Các phương pháp phân tích chất lượng thực phẩm

Thông tin tài liệu

Phân tích và chất lượng thực phẩm dành cho sinh viên ngành quản lý chất lượng: Thực phẩm là sản phẩm có nguồn gốc từ động, thực vật mà con người dùng để ăn, uống cho nhu cầu sống, vận động và phát triến của cơ thể. Thực phẩm là loại sản phẩm phố biến nhất liên quan đến hoạt động sống của con người. Hầu hết các đồ ãn, đổ uống mà con người sử dụng đều có thể gọi là thực phẩm. Thực phẩm có những thuộc tính đặc Irưng về mặt lý học, hoá học, hoá lý, hoá sinh, sinh học và cảm quan. Hầu hết các đặc tính này có nguồn gốc từ nguyên liệu chế biến nhưng cũng có thể được bổ sung vào hay sinh ra hoặc bị nhiễm trong quá trình trổng trọt, chăn nuôi, chế biến. Ngoài ihành phần dinh dirỡng và một số thành phần đặc trưng của sản phẩm, các thành phần bổ sung với mục đích lạo cấu trúc và lính chất cảm quan, thì một số thành phần hóa học bị nhiễm vào thườiig là ỉdìông mong muốn. Vì vậy việc phân tích toàn diện các ihành phần hóa học và phụ gia llìực phẩm là rất quan trọng để đánh giá chất lượng một sản phẩm. Quá trình phân lích này được thực hiện nghiêm ngặt lừ khâu nguyên ỉiệu đến quá trình chế biến, bảo quản và phân phối sản phẩm tới lay người tiêu (lùng. Tất cả các Ihuộc tính lý, hoá, sinh của các thành phần thực phấm đều có thế do được, biểu diễn đirợc dưới dạng các thông số cụ thế. Việc phân tích, đo đạc và định lượng các ihành phần hóa học thực phấm ngày càng được chú trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm hoặc nghiên cứu và tạo sản phẩm mới. Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, các phương pháp phân lích ngày càng phát triển hơn, hiện đại hơn và có độ chính xác cao hơn, góp phần đắc lực cho việc kiểm tra chất lượiig và quản lý sản xuất.

HÀ DUY ÊN T ư (Chủ bién) Phân tích Hóa học thực phẩm NFỈÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT HÀ NÔI - 2009 M Ụ C LỤC LỜI NÓI Đ ÀU ........................................................................................................................ 3 CHƯƠNG 1. G IỚ I TH IỆU .......................................................................................... 11 1.1. MỘT SÔ THÀNH PHÀN HÓA HỌC THựC PHÂM ................................................. 12 1.1.1 NUÓC............................................................................................................................... 12 1.1.2. THÀNH PHÂN DINH DƯỠNG CỦA THựC PH Á M ............................................... 12 1.1.3. CÁC THÀNH PHÀN HÓA HỌC KH Á C ................................................................... 14 1. 1.4. MỘT SỐ THÀNH PHÂN GÂY NGỘ Đ ộ c ............................................................... 16 1.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHÂN HÓA HỌC THựC PH ẨM ........................................... 18 1.2.1. LÁY MÃU VÀ BẢO QUẢN M Ẫ U ............................................................................ 18 1.2.2. XỬ LÝ M Ã U ............................................................................................................... 19 1.2.3. LỰA CHỌN KỸ THUẬT PHÂN T ÍC H .....................................................................20 1.2.4. ÁP DỤNG CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍC H ...............................................................20 1.2.5. XỬ LÝ SÓ LIỆU.........................................................................................................24 CHƯƠNG 2. NƯ ỚC ............................................................................................................................ 26 2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ HÀM LUỢNG N ước, HOẠT Độ N ư ớc, ĐƯỜNG ĐẢNG NHIỆT HẤP T H Ụ ......................................... ................. ..................................................26 2.2. Sự CÀN THỈÊT PHẢI XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG N ư ớ c .........................................29 2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG N ư ớ c VÀ HOẠT Đ ộ N ư ớ c TRONG T H Ụ t PHẮM.................................'............ '........................................... ...................... 30 2.3.1. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG N ư ớ c TU Y Ệ T Đ Ó I ........................................30 2.3.2.PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT Đ ộ N ư ớ c CỦA THựC PHÁM .................... 33 2.4. XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG ĐẢNG NHIỆT HẤP THỤ VÀ PHẢN HÁP T H Ụ .................... 35 CHƯƠNG 3. PRO TEIN................................................................................................39 3.1. ĐẠI CƯƠNG VÈ NGHIÊN c ử u CÁU TRÚC PHÂN TỬ PROTEIN........................ 39 3.2. MỘT SỐ TÍNH CHẢT QUAN TRỌNG CỦA PROTEIN.............................................40 3.2.1. KHÓI LƯỢNG VÀ HÌNH DẠNG PHÂN TỬPROTEIN.......................................... 41 3.2.2. TÍNH CHÁT LƯỠNG TÍNH CỦA AXIT AMIN VÀ PROTEIN............................ 44 3.2.3. TÍNH CHÁT DUNG DỊCH KEO PROTEIN, s ự KÉT TỦA PROTEIN.................. 46 3.2.4. KHẢ NĂNG HẨP THỰ TIA TỬNGOẠI CỦA DUNG DỊCH PROTEIN............... 48 3.2.5. CÁC PHẢN ÚÌ^ỈG THƯỜNG DÙNG DỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN VÀ PROTEIN................................................................... 1...’....................................... „49 3.3.THỤ’C HÀNH................................................................................................................53 CHƯƠNG 4. ENZIM ..................................................................................................................... 64 4.1. GIỚI TH iỆU ..................................................................................................................64 4.2. MỘT SÓ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT L ự c E N Z iM ................................... 67 4.2.1. PHƯƠNG PHÁP ĐO Đ ộ NHỚT.............................................................................. 67 4.2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN c ự c KÊ............................................................................ 67 4.2.3. PHƯƠNG PHÁP ÁP KÊ........................................................................................... 67 4.2.4. PHƯƠNG PHÁP PHỔ QUANG KÊ..........................................................................68 4.2.5. PHƯƠNG PHÁP CHUÂN Đ ộ LIÊN T Ụ C ...............................................................68 4.2.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC K Ý ........................................................................................ 