Bộ đệm có độ bền ion cao, Tris-borate (0,5 × TBE) hoặc Tris-acetate (1 × TAE) thường được sử dụng cho PFGE.
Tính linh động điện di của các phân tử DNA trong trường xung phụ thuộc mạnh mẽ vào nhiệt độ đệm. Nhiệt độ càng cao, tốc độ di chuyển phân tử càng cao.
PFGE thường được thực hiện ở 12–16°C. Ở nhiệt độ đệm cao hơn, các dải trở nên rộng và khuếch tán. Nó làm giảm đáng kể độ phân giải và sự xuất hiện của vết bẩn.
4.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp (Olive D. M., 1999)4.4.1 Ưu điểm 4.4.1 Ưu điểm
PFGE đã được chứng minh là vượt trội so với hầu hết các phương pháp khác để phân tích sinh hóa và phân tử. Nó có tính phân biệt cao và ưu việt hơn hầu hết các phương pháp phân tích Escherichia coli, enterococci kháng vancomycin, S. aureus,
loài Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa và M. avium.
PFGE hiệu quả hơn trong việc phân biệt các chủng S. aureus kháng methicillin so với các phương pháp khác được thử nghiệm.
PFGE cũng có tính phân biệt cao hơn so với PCR dựa trên trình tự yếu tố lặp lại (Rep-PCR) để phân biệt các chủng của Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii phức hợp, cầu khuẩn ruột kháng vancomycin, Neisseria gonorrhoeae và P. aeruginosa.
4.4.2 Nhược điểm
Một trong những yếu tố đã hạn chế việc sử dụng PFGE là thời gian hoàn thành phân tích. Mặc dù các bước thủ tục đơn giản nhưng thời gian cần thiết để hoàn thành thủ tục có thể từ 2 đến 3 ngày. Điều này có thể làm giảm khả năng phân tích số lượng lớn mẫu của phòng thí nghiệm.
CHƯƠNG 5: SẮC KÝ KHÍ 5.1 Nguyên tắc của sắc ký khí (Al-Bukhaiti W. Q., 2017)
Cơ sở của sự phân tách là sự chậm lại của các thành phần riêng lẻ khi chúng được di chuyển qua một cột dài bởi khí mang, thường là heli hoặc nitơ.
Cột bao gồm một ống thép hoặc thủy tinh chứa đầy vật liệu đóng gói trơ như thủy tinh hoặc hạt gốm.
Hình 5.1 Sơ đồ của hệ thống sắc ký khí
Trong sắc ký khí-lỏng (GLC), chúng được phủ một lớp chất lỏng dễ bay hơi, do đó diện tích bề mặt của chất lỏng tiếp xúc với khí là lớn.
Đối với một số ứng dụng, bao bì có thể là chất rắn mà không có bất kỳ lớp phủ chất lỏng nào được gọi là sắc ký khí-rắn (GSC), nhưng phương pháp này ít được sử dụng rộng rãi hơn GLC.
Mẫu được bơm vào dòng khí mang. Khi nó di chuyển qua cột với khí mang, các phân tử của mỗi chất có trong mẫu sẽ phân bố giữa chất khí và chất lỏng. Các phân tử riêng lẻ sẽ liên tục chuyển động giữa chất khí và chất lỏng ở trạng thái cân bằng động. Khi một phân tử ở trong pha khí, nó sẽ đi dọc theo cột, trong khi vẫn hòa tan trong chất lỏng, nó sẽ đứng yên. Một chất càng dễ bay hơi, thì tỷ lệ thời gian các phân tử của nó chuyển động trong khí mang càng lớn, và do đó, nó sẽ ra khỏi cột càng sớm. Bằng cách này, mỗi chất sẽ tách ra trong cột và tách ra theo thời gian ở cuối.
Thời gian từ khi tiêm đến khi peak hiện lên được gọi là thời gian lưu (Rt), và đặc trưng cho từng chất trong bất kỳ tập hợp điều kiện nhất định nào. Nó phụ thuộc vào độ bay hơi của chất, cũng như nhiệt độ của cột và chiều dài và đường kính của nó. Nhiều chất có thời gian lưu giữ lâu ở nhiệt độ phòng một cách bất tiện và điều này được khắc phục bằng cách nung cột trong lò.
Sau khi tách các thành phần trong cột để chúng nổi lên riêng lẻ, cần có một số phương pháp phát hiện và đo lường chúng. Hai loại detector thường được sử dụng: dẫn nhiệt và ion hóa ngọn lửa.
Máy dò độ dẫn nhiệt (TCD) dựa trên sự thay đổi độ dẫn nhiệt của khí rời khỏi cột. Khí mang helium tinh khiết đi qua một dây tóc vonfram-helium nóng, làm cho nó nguội đi, vì heli có độ dẫn nhiệt rất cao. Khi một chất hóa học xuất hiện cùng với khí
mang, quá trình làm mát sẽ ít hơn và nhiệt độ của dây tóc sẽ tăng lên. Như với hầu hết các kim loại, điện trở của nó tăng theo nhiệt độ và điều này có thể được đo và ghi lại.
Phát hiện ion hóa ngọn lửa (FID) thường gặp hơn trong các ứng dụng thực phẩm, vì nhiều hợp chất đang được khảo sát là hữu cơ (có chứa cacbon) và FID nhạy hơn khoảng một nghìn lần so với phát hiện độ dẫn nhiệt đối với các chất hữu cơ. Khí thoát ra khỏi cột được đốt cháy với hỗn hợp hydro và không khí. Điều này tạo thành các ion, dẫn một dòng điện có thể được khuếch đại và ghi lại trên một máy ghi biểu đồ. Mặc dù số lượng ion được tạo thành theo cách này là nhỏ, có lẽ chỉ bằng 0,0001% tổng số nguyên tử cacbon có trong mẫu, tỷ lệ được tạo ra luôn không đổi. Điều này có nghĩa là tổng tín hiệu được ghi trên bộ ghi biểu đồ tỷ lệ với lượng hóa chất hiện diện.
5.2 Chọn điều kiện chạy sắc ký (Al-Bukhaiti W. Q., 2017)5.2.1 Cột 5.2.1 Cột
Tất nhiên, cột là phần khởi đầu và trung tâm của một máy sắc ký. Cột được lựa chọn thích hợp có thể tạo ra sự phân tách sắc ký tốt để cung cấp phân tích chính xác và đáng tin cậy.
Cột được sử dụng không đúng cách thường có thể tạo ra sự phân tách khó hiểu, không đầy đủ và kém, có thể dẫn đến kết quả không hợp lệ hoặc phức tạp để diễn giải. Có hơn 10, 000 hợp chất có thể được phân tích bằng GC và hơn 400 cột mao quản GC. Các lựa chọn ban đầu của cột và thiết bị hỗ trợ có ảnh hưởng sâu sắc đến khả năng và kết quả cuối cùng của việc tối ưu hóa phân tách. Thao tác các thông số của cột (pha tĩnh, đường kính trong, chiều dài và độ dày màng) cho phép máy sắc ký kiểm soát hiệu quả của cột, độ phân giải và tốc độ phân tích.
Trong sắc ký khí, thứ tự rửa giải của chất phân tích bị chi phối bởi một số yếu tố như áp suất hơi tiềm ẩn, khả năng hòa tan trong pha tĩnh và xu hướng tương tác phân tử trong pha tĩnh. Tất cả các hiệu ứng này thay đổi theo nhiệt độ và hiệu ứng phối hợp của chúng cuối cùng xác định sự phân bố cân bằng của các phân tử chất tan giữa pha động và pha tĩnh.
5.2.2 Lựa chọn khí mang
Việc xác định vận tốc tuyến tính trung bình tốt nhất khá dễ dàng và chỉ liên quan đến một lượng nhỏ thử và sai.
Helium cung cấp độ phân giải tương tự, nhưng ở thời gian phân tích lâu hơn. Khi sử dụng heli làm khí mang, hãy thử vận tốc tuyến tính trung bình ban đầu là 30 cm/giây.
Nitơ không được khuyến khích sử dụng với cột mao quản do thời gian phân tích quá dài.
Việc lựa chọn khí được sử dụng làm pha động trong sắc ký khí chịu ảnh hưởng của các yêu cầu và cân nhắc sau: Trơ, Khô, oxy tự do, an toàn, chi phí và tính sẵn có.
5.2.3 Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ lò cột
Cột được đặt trong tủ sấy và nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của quá trình tách sắc ký, là một yếu tố cực kỳ quan trọng được sử dụng để kiểm soát GC.
Trong nhiều trường hợp, đẳng nhiệt không phải là chế độ nhiệt độ hiệu quả nhất để tách mẫu; trong những trường hợp như vậy, chương trình nhiệt độ có thể được sử dụng. Hầu hết các chương trình nhiệt độ GC có nhiệt độ ban đầu, một đoạn đường nối (độ tăng mỗi phút) và nhiệt độ cuối cùng.
Sử dụng chương trình nhiệt độ tuyến tính làm điểm bắt đầu nếu thông tin phân tích trước đó không có sẵn để sử dụng làm hướng dẫn, bước phát triển chương trình đầu tiên là thử một chương trình nhiệt độ tuyến tính, đơn giản.
Để cải thiện độ phân giải của các pic rửa giải sớm hơn, hãy giảm nhiệt độ ban đầu hoặc tăng thời gian giữ ban đầu. Giảm nhiệt độ ban đầu thường dẫn đến cải thiện độ phân giải lớn nhất, nhưng về cơ bản thời gian phân tích sẽ tăng lên. Độ phân giải của các peak rửa giải ở giữa sắc ký đồ có thể bị thay đổi bởi sự thay đổi tốc độ dốc. Nếu có độ phân giải đỉnh quá mức, tốc độ đường nối có thể được tăng lên để giảm độ phân giải và thời gian phân tích. Nếu không đủ độ phân giải, giảm tốc độ đường nối, nhưng tăng thời gian phân tích. Độ phân giải tốt hơn của các đỉnh rửa giải sau này thường xảy ra khi giảm tốc độ dốc.
5.2.4 Tối ưu hóa loại đầu tiêm, nhiệt độ và thể tích tiêm
Đưa mẫu vào hệ thống GC là một bước quan trọng trong quá trình phân tách. Độ tái lập của lượng mẫu được bơm vào là rất quan trọng để đảm bảo độ tái lập của kết quả.
Mẫu có thể được bơm thủ công vào hệ thống hoặc bằng cách sử dụng hệ thống lấy mẫu tự động. Một lỗi lớn trong GC là kỹ thuật tiêm kém.
Nhiệt độ kim phun để tách. Nhiệt độ của kim phun được sử dụng để hóa hơi nhanh chóng mẫu lỏng thành pha khí có thể đưa sang cột để tách.
Trong sắc ký khí mao quản và vi đóng gói (GC), có bốn kỹ thuật cơ bản để làm bay hơi một mẫu và chuyển nó vào đầu vào của cột phân tích: tiêm tách, không tách, trực tiếp và trên cột. Trong phương pháp này, tiêm tách và tiêm không tách lớp là những kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất.
Tiêm tách được chọn để phân tích mẫu có nồng độ cao. Trong chế độ tiêm phân chia, chỉ một phần nhỏ của mẫu hóa hơi được chuyển lên đầu cột. Phần còn lại của mẫu hóa hơi được đưa ra khỏi cổng tiêm qua đường thông hơi phân chia. Chỉ nên sử dụng cách tiêm phân chia khi nồng độ mẫu đủ cao để có thể loại bỏ một phần mẫu trong quá trình tiêm, trong khi vẫn duy trì đủ nồng độ chất phân tích tại máy dò để tạo ra dấu hiệu.
5.2.5 Lựa chọn pha tĩnh
Khi chọn cột, trước tiên hãy xác định đặc tính của mẫu để phù hợp với pha tĩnh của cột.
Pha tĩnh nói chung được chia thành 3 loại: thứ nhất không phân cực, thứ hai ở giữa cực và thứ ba có cực.
Pha tĩnh được phân loại thêm bằng Siloxan (không phân cực và trung cực) và Polyethylene glycol (PEG hoặc phân cực).
G1, G2 và G38 (100% Methyl Polysiloxan) không trải qua tương tác liên kết hydro. Sự thay đổi thứ tự rửa giải của Hexanol và Phenol với G14, G15, G16, G20, G39 và G47 (Polyetylen glycol) là sự kết hợp của tương tác liên kết lưỡng cực và liên kết hydro.
5.2.6 Tối ưu hóa đầu dò và nhiệt độ đầu dò
Nhiều loại đầu dò được bán trên thị trường để sử dụng với GC, mỗi loại có những hạn chế và ưu điểm riêng.
Đầu dò được sử dụng phổ biến nhất trong GC là đầu dò ion hóa ngọn lửa. Nhiệt độ của đầu dò và tốc độ dòng chảy tương đối của khí mang, hydro và không khí vào đầu dò là các thông số vận hành chính.
Một loạt các tiêu chuẩn được xác định để đánh giá các thông số của máy dò như độ trôi, độ ồn, độ nhạy, dải tuyến tính, dải động ... Sự thay đổi trong phản ứng của đầu dò với tốc độ dòng phụ thuộc vào việc đầu dò phụ thuộc vào nồng độ hay khối lượng.
Đối với các bộ tách sóng phụ thuộc nồng độ (ví dụ, bộ phát hiện độ dẫn nhiệt, bộ tách sóng ion hóa ảnh), việc giảm tốc độ dòng chảy không ảnh hưởng đến chiều cao peak, giá trị này gần như không đổi. Tuy nhiên, chiều rộng peak và diện tích peak tăng lên.
Ngược lại, đối với các hệ thống phát hiện dòng khối lượng (ví dụ, phát hiện ion hóa ngọn lửa, phát hiện trắc quang ngọn lửa, phát hiện phốt pho nitơ) thì phản ứng tỷ lệ nghịch với thời gian lưu.
5.3 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu (Al-Bukhaiti W. Q., 2017)
Sắc ký khí chủ yếu được sử dụng để phân tích các hợp chất dễ bay hơi bền nhiệt. Tuy nhiên, khi xử lý các mẫu không bay hơi, các phản ứng hóa học có thể được thực hiện trên mẫu để tăng độ bay hơi của các hợp chất.
Các hợp chất có chứa các nhóm chức như OH, NH, CO2H và SH rất khó phân tích bằng GC vì chúng không đủ bay hơi, có thể bị hút quá mạnh vào pha tĩnh hoặc không bền về nhiệt.
Hầu hết các phản ứng tạo dẫn xuất phổ biến được sử dụng cho GC có thể được chia thành ba loại:
- Silylation. - Acylation.
- Alkyl hóa & Este hóa.
Các mẫu được tạo dẫn xuất trước khi được phân tích để: - Tăng độ bay hơi và giảm độ phân cực của hợp chất - Giảm suy thoái nhiệt
- Tăng độ nhạy bằng cách kết hợp các nhóm chức năng dẫn đến tín hiệu dò cao hơn
- Cải thiện sự phân tách và giảm sự gắn đuôi.
5.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp (Al-Bukhaiti W. Q., 2017)5.4.1 Ưu điểm 5.4.1 Ưu điểm
- Độ phân giải tốt, thể hiện bằng các đỉnh sắc nét và đối xứng - Độ lặp lại cao và độ tái lập của thời gian lưu
- Độ chính xác cao và độ chính xác trong định lượng dựa trên các phép đo diện tích peak, tức là không có sự phân biệt các thành phần thông qua độ bay hơi, độ phân cực hoặc nồng độ.
5.4.2 Nhược điểm
- Chỉ phân tích những cấu tử nhẹ
- Môi trường mẫu phải có độ bay hơi kém hơn chất phân tích.
[1]. Al-Bukhaiti W. Q., Noman A., Qasim A. S., & Al-Farga A. (2017), Gas chromatography: Principles, advantages and applications in food analysis, International Journal of Agriculture Innovations and Research, 6(1), page 123-128. [2]. Aydin S. (2015), A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA, Peptides, 72, 4-15. DOI: https://doi.org/10.1016/j.peptides.2015.04.012.
[3]. Dey P. (2018), Polymerase Chain Reaction: Principle, Technique and Applications in Pathology, Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology, page 201 – 211. DOI: https://doi.org/10.1007/978-981-10-8252-8_20.
[4]. Karim Kadri (2019), Polymerase Chain Reaction (PCR): Principle and Applications, Synthetic Biology - New Interdisciplinary Science. DOI: 10.5772/intechopen.86491.
[5]. Meyer V.R. (2005), High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), Practical Methods in Cardiovascular Research, page 661 – 685. DOI: https://doi.org/10.1007/3- 540-26574-0_35.
[6]. Nassonova E. S. (2008), Pulsed field gel electrophoresis: theory, instruments and application, Cell and Tissue Biology, 2(6), 557.
[7]. Olive D. M., & Bean P. (1999), Principles and applications of methods for DNA- based typing of microbial organisms, Journal of clinical microbiology, 37(6), page 1661-1669. DOI: 10.1128/JCM.37.6.1661-1669.1999.
[8]. Sakamoto S., Putalun W., Vimolmangkang S., Phoolcharoen W., Shoyama Y., Tanaka H., & Morimoto S. (2018), Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites, Journal of natural medicines, 72(1), page 32-42. DOI: 10.1007/s11418-017-1144-z.