màu vàng.