68 4.2.7. PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC.................................................................................... 69 4.2.8. NHŨÌîG ĐIỀU L ư u Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT Đ ộ E N Z IM ................................. 71 4.2.9. CHUÂN BỊ DUNG DỊCH ENZIM ĐẺ XÁC ĐỊNH HOẠT Đ ộ x ú c TÁC.............72 4.3.THỤ'C HÀNH................................................................................................................72 4.3.1. ENZIM PROTEOLITIC............................................................................................ 73 4.3.2. KIỂM TRA HOẠT ĐỘ CỦA CÁC CHÊ PHÂM ENZIM A M ILA 2A TRONG CÔNG NGHIỆP........ ;........^................................................................................................80 4.3.3. XÁC ĐỊNH HOẠT L ự c ENZIM XENLULAZA.................................................. 94 4.3.4. ENZIM C A T A L A Z A .................................................................................................98 4.3.5. ENZIM PEROXIDAZA............................................................................................ 99 4.3.6. ENZIM L IP A Z A ...................................................................................................... 102 4.3.7 XÁC ĐỊNH HOẠT L ự c ENZ1M TRONG NÂM MEN BÁNH M Ì ........................ 105 CHƯƠNG 5. G L U X IT ..................................................................................................................... 111 5.1. ĐỊNH LƯỢNG GLUXIT BẤNG PHƯƠNG PHÁP s o M À U ....................................111 5.1.1. N G U Y Ê N T Ấ C s o M À U ........................................................................................................... 111 5.1.2. XÁC ĐỊNH CÁC HEXOZA BẢNG PHƯƠNG PHÁP s o M À U ................................. 115 5.2. XÁC ĐỊNH BẤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN c ự c ..................................................117 5.2.1. NGUYÊN T Ấ C ........................................................................................................ 117 5.2.2. THỰC H ÀN H ........................................................................................................... 119 5.3. PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC.......................................................................................125 5.3.1. CHUÂN BỊ NGUYÊN LIỆU TRƯỚC KHI PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ĐƯỜNG. ................................................................................................................ .. ....... ... 125 5.3.2. T H Ụ t HÀNH............................................................................................................125 5.4. ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG GLUXIT BẢNG PHƯƠNG PHÁP SẮC K Ý ........ 137 5.4.1. SẮC KÝ TRÊN G IÂ Y ..............................................................................................137 5.4.2. SẮC KÝ LỚP MỎNG............................................................................................... 141 5.4.3. SẮC KÝ CỘT............................................................................................................ 141 5.4.4. SẨC KÝ CHẮT LỎNG ÁP L ự c CAO (H P L C )..............................................................142 5.4.5. SẤC KÝ K H Ì.............................................................................................................142 5.5. XÁC ĐỊNH GLUXIT BẰNG PHƯƠNG PHÁP E N Z IM .......................................... 143 5.5.1. ĐỊNH LƯỢNG CÁC O ZA........................................................................................143 CHƯƠNG 6. LIPIT ........................................................................................................................149 6.1. GIỚI THIỆU...............................................................................................................149 6.1.1. THÀNH PHẦN VÀ TÍNH CHẨT CỦA DÂU M Ỡ ..................................................150 6 .1.2. CÔNG NGHỆ SÀN XUÁT DẢU THựC V Ậ T ........................................................ 153 6.1.3. KIẺM TRA CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT DÀU THựC V Ậ T ................................... 155 6.2. PHẦN T H ự C H À N H ................................................................................................ 160 6.2.1. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẮT BÉO..................................................................160 6.2.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHÀN CHẤT BÉO................................................................ 164 6.2.3. XÁC ĐỊNH CHẨT LƯỢNG CHẤT BÉO................................................................177 6.3. KIÉM TRA CHÁT LƯỢNG DẢU BÉO SAU QUÁ TRÌNH CÔNG NGHỆ........... 183 CHƯƠNG 7. CHẤT THƠM .................................................................................................... 187 7.1.G1Ớ1 THIỆU................................................................................................................ 187 7.2. NHŨÌMG PHƯƠNG PHÁP CHIÊT CHẤT THƠM..............................................188 7.2.1. PHƯƠNG PHÁP KHÔNG GIAN ĐÀU (PHƯƠNG PHÁP HEAD-SPACE)..........188 7.2.2 PHƯƠNG PHÁP CHIÉT NHŨ^NG CHÁT BAY HƠI TRONG DUNG DỊCH BẰNG CHU>JG CÁT..................................................................................................... ' ............ 190 7.2.3 PHƯƠNG PHÁP TRÍCH L Y .....................................................................................192 7.2.4. PHƯƠNG PHÁP LlKENS - NICKERSON..............................................................195 7.2.5. CÔ Đ Ặ C ................................................................................................................... 196 8 7.2.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN ĐOẠN VÀ NHẬN BIÉT.................................................197 7.3. PHẦN THỰC H À N H ................................................................................................. 199 CHƯƠNG 8. VITAMIN ..........................................................................................................205 8.1.GIƠ1 THIỆU............................................................................................................... 205 8.2. CAROTEN VÀ VITAM IN A ............................................................................ 206 8.3. N H Ó M V I T A M IN c , BI VÀ B 2 ................................................................................................211 CHƯƠNG 9. A L CAL OI T VÀ PHENOL 9.1. 222 CÁC CHÁT A L C A L O IT ........................................................................................222 9.1.2. NGUYÊN TẮC VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIÊT ALCALOIT TÙ' THựC V Ậ T ................................................................................................................................... 223 9.1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ALC ALO IT............................................. 224 9.1.4. PHÀN THỰC H À N H ..............................................................................................226 9.2. HỢP CHẤT PHENOL THựC V Ậ T ....................................................................... 232 9.2.1. VAI TRÒ VÀ Ý NGHĨA CÙA HỢP CHÂT PHENOL THựC V Ặ T ..................... 232 9.2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT PHENOL.................. 232 9.2.3. PHÀN THỰC H À N H ..............................................................................................233 CHƯƠNG 10. MỘT SỐ CHẤT v ô c ơ GÂY ĐỘC ....................................................241 10.1. U lố l THÌỆU..............................................................................................................241 10.2. THỰC H À N H ...........................................................................................................................245 10.3. XÁC ĐỊNH KIM LOẠI NẶNG BÀNG PHƯƠNG PHÁP c ự c PHÓ................... 264 10.3.1. KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP c ự c PHỔ..................................................... 264 10.3.2. NGUYÊN T Ắ C ....................................................................................................................264 10.3.3. CÁCH TIÊN HÀNH..............................................................................................265 10.3.4. CHUÂN BỊ DUNG DỊCH XÁC ĐỊNH................................................................. 266 CHƯƠNG 11. T ỔN D ư VÀ NHIÊM TẠP ĐỘC T ố ....................................................... 271 11.1.GIỔl TH IỆU ..............................................................................................................271 11.2. D ư LƯỢNG THUÓC BẢO VỆ THựC VẬT...................................................271 11.2.1. GIỚI TH IỆ U ...........................................................................................................271 11.2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍC H ............................................................................. 272 11.2.3. THỰC H ÀN H........................................................................................................ 275 11.3. CHÁT KÍCH THÍCH TÃNG TRƯỜNG................................................................ 277 11.3.1. GIỚI TH IỆU........................................................................................................... 277 11.3.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN T ÍC H .............................................................................. 277 11.3.3. THỰC HÀNH......................................................................................................... 277 11.4. CHẤT KHÁNG SINH...............................................................................................279 11.4.1. G iớ i TH IỆU...........................................................................................................279 11.4.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN T ÍC H ..............................................................................280 11.4.3. THỰC HÀNH......................................................................................................... 282 11.5. CHẤT DIỆT KH U ÂN ............................................................................................... 285 11.5.1. GIỚI TH IỆU ................................................................................................ ' ....... 285 11.5.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN T ÍC H .............................................................................. 285 11.5.3. THỰC HÀNH......................................................................................................... 288 11.6. ĐỘC TÓ VI N Á M ..................................................................................................... 293 11.6.1. GIỚI TH IỆU ........................................................................................................... 293 11.6.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN T ÍC H .............................................................................. 293 11.6.3. THỰC HÀNH......................................................................................................... 297 11.7. MỘT SÓ THÀNH PHÂN K H Á C ..............................................................................301 11.7.1. GIÓI TH IỆU........................................................................................................... 301 11.7.2. CHÁT 3-MCPD VÀ M E LA M IN ........................................................................... 302 11.7.3. NITRIT, NITRAT VÀ SO2.....................................................................................302 11.7.4. THỰC HÀNH.........................................................................................................306 TÀI LIỆU T HA M KHẢO 10 .........................................................................................................321 Chươỉìg 1 GIỚI THIỆU Thực phẩm là sản phẩm có nguồn gốc từ động, thực vật mà con người dùng để ăn, uống cho nhu cầu sống, vận động và phát triến của cơ thể. Thực phẩm là loại sản phẩm phố biến nhất liên quan đến hoạt động sống của con người. Hầu hết các đồ ãn, đổ uống mà con người sử dụng đều có thể gọi là thực phẩm. Thực phẩm có những thuộc tính đặc Irưng về mặt lý học, hoá học, hoá lý, hoá sinh, sinh học và cảm quan. Hầu hết các đặc tính này có nguồn gốc từ nguyên liệu chế biến nhưng cũng có thể được bổ sung vào hay sinh ra hoặc bị nhiễm trong quá trình trổng trọt, chăn nuôi, chế biến. Ngoài ihành phần dinh dirỡng và một số thành phần đặc trưng của sản phẩm, các thành phần bổ sung với mục đích lạo cấu trúc và lính chất cảm quan, thì một số thành phần hóa học bị nhiễm vào thườiig là ỉdìông mong muốn. V ì vậy việc phân tích toàn diện các ihành phần hóa học và phụ gia llìực phẩm là rất quan trọng để đánh giá chất lượng một sản phẩm. Quá trình phân lích này được thực hiện nghiêm ngặt lừ khâu nguyên ỉiệu đến quá trình chế biến, bảo quản và phân phối sản phẩm tới lay người tiêu (lùng. Tất cả các Ihuộc tính lý, hoá, sinh của các thành phần thực phấm đều có thế do được, biểu diễn đirợc dưới dạng các thông số cụ thế. Việc phân tích, đo đạc và định lượng các ihành phần hóa học thực phấm ngày càng được chú trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm hoặc nghiên cứu và tạo sản phẩm mới. Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, các phương pháp phân lích ngày càng phát triển hơn, hiện đại hơn và có độ chính xác cao hơn, góp phần đắc lực cho việc kiểm tra chất lượiig và quản lý sản xuất. 11 1.1. MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THỰC PHẨM Trong khuôn khổ cùa cuốn giáo trình này, chúng tôi giới thiệu các phương pháp phân tích thôiig dụng để phân tích một sô' thành phần hóa học trong thực phẩm. 1.1.1 NƯỚC Nước là thành phần quan trọng trong lioạt động sống của lế bào động và thực vật. K hi đã được sơ chế hoặc chế biến thành sản phẩm thực phấm. tùy loại thực phẩm mà hàm lượng nước rất khác nhau. Ngũ cốc từ 10 - 20%, th ịt từ 60 - 70%, rau quả từ 80 - 95%. Nước không cung cấp năng lượng nhưng giữ vai trò ổn định hàm lượng nước, ổn định cấu trúc đặc trưng của sản phẩm. Trong thirc phẩm nước ở dạng liên kết và dạng tự do. Nước tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển và làm hỏng thực phẩm vì vậy xác định hàm lượng và hoạt độ của nước trong thực phẩm là rất quan trọng. 1.1.2. THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CỦA THựC PHẨM Thành phẩn dinh dưỡng trong thực phẩm là các chất trực tiếp tham gia vào sự sinh trường, phát triển của cơ thế’ và sinh năng lượng trong quá trình tiêu hóa. Con người tồn tại và phát triển nhờ các chất dinh dưỡng. Các chất dinh dưỡng bao gồm: • Protein Protein là thành phần chính cùa thực phẩm nguồn gốc động vật như thịt, cá, trứng và mộl số thực vật như các loại đậu. l ’heo mức tiêu thụ thực phẩm thông thường, prolein cung cấp khoảng 10-15% năng lượng. Năng lượng do Ig protein cung cấp khoảng 4,0 kcal. về cấu tạo, protein là các polime phân tử lớn chủ yếu bao gồm các axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit. K hối lượng phân tử của Protein khoảng từ hơn mười nghìn đến hàng trăm nghìn dalton hoặc lớn hơn nữa. Các phân tử này có dạng hình cầu hoặc dạng hình sợi. Hai dạng phân tử này có một số tính chất khác nhau, trong đó dạng hình cầu tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, rất hoạt động về mặt hoá học, hầu hết nhóm này có hoạt tính xúc tác hoạt tính enzim. M ỗi enzim có khả năng xúc tác cho một số phản ứng nhất định. 12 Hoạt động xúc tác cùa enzim được tính thông qua tốc độ chuyên hoá của cơ chất hoặc tốc độ tích tụ sản phẩm tạo thành. Bàng 1.2a cho hàm lượng protein trong một số loại thực phẩm. Báng 1.2a. Hàm lượng protein trong một số thực phẩm Nhóm thịt, cá, sữa Hàm lượng (%; 21 20 1 8 -2 2 22 19,8 1 7 -2 0 1 3 -1 4 ,8 3 ,5 - 3 ,9 Thịt bò Thịt gà Thịt lợn Gan bò Gan lợn Cá Trứng Sữa bò • Nhóm đậu, lương thực Hàm lượng (%) 36,8 24,3 Đậu tương Lạc Đậu xanh Đậu Hà Lan Bột mì Ngô Gạo nếp Gao tẻ 22 21,6 7 ,8 -8 8 .0 - 10 8,2 7.6 G luxit G lu xit là một trong những thành phần chính trong thực phẩm nguồn gốc thực vật, thường tồn tại ở dạng monosacarit và polysacarit. G luxit chiếm tới 80-88% chất khô và là thành phần dinh dưỡng quan trọng và chủ yếu trong khẩu phần ăn. G luxit cung cấp khoảng 65-70% năng lượng trong khấu phần ăn thông thường, nảng lượng cung cấp từ Ig là 4 kcal. G luxit được cấu tạo từ các nguyên tử c, H, o. Các monosacaril (đường đơn) dễ tan trong nước, có vị ngọl. Bảng 1.2b cho hàm lượng g lu xit trong một số thực phẩm quan trọng. Bảng 1.2b. Hàm lượng gluxit tổng số trong một số thực phẩm Nhóm lương thực 74,9 76,2 70,0 36,4 28,5 Gạo nếp Gạo tẻ Ngô Sắn tươi Khoai lang • Hàm lượng (%) Nhóm đậu, quả Đậu Hà Lan Đậu côve Đậu xanh Chuối tiêu Gấc Hàm lượng (%) 50,0 45,0 35,6 22,4 10,5 L ip it L ip it hay còn gọi là chất béo là thành phần chính của mỡ động vật, dầu thực vật và có nhiều trong m ộl số thực phẩm nlur thịt, trứng, sữa, phomat. L ip it là thành 13 phần có giá trị dinh dưỡng cao vì là thức ăn giàu năng lượng, năng lượng cung cấp bởi một đơn vị khối lượng chất béo lớn gần gấp 2 lần m ộl đơn vị khối lượng tương đương cỉia g liix it và protein. Ig lip it có thể cung cấp 9 kcal trong khi Ig protein hoặc Ig g luxit chi cho 4 kcal. về cấu trúc hóa học lip it là hỗn hợp các ester của của glycerin và các axit béo. Hàm lượng lip it trong một số thực phẩm cho trong bảng 1 .2 c. Bảng 1.2c. Hàm lượng lipit trong một số thực phẩm Thịt, cá, sữa Thịt lợn Trứng gà Thịt gà Sữa bò tươi Thịt bò Gan lợn Cá chép Hàm lương % 21.5 11.6 7.5 4,4 3.8 3.6 3.6 Hat dầu và đâu Hướng dương Cùi dừa Lạc nhân Đậu tương Đậu côve Đậu Hà Lan Đàu xanh Hàm lương % 6 4 ,3 -6 6 ,5 6 2 ,9 -7 4 ,0 4 0 ,2 -6 0 ,7 23,5 1,7 1,3 1,0 1.1.3. CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC KHÁC • Chất thơm Chấl thơm là một tổ hợp các chất hóa học có trong sản phẩm thực phẩm, khi bay hơi thì làm cho khứu giác cảm nhận được mùi. Các chất hóa học đó bao gồm các hợp chất amin, các hợp chất dị vòng, cacbuahydro, tecpen, rượu, aldehyt, xeton. Những chất thơm đóng vai trò chủ yếu trong đánh giá chất lượng cảm quan thực phẩm, chúng có nguồn gốc từ nguyên liệu hoặc sinh ra trong quá trình chế biến thực phám và cho phép xác định mùi đặc trưng của sản phẩm. • Vitam in Vitam in là một nhóm chất hữu cơ có phân tử tương đối nhỏ, rất cần cho cơ thể sống và sinh trưởng ở liều lượng rất nhỏ. Trong cơ thể, vitam in đóng vai trò như những chất xúc tác sinh học. Đặc trưng cùa vitam in là không thể thay thế lần nhau và năng lượng cung cấp bởi vitam in hầu như không đáng kể. Các vitannin có cấu trúc và tính chất rất khác nhau. Người ta phân vitam in thành hai nhóm, nhóm tan trong nước và nhóm tan trong chất béo. Vitam in có nhiều trong các loại thịt, cá, trứng, sữa, lương thực, rau và hoa quả. Hàm lượng một sô' vitam in trong thực phẩm cho trong bảng 1.3. 14 Báng 1.3. Hàm lượng vitamin trong một số thực phẩm Thực phẩm Thịt lợn Gan lợn Gan vịt Trứng gà Gạo tẻ Gạo nếp Cà chua Cải sen Đậu xanh Hành lá Cam Đu đủ chín • Caroten 0 2,00 0,30 0,06 6,00 0,30 1,5 Hàm lương vitamin (mg%) B. B. 0,01 0,53 0,16 6,0 0,4 2,11 2,96 0.44 1,28 0,16 0,31 0,70 0 0,12 0,04 0 J4 0,06 0,06 0,04 0,05 0,10 0,72 0,15 0,03 0,10 0,08 0,03 0,02 0,02 pp 2,7 16,2 9,1 0,2 1,9 2,4 0,5 0,8 24 1,0 0,2 1 18 7 0 40 51 4 60 40 54 A lca lo it và phenol Hợp chất alcaloit và phenol là các chất kích thích có nhiều trong chè, cà phê, cacao, côca và thuốc lá. Tính chất đặc trưng cúa hai nhóm chất này là tính kích thích hệ thần kinh trung ưcoig, ảnh hưởng đến hoạt động của hệ tuần hoàn và hệ hô hấp. - Trong phân tử của hợp chất alcaloit có nhân dị vòng, có chứa nitơ và có mùi, vị đặc trưng. K h i dùng thực pliấm có chứa alcaloit, hệ thần kinh bị kích thích mạnh, tăng cường hoạt động cỉia tim, của các cơ bắp và lăng cường sự hô hấp. - Phenol thực vật là một nhóm hợp chất hữu cơ có màu sắc, m ùi, vị đặc trưiig cho sản phẩm. V ị đắng của hợp chất phenol trong một số sản phẩm có tác dụng nâng cao giá trị cho sản phẩm. Trong quá trình chế biến hợp chất phenol biến đổi tạo màu đặc trưng cho một sổ sản phẩm. • Chất khoáng Trong thực phẩm, chất khoáng có hàm lượng không lớn nhưng có vai Irò quan trọng tham gia vào thành phần cấu tạo của một số chất hữu cơ. Trong sô' nhiều chất khoáng có thể kể đến một số cliất sau: 15 - Natri là một nguyên tố quan trọng trong xây dựiig cơ thế và chuyển hoá nhưng hầu hết thực phấm tiêu thụ ở dạng tự nhiên đều chứa rất ít natri (bột, quả, rau, thịt, cá). Những thực phám đã qua chế biến lại chứa rất nhiều natri vì được bố sung muối ăn vào trong quá trình chế biến như bánh m ỳ, phomat, giăm bông. - K ali có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm. Thực phẩm chứa nhiều Na và K là bánh mì, thịt, sữa, khoai tây, cà chua. - M a n g ie có nh iề u trong thực p h ẩ m Iiguồn g ố c thực vật n h ư cacao, ngũ cốc. - Canxi là chất khoáng có tỷ lệ cao nhất trong cơ thể. Ngoài các chất vô cơ ở mức đa lượng trên đây trong thực phấm còn chứa một số chất vô cơ ở mức vi lượng nhimg rất cần thiết cho hoạt động của cơ thể. Các chất này giúp cho cơ thế có sức khoẻ tốt. Trong khẩu phần thức ăn hàng ngày thường chứa đù nhóm chất vi lượng. Trong sô' những chất vi lượng quan trọng có thể kể đến kẽm, đồng, mangan, molipden, iod, flo, kể cả asen, bor và vanadi... 1.1.4. MỘT SỐ THÀNH PHẦN GÃY NGỘ ĐỘC THựC PHẨM Ngoài những thành phần hóa học cơ bản nêu trên tham gia vào việc cấu thành nên cấu trúc và đặc trưng của từng loại thực phám, còn có những thành phần khác không tham gia cấu thành đặc trưng của thực phẩm. Những thành phần này được tích lũy trong quá trình trồng trọt, chăn nuôi, chế biến, bổ sung và bảo quản, có khả năng gây độc hại cho con người còn có tồn dư trong sản phẩm trước khi tiêu thụ. Các thành phần dó là: • Chất vô cơ gây độc M ột sô' chất sau đây có trong thực phẩm có thể gây độc cho cơ thể, đó là các kim loại nặng như; đồng, chì, kẽm, thiếc, các hợp chất chứa asen, các hợp chất chứa flo ... Nguồn gốc của các chất này có thể do nhiễm tạp từ nguyên liệu khi trổng trọt, chăn nuôi, do bao bì bảo quản hoặc các thiết bị sản xuất nhiễm vào thực phẩm. Khi ăn phải các sản phấm chứa chất độc sẽ có triệu chứng nôn mửa, nhức đầu, rối loạn liêu hoá có thể dẫn đến tử vong. 16 • Độc lố tự nhiên lYong thức ăn tự nhiên vốn có các chất gây bệnh mạnh hoặc kinh niên. Mạc dù người la dán dan đã biết loại irừ những thức ãn có hại. Điểu (ló là do sự tiêu íhụ với sớ lượng lớn và khồng chọn lọc. Ví dụ khoai làv vốn có nhiéu salanin lạp Iriiii” ớ \'ỏ củ (cM iig-sê-gây-ta-etóng nliiíc-dáu, tiêu chảy,-aúa là sòì, rối loạn thán kinh hôn mè và đờ đản). Có một vài loại thức ăn mang đến nậi loạn, hôii mê như cà độc dược hoặc m ộl sô' loài cá độc. Bảng l A cho ví dụ về các ihực phám có nguy^cơgây độc. ; I B áng 1.4. Một số ioại độc tố tự nhiên trong thực phẩm Thực phẩm Độc tố Thực phẩm Độc tố 1 Cây họ cải Thiocyanat Sắn Cyanit [ Bắp cải Glucosilonat Chuối HemaggỊutinin Khoai tây xanh Solanin Các loại rau khác HydroxỊáryptamin Đâu tằm Vicin • catécholBnin Thuốc trừ sâu và kháng sinh j f l ồện nay lượng thuốc trìr sâu, diệt cỏ, diệt côn trùng dùng irong năng nghiệp rất lớn. Mặc dù đã thực hiện những quy trình đảm bảo an toàn trong caiệh tác nông nghiệp ohưng ch ỉ có thể giảm thiểu lượng tồn dir trong sản phẩm Iih^ng đôi khi lượng tổn dư này vẫn ở mức cao hơn cho phép. Vì vậy phải thường xuyOn kiểm tra để kiểmfS0 át nghiêm ngặt lượng tồn dư ihuốc trừ sâu, diệt cỏ này. 'I rong chãn nuôi gia súc, gia cầm và nuôi thà thủy sản, việc s ử iụ n g kháng sinh trị bệnh cho vật nuôi là không thể tránh khỏi. Nhimg việc sử dụng không phù hợp, để lại lượng tồn dư lớn kháng sinh sẽ gây ra nlũmg nguy cơ tạo ệi các mầm bệnh ở agười. Ngoài ra lượng kháng sinh tồn dư trong nguyên liệu cònịánli hưởng clến một sô' quá trình chế biến tiếp theo. V'i vậy xác dịnh lượng tổn dư iTÌ iy cũng rất cđii tliiê ị • Thoốc k íd i thích tăng trưởng 'rhuốc kích thích tâng trường đang được sử dụng khá phổ biến thông qua việc trộn vào thức ăn chăn nuôi đế làm tăng trọng cho vật nuôi nhanh chóng. Khi dùng thuốc tàng trọng, vật nuôi chóng lớn, nhanh đưa vào giết, mổ và chế biến nên thuốc 17 tăng trưởng chưa kịp phân hủy, lượng tồn dư tuy rất nhỏ nhưng cũng sẽ ảnh hưởng rất lớn tới sức khỏe khi liêu dùng. • Độc tô' sinh học Các độc tố sinh học do nhiễm khuẩn, nhiễm virut, nhiễm nấm trong ihực phẩm gây ra những hậu quả khôn lường cho người tiêu dùng. Do vậy việc phân tích và kiểm soát các thành phần độc tố này cũng là một trong những nhiệm vụ quan trọng của công tác đảm bảo chất lượng và vệ sinh an toàn cho sản phẩm thực phẩm. • Các loại độc tố khác Các độc tô' trong thực phẩm còn có nguyên nhân từ phụ gia như phụ gia tạo màu, tạo vị, các chất bảo quản, các chất tẩy trắng, tẩy rửa, diệt khuẩn, đặc biệt là các chất sinh ra trong quá trình chế biến hoặc các chất bổ sung để cải thiện một tính chất nào đó nhưng lại có tính độc (như 3-MCPD, melamin). 1.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC THỰC PHẨM Lấy mẫu và lựa chọn quy trình phân tích là quan trọng nhất trong phân tích thực phẩm. Quy trình phân tích thường được tiến hành như sau: lấy mẫu (thu thập, bảo quản), xử lý mẫu (chiết, làm giàu, tách và làm sạch), phân tích định tính và/hoặc định lượng (sử dụng các kỹ thuật khác nhau như sắc ký, phổ). 1.2.1. LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU Bước đầu tiên trong phân tích thực phẩm là lấy mẫu. Mẫu được lấy ngẫu nhiên hoặc theo hệ thống sao cho mẫu mang lính đại diện, không bị nhiễm bẩn và được xử lý hợp lý nhằm Ihu được kết quả phàn tích ý nghĩa. Đối với mỗi loại sản phẩm tùy thuộc vào đặc tính riêng biệt mà có các quy định cho việc lấy mẫu khác nhau. Lấy mẫu nói chung thường nhằm các mục đích sau; Kiểm tra quá trình sản xuất Kiểm tra nghiệm thu Xác định đặc trưng của lô 18 Để tiến hành các phép thừ Đánh giá thị trường Trong các phân tích với mục đích quản lý chất lượiig thực phẩm, phương pháp lấy mẫu đúng yêu cầu có kế hoạch cụ thể về địa điểm lấy mẫu, vị trí lấy mẫu và các kỹ thuật lấy mẫu phù hợp với tính chất của sản phẩm. Địa điểm lấy mẫu: lấy mẫu tại nơi bảo quản, bốc dỡ hay vận chuyển, tại từng điểm (hoặc sau lừiig thiết bị) trong quá trình sản xuất, tại các điểm nhập nguyên liệu và xuất thành phẩm. Kiểm tra sơ bộ lô sản phẩm: kiểm tra sơ bộ tính đồng nhất của lô hàng. V ị trí lấy mẫu: lấy ngẫu nhiên nhưng cần làm sạch để sản phẩm lấy ra không bị dây bẩn. Dụng cụ lấy mẫu: đối với các loại sản phẩm khác nhau, hình dáng của các loại dụng cụ lấy mẫu cũng khác nhau và dựa vào các liêu chuẩn phù hợp cho từng loại sản phẩm riêng biệt. Các dạng lấy mẫu: tùy theo loại mặt hàng mà quy định lấy mẫu sao cho phù hợp, dễ đại diện, dễ phân tích như mảu là chất rắn, chấí lỏng hoặc chấl khí. Mẫu không phân lích ngay cần được bảo quản để tránh phân hủy trong điều kiện nhiệl độ, độ ẩm, oxy và ánh sáng thích hợp. M ột cách bảo quản đơn giản là mẫu được đựng trong hộp kín và giữ trong tủ lạnh. Dụng cụ chứa mẫu phải khô, tiệt trùng và không dễ vỡ. 1.2.2. XỬ LÝ MẪU Mẫu thực phẩm thường được chiết, tách hoặc cô đạc trước khi phân tích. Vì mẫu Ihực phẩm có thành phần phức tạp, chứa rất nhiều chất khác nhau và không đồng nhất. Mặt khác, hàm lượng chất phân tích đôi khi quá thấp hoặc không phù hợp với phân tích trực tiếp nên phải loại bỏ các thành phần có khả nàng ảnh hưởng tới kết quả. V ì vậy, mẫu cần phải phân lập, tách và làm giàu các hợp phần mẫu cần 19 phân lích. Cần lưu ý tránh nhiềin bẩiì hoặc thav đổi thành phầii máu trong SUỐI quá trình xử lý và bảo quản lĩìáii, nhất là troĩig trưởng hợp pliân tích hrựng vcì. Các bước xử lý phổ biến bao gồm: chưng câì, lọc, và kết tủa. Nlìữns mầu phức lạp cần plìãi được dông hóa, Iighicn hoặc xử lý bằng các phương pháp khác nliaii như: phá mầu, lọc qua màim lọc, sử dụng chất hấp phụ (trích ly pha rắn), không gian đầu (headspacẹ). 1.24 LỰA CHỌN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH K ỹ thuật phản tích được lựa chọn dựa trên những tiêu chí sau: I klìa nảng liến hành phân tích: cỡ inẫu, hóa chất, ihiếl bị, giá thành, trạng thái cuối cùng của mảu: các yêu cầu cơ bản: độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, độ lạp lại; I -i thao tác; an toàn, đơn giản, riít ngắn thời gian phân tích; -| tình trạng kỹ thuật: phương pháp chính thức, phương pháp ^hòiig thí nghiệm. Các phương pháp chính thức đã được phát triển và nghiên cứu hoàn thiện đê so sánh giỊía các phòng ih í nghiệm. Các phương pháp chính thức bao gồm các phương phập tiêu chuán như TC VN , ISO, A O A C , A A C C , và AOCS. Tuy nhiên nhiổu kỹ thuậi phan tích không phải là các phương pháp tiêu chuẩn vì khá mới và không áp cỊụng được cho một sô' mẫu nhất định. Trong nhữiig trường hợp này, các phương phitp phòng thí nghiệm có thể đirợc sử dụng nếu như đã qua kiểm định 1 1 .2 .4. ÁP DỤNG CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH I G íc jphircfng pháp phân tích truyền thống như phân tích trọng lirợiig và hóa học vẩn đ ifỊjt sử dụng trong các phân tích thực phẩm. Tuy nhiên khi phân tích các hợp chất V(Ề hàm jirợng thấp và cần độ chính xác cao thì các phương pháp ịỊhân tích bằng công cụ ngày càng chiếm ưu thế. Có nhiều kỹ thuật phân tích thực phấm dựa trên nguyên lý sắc ký, quang phổ, vật lý và sinh học. 20 1.2,4.ỉ . Các phuơtỉg pháp phán Ííclì hóa học Nhóm các phương pháp hỏa học chủ yếu clựa trên các pluiiì ứng hóa học và những dụng cụ thiết bị đơn gián đế phán tích các chất. Các phương pháp này ra dời sớm, thường được dùng đế xác dịnh nhimg lượng lớn, iượng vừa và lượng không quá nhỏ ệẩc chất. LẬÂ.2, Các kỹ thuật p h ổ ; 1 • ựv, V iSy huỳnh quang PhÌỐ cực tím và ánh sáng trông thấy hấp thụ bức xạ và được sử^ụng trong phòng thjf nghiệm từ nhiều năm nay. Các cấu tử cẩn phân tích trong mẫu lịhực phấin hấp thụ cíực tím (Ư V ) và ánh sáng trông thấy (Vis) có thể được phân tícỊi tại bước sóng đặcĩ trưiig trong quang phổ khi không có các chất ảnh hưỏìig. pịìổ huỳnh quang lìl^ạy hơn phổ UVAîs. Nhiều phân tử hĩai cơ huỳnh quang, bặo gồm vi khuẩn văị một số dư lượng thuốc bảo vệ thực vật tạo ra phổ huỳnh quang và dây là cơ sở để phắt hiện chất tạp nhiễm trong thực phẩm. [ • Ị ữ ồ n g ngoại (infrared) Nhiều nhóm phân tử hấp thụ ánh sánghồngngoại tại bước sónậ trong dải hồng ngoại với vùng bước sóng đặc trưiig đần tới khả năng xácđịnh xáệđịnh hợp chất. K ỹ thuật này đã được phát triển trong nhiều nãm và m ở rộng ứng ểụng trong những nđm gần đây. Phương pháp phd hồng ngoại FTIR được sử dụngỊtrong dáy chuyền sản xuất để xác định hàm lượng chất béo, protein, độ ẩm. Đây phương pháp trực tuyến có ưu điểm lớn so với các kỹ thuật khác vì khống phải xử lý hoặc phá mẫu trước khi phân tích. < 1 • Phố hấp thụ nguyên tử \ Qiiang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) dựa trên sự hấp thụ bức xạ llV - V is bởi các hợp Bhất vô cơ đã được nguyên tử hóa, trong đó phổ phát xạ (A E ^) sử dụng phát xạ Ặ a bức xạ mầu. Mẫu được tro hóa, hòa tan trong nước hoặc axit ịoãng, làm bay hơi. Trorig ẤAS, mẫu được ngiiyẽn tử hóa bằng nebulizer Hoặc bang lò nung. Kỹ thuật này được áp dụng để phân tích các hợp chất vô cơ có trong mầu thực phấm. 21 • P h ổ khối (MS) 9- Nguyên tắc của khối phổ là các phân lử đã được ion hóa sẽ phân mảnh thành các mảnh có cấu trúc khác nhau có thể tách bằng tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/z) trên cơ sở từ trường hoặc điện trường. Gác ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng (loại bò electron, proton hóa...). Sau đó chúng được tách theo tỷ số m/z và được phát hiện khi chuyển thành các tín hiệu điện, từ đó có thể cung cấp thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất, L 2 .4 3 . Sắc ký Sắc ký ỉà kỹ thuật tách, phân ly và phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩiìh. K h i tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hổn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chấl của chúng (tính hấp phụ, tính tan...). Trong các hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hẹ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hcrn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá írình sắc ký. Các kỹ thuật sắc ký được sử dụng rộng rãi trong phân tích thực phẩm là sắc ký khí (gas-chromatography, GC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (high períormance liquid chromalography, HPLC). Chúng đóng vai trò phân tách để chuẩn bị cho quá irình phân tích khi được kết nối với một thiết bị khác như khối phổ (mass spectrometry, MS). Sắc ký khí được ứng dụng trong phân lích các chất bay hơi hoặc bền nhiệt, phù hợp với phân tích các hợp chấl khồng phân cực. Tuy nhiên có thể dẫn xuất hóa các hợp chất phân cực trước khi đưa vào phân tích bằng sắc ký khí. Ngược lại HPLC phù hợp với các phân tích axit amin, peptid, đường và vitamin. • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Ngày nay, HPLC là thiết bị phân lích thực phẩm phổ biến nhất trong sô' các kỹ thuật phân tích hiện đại. HPLC được dùng trong phân tích các cấu tử thực phẩm 22 không bay hơi. Việc phân tích định lích thường được kiểm dịnh Iihờ chất chuẩn theo thủ tục tiến hành song song; phân tích định lượng thường được liến hành theo thủ tục cùa phương pháp đường chuẩn với việc đo chiểu cao hoặc diện tích pic sắc ký. Dựa vào tính chất của pha tĩnh và dung mối, người ta chia ra HPLC thuận pha và HPLC đảo pha. H PLC thuận pha có pha tĩnh là chất hấp phụ phân cực, pha động là dung môi không phân cực. HPLC đảo pha được sử dụng phổ biến hơn với pha tĩnh là không phân cực, pha động là dung môi phân cực như nước hoặc hỗn hợp nước-dung m ôi hữu cơ, ví dụ hỗn hợp nước-rượu, nước-acetonitryl, nướctetrạhidroíuran. Để tăng khả năng tách các chất trong hỗn hợp người ta dùng chương trình gradient với tỷ lệ dung m ôi pha động đirợc thay đổi trong quá trình phân tích. V í dụ, đối với trường hợp pha động là hỗn hợp nước-methanol, quá trình phân tích bằng HPLC thường bắt đầu với 5% methanol, và tăng tuyến tính tới 50% methanol trong 25 phút. Chương trình gradient phụ thuộc và mức độ kỵ nước cỉia chất phân tích, giúp tách hỗn hợp theo ái lực tương đối của chất với thành phần pha động và pha tĩnh. K h i dùng chircfng trình nồng độ của hỗn hợp dung môi methanol và nước, các thành phần kỵ nước sẽ thoát ra trước khi dung môi chủ yếu là methanol (pha động kỵ nước). Thành phần ưa nước hơn sẽ thoát ra trong điều kiện ít methanol/nhiều nước. Việc chọn thành phẩn pha tĩnh, pha động, chương trình gradient rất quan trọng và phụ thuộc vào bản chất của hỗn hợp chất cần phán tích. Để chọn được một phưcmg pháp phân tích tối ưu, người ta tiến hành nhiều các thí nghiệm với các điều kiện khác nhau để chọn ra được điều kiện phân tích có khả nãng tách tốt nhất. • Sắc ký k h í (GC) Trong sắc ký khí pha động là chất khí hoặc hơi có nhiệm vụ đưa các phân tử chất phân tích đi qua cột. Các chất khí sử dụng là khí hydro, nitrogen, helium, argon. Việc chọn khí mang cần để ý đến detector sử dụng, độ tinh khiết của khí mang và yêu cầu tách, kỹ thuật kết nối khi phối hợp các phương thức khác. Khí mang được dùng phải không được thay đổi trạng thái lý hóa học khi đi qua máy sắc ký khí. 23 Đõ chọn dược quy trình sác ký, cán pliải biết ngiión gôc và tliành phần của mẫu. đó chọn dươc cột tách với pha tĩnh phù hợp sao clio có độ chọn lọc cao nhíú, bềii nliiệt, dường kính và chiều dài cột tách tối ưu, chọn detector, k lií mang, diều kliiếii nliiệl độ cột lách. Đê hạn cliếảnh hưởng của các chất khác trong mẫu tới kết C|uá pluui4íckrtìguè(i giiUỉ dếii, chimg cất. chiết 1'ặiig dung môi Iroiig xử lý mẫu trước khi phán tích. Ngoài rii^d ế tãng hiệu quả lá^h các hợp chất có nhiệt độ bay hơi khác nhau trong một lán píián tích, người ta diịng chircfng trình nhiệt độ. Phương pháp này có ưu điểm là rút njgán thời gian phân I^ch và ổn dịnh chiều cao và chiềii rộng pic, có thể áp dụng dể Ịlịliân lích các mầu hẹlp chất thiên nhiên phức tạp. Các chất sau khi được tách ni khỏỉ cột sắc ký dược xái; định bằng detector. Hiện nay có gần 30 loại detector khác nhaịi, Iihinig có 3 loại dttector phố biến nhất là: deteclor dẫn nhiệt (TCD), cietector ion fct')a ngọn lửa (FID) vầ detector cộng kết điện tử (ECD). Ngoài ra khối phố (MS) đượcỊsử dụng như một detector dùng trong phân tích định tính, định lượng và xác định pấu trúc phân tử chắt phân tích. ' Phán tích định tính trong sắc ký khí chi cần pic không bị biến dạiịg nỉúều nhằm xác cậnh chính xác đinh pic, còn trong phân tích định lượiig thì yẽuị cẩu đạt cao hơn n h ịlđ ộ lặp lại, độ so sánh, dộ chính xác. Để đáp ứng được yêu cầaị dó, cần phải dảm lîo sự ổn định đủ lớn các thông số của cietector, độ tuyến Ịính ciia detector. Đ Ì nhận biết và xác định lượng vết thì độ nhạy của cietector đóiig vai trò quyết định. ! K ỹ Ihuật sắc ký hoặc liên hợp sắc ký-khối phổ (GC-MS, GC-ịviS/MS, G C /G C -M Í, LC-MS, LC-M S/M S) được phát triến rất nhanh và cho đến n«y đã trở nên pliổ b iín irong phân tích thực phẩm. Trong những phần tiếp theo, c h íin | tôi nêu những ứng ỉụng của kỹ thuật này trong phán tích thực phẩm trên phương diịộii kiểm soát cliất litU ig thực phẩm và nghiên cứu thành phần hóa học cíia thực phẩid. 1.2.5 .X Ử L Ý SỐ LIỆU Cho dù sử dụng những phương pháp lấy mẫu tiên tiến đến thế nào đi nữa ihì mẫu không bao giờ đại diện tuyệt đối cho lô hàng. Mật khác, không bao g iờ chúng ta có thể tiến hàiih một phép phân tích mà kết quả thu được lại hoàn loàn không 24 mắc sai số, mặc dù mọi cố gắng thực hiện các phép phân tích sao cho sai số nhỏ nhất. Vì vậy trong phàn tích việc đánh giá các kêì quả là một trong những bước không ihể ihiếii dược của các quá trinh phân tích. Xử lý số liệu phân lích cho phép ta loại bỏ được các sai số của phép đo, phép phân tícli Ịựà thu đ ư ợ c ^á ^ ket q^Liả với độ tin cậy cao. Các chuáa th ô n g ìê so sánh thường d u ị^ sử dụng rất phổ biến. Hiện nay nhiều phần mềm tính toán đã góp phẩn vào xứ lý t ố liệu với khối lượng lớn. Trong lài liệu này, tùy từng trường Bợp cụ thể phần xứ 1) số liệu hoặc tính toán kết quả sẽ được đề cập phù hợp. 25 Chương 2 NƯỚC 2.1. ĐẠI CƯƠNG VỂ HÀM LƯỢNG Nước, HOẠT ĐỘ NƯÒC, ĐƯÒNG đ Ẳ n g n h iê t h ấ p thu 'IVoiig các thực phấm hàm lượng nước rất khác nhau: 10 - 2 0 % trong ngD coc, 60 - 10% irong thịt, 80 - 90% trong quả và rau tươi và 90 - 93% (rong Iiiiỉii aii. Nư('íc không phai là hợp chất cung cấp năng liiợng mà ngirợc hũ nước làm cho lliựtkém châì lượng Irong thời gian bảo quản, do đó người ta ihườiìỊi lìiiĩi ^ iiiiĩi liàm iượiig nirớc trong chúng đến mức tối đa. 'IVong thực plìám, nước thường ở dưới hai dạng: - Nước lự do - Nước liên kếl, là nước kliông cò n lính chất n h ư nước íự cU), vì c ác phán tứ nia nó thrợc (líiili VÌU) các chrú cao phân lử bằng lực Vandervan vì\ biitiỊ^ C';ui liydro. Nươc liên kc( Uiirờng niấl khả năng hoà tan (dung môi) và khòiig (lóng l)ãiig (V! ỉiang lưựiig licn kôì giữa nước và phân tử các chấi khác cao lìơn nang lượng licn kốl giữa các phân u’r nước với Iihau). Các hợp phán như protein, g luxit...trong m ội thực phẩm cũng nlur trong một (lung cỉỊch cỏ ihể iưưng tác với nước làm nó khó bốc hơi do dó mà sỏ' [)hân tử Iiirớc ihoát ra tron g inội (lơn vị thời g ia n trên m ộ t d ơ n vị d iệ n líc h bc Iiìiii (llurc phãm (limg tlịch) sẽ Iihỏ liơn so với nước nguyên chất và cân bằng : l'hực phám (dung dịch) 26 hơi (lược thiết lậ|) ớ áp suất nhỏ hơn so với nước nguyên chất. ỉ loại dộ mrức của một thực phẩm là tý lộ giữa áp siiâì riôiìg phan |) cúa liưi ttưtK' trong mộí lliực pháin và áp siiấl riêng phẩn Pi) của hưi lurớc trong iur(Vc ngtiyCMi t lial ớ cìing Iiliiẹl clộ / \ 'ỈVoiig kliỗíig gian kín (khi thực phẩm có bao bì kín) cỏ mội dầng ihức giữa hoat clộ mrớc: của một ihực phẩm và áp suất hơi nước gây ra bới ilụrc Ịiiỉáiii tló: Độ ẩm iương đối cân bằng % 100 ỉ [oạl dộ nước của một thực phẩm đặt trong không kỉií sẽ bíUìỊ; (lộ áiii (ương (!òi của không khí dó. ' 1’uy hiii ihiuig dó là lương tự nhau (độ ấm tương dối càn báng dược do lìr 0 còn a,, thì lừ 0 - 1 ) nhimg hai thông số này có ý nghĩa vạt lý kliác nlum. 1)(> ÍHII UKíiig dối củii bằng là so với pha khí, còn lại có liên tỊuan với Ị)h a ngưng !II c ua lurớc bị liấp ilìỊi bởi thực phẩm. Ncu thừa nhạn hơi nước là khí với ý nghĩa dầy dủ lliì có ihC' coi Iroriịi niộl Ihirc ị)ham raii hoặc trong một dung dịch là đổng nhất với tlộ ẩm urưiiị^ (lòi cùa khí íỊuyèn vốn ciang ở Irạiig thái cân bằng với pha ngưng íụ, khi ú nu)l nlìiẹi độ nhiíl (lịnỉi. Nếu bicu diềiì bàng il 6 thị, với irục tung ghi llàĩTi lưựiig lurới' eũa tltực Ịìliáiu (tínli hang g nước Irên lOOg chất khồ) trục hoành ghi Iiổng clộ liơi nước íỉiuig cAií liaiig của khí íỊuycn đang cân bằng với sản phấni (dược tính bằng tlộ áni (irơiig (lối lu)ạc h ã n g lioạt (.lộ iiư ớ c lì^ t r o n g ih ự c p h á m ) ihì đ ư ờ n g c o i i g lliLi cỉirợc' g ọ i là (iư ờ n g ílaiig nhiệt h;íp (hụ và pliản liấp thụ (hình 2 . la) 27 Hinh 2.1 a. Dường đảng nhiệt hấp thụ và phản hấp thụ của nước Nliư vậy dường đáng nhiệl hấp Ihụ {và phản hấp íhụ) cho bict lạ i|iiiộ l Iihiệi í!ọ lìlìài c^nh (k lii ờ trạng thái can băng) luợng nước dược giữ ỉxVi một Ihực pỉiãni Lung nluráp suâì của khí nước do nước của một ihực piiám gây ra pliụ tliiióc vào (. líc dộ ám kliác nhau. Quịi (lườiiị: (iang nliiệt sẽ giúp cho ta: 1. l icn tloáiì dược hoại dộ nước trong hỗn hợp phức lạ|) (vi cỉụ inộl [ìnhpliani) 2. 'ffố iì cỉoán dược sự "đối xử" của một tlìực phẩm ưoỉìỊỊ c Ịiìa Irình g|a CỎIIO kỳ lliiiaí c ũ i i l n h ư Iroỉig qiiá trình bá o qu ả n ở trong c á c k h í (Ịưycn c ó c!ộ âiiì í^liác nliau. \ í ilụ: k lii lái ỉiydrat hoá mội sản phẩm dà sấy khô (khử mrớc) tlù Iliấy; CÙ11[^ IIIỌI liàni ỈLiơng Iiirớc, sán phain dà lái hydrat hoá cỏ hoại clộ IIƯÓX- cai) hơn sán píiani dã khử nirớc một phđn, Iihàl là Irường hợp các quá và rau là nhứnu Ihực |)lK'ini ịivdU (lường và muối. 2(S 3. (loán dược ánh hiròng của nhiệt cỉộ (Ỉếỉì ỉioạt (lộ cùa mróv của niọ[ mau san ịìliain tUrợc hao gói kín (dộ ấm klìỏng dổi). Dỏ (làiiu nhạn lliãy ớ tlộ âm khoiií: (lòi khi lioat (lộ lurớc lừ 0,4 - 0,5 neu lang nhiệl dộ sè ỉàiii laii^ lu)ạt dộ nước ( liin li 2.1 b), t)‘ lỉuạl tlộ IIước k h ỏ iig dổi, nêii laim Iihịệl dộ sõ k liử Iiưóv cuiỉ san p liiin i \'ii iiỊíưtíc ụH,--"--- ■ — — —— ---------------------------- - — - --------------------------------------------- -------------- Hình 2.1b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoẹi độ nước i 1. 'I^ÔII (íi)iin (iược lượiìg uirớc bị hấp thụ bới Iiìột sái> phâin thạs," Lìmklio \ a hin> ^ ú iỊiro iiịi lìiộ i bao IVi Ihấm dirực với hơi nước. I s lỊièíì tloáii (lược dộ bổn cúa hàng hoá ihực phẩm. 'Hurc |)hain l Iì !l|)ón lO! hâni. Với phương pháp này, người ta thườiig để mẫu vật và ở ỈKii nửa của một óiig tliLiỷ linh pirex. Nửa chứa mẫu được đặt vào bộ phận hìnli irụ ihích liỢỊ) của tú say, CÒIÌ nửa clặl bên ngoài tủ sấy ò nhiệt độ tlầựờiig, C(') vòi và khỏa luìl c hĩin khổng khi bál (lầu sấy. I^lurưng phíÍỊ) này cho kết quả rất tốt chi có nhược cliein là thời Cịuá tlài co Ihổ clến 150 giờ. lỉải 2. Phương pháp Kciĩi rischer Nguyên tác của phương pháp dựa trên phản ứiig sau: S 0 2 + ỉ 2+ 2 H 2 0 ^ 2I + 4ir-hSC V ' Phan ứng củii bằng này sẽ cluiyển dịch theo chiổu ihuộn khi cỏ Iiiạl mộl ba/xí lu’ru ctí như có khả nàng kôì liỢD dáa dẩn với các ị)rolon lạo r;i i!v)iig (ỊUá Iiìiilì pliáii ứiig. Ngoài ra piridin và metanol có vai trò là nhCmg dung môi của ioi và SOi. ^riiuốc lliử Karl Pichcr bao gồm S(32, u, piridin và một rượu (thường là meíanol). Mẫu vạl ơ li;ing lliái cân bằiig với một mồi trường có áp suất hơi nước bằng khổng, với diều kiện li) các Ihao lác làm thố Iiào để cho phép nước chứa trong lòng CÍÍC li;i! (lirới (ỈÌIIIỊ: huyén |)hù kliuốch lán dưa ra ngoài dung dịch iol và SO2. Sự kluiếcli tán này là hoàii loàn và tức thời với tất cá các sản phẩm hoà tan dược trong mội (lung mồi uanig liỢỊ) 31 \'ới (liiioc ihứ K a ii ỉ-isc licr (v í dụ dường sacaroza cháng hạn). ( ac tlitni kiọn nay ral klu') (hực liiệii với c'ác saii p h ẩ m thực p h ẩ m m à c ó m ộ t p h á n kíioug iliè (.•hiiyõn iliiiiili I iiâl ỉ>ay Ikíì (ít nhiệl dộ ihấp khác với nước đều dùng dược phiUĩiig pluÍỊ) Iiày^ ( tk' clìâì \rto n , aldịehit chứa Irong các sản phẩm sẽ cạnh Iranh với thiiổc thử. Do hắn chai rát háo nước ifà rất nhạy với các hiệu ứng quang hoá nên thuốc thử Karl rischdr dỏ l)ị hiên clêi ílieo Iliời gian. Đe ngan ngừa người ta phải điniị’ Irong cliMÌ llìiiý linh tHt |;k‘ ilụng Ijgan cán quang hoá cOng như các dụng cụ có lác dụng cách ly ilìiK K- lliư \ (Vi tlo iiiii ciui khí (Ịuyển. 1’liirờiig thì trước khi dùng phải chuẩn lioá lại lliuỏc llkứ. ( V) lỈK' ihay ihc nietaiiol bang 2 -meloxy-etanol thì ihuốc thừ bị biến cỉổi chậiìì liơiì. lỉãi 3. Phương pháp chưng cất ('lìíin iá ii vật vào trong mộl chất iỏng không hoà lần với nirớc, sau (h) lỉưiỉ liõii liơỊ) ilcii nhiệi lỉộ stVi. Uưi dung môi và hơi nước được chicì la và ciược m IIỈIỜ Iiiọl on^ siniì lìàn hổi lưu, sau đó thu lại trong một ống chia (iộ, ớ tlày m ul và (luii^ĩ IIIOĨ klionậ hoà làii nên lự lách ra. Lượiig nước được dọc biiag llìc (k li, mt)i lỊuùyng (ỉùpg là bcn/en, loluen, xylen. K ỉ iị kỉiãn chủ yếu Ịà không chiết đirơc nước hoàn loàỉì ở irong mầu. P lìipiig pháp này có thể áp dụng để xác cỉịnh nước trong b(j, (láu, các s.in phaiii í ’iìm 1ÌỊ)ÌI p ũ n g íilìir m ộ t s ố g i a vị. ^rhông thirờiìg n g ư ờ i tii c ỉi i áị> ( l ụ i i g |)lu|ưiiỊì ịìliiÌỊ) (.iiirnp. câí clu) những sản pliám lự khuếch tán được trong chất lung clC' k i‘í) cài. f> 4.t Plìuơtĩg f>f____ z pháp sấy ở nhiệt độ từ 100 đến 130%' f 5/ìíV' ỉỉàì f)ó là Ị)luRyng pháp dơn giản nhất và nhanh nhất, khá phổ hiến \'à clòi khi rfmg (.iio kòi V2 c Ịu á Iirơnị’ tir như pliưcmg pháp tuyệi đối. Với phiR)‘ng phắp nàv thường phải nghiền mẫu vr. kiổin tra kích ilìirớc hột njj,hicn lã ciìn iliict cho (lộ chính xác của các kết quả. lỉài 5. Phương pháp sấy nhanh ở nhiệt độ cao ịioo^c hoặc cao lioỉi) Sấy trong 2 dến 15 phút, cũng thường được dùng như phương ọhúp kiếm Ira côiig Iigliiệp. Mầu vật dặt trong lò sấy dưới đèn hồng ngoại, bộ phậiì cân cỉậi phía Iigoùi lò sấy và có thể dọc trực tiếp hàm lượng nước của sản phẩm. 2.3.2.PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ N ư ớ c CỦA THựC Pl IẨM ĩỉải 6. Xác ilịnh hoạt độ nước bằng phương pháp ììộỉ SUY a. Ngitycn tác ơ phần Irirớc, ta dã có: Độ ấriì tương đối càn bằng % 100 Độ ẩm lirơng dối cân bàng là độ ẩm mà tại đó mẫu vật không nhận lỉièin ãni cung như không cho ấm. N ói cách khác, ỏ độ ấm tương dôi cân biUig khòiig tlán dốiì inội sự thay dổi nào của khối ỉưựng vạt mầu. h. Tiến liàiilì X á c dịnh a,,, (là xác dịnh dộ ám tương đối cân bằng) bằng pỉurcyng Ị) h á Ịì nội suy lừ (lổ (hị dược liến hành như sau: Đạt các mẫu vậí trong C'ik' hình kicni như C'áf ImiiIì liúl ẩin nliỏ, có chứa các dung dịch muối bào lìoà dò lạo ra tỉộ âm lương (lỏi CÌUI hang (hay a^, chuẩn khấc nhau), có lắp ihiêì bị khuấy (lung dịclì và (Ịiiạl klìòii^ khí. C'ác bìnli hút ẩm được de ở cùng I nliiệl độ nhải dỊnh (trong lliic l bị (lieii nliiệt cách llu iỷ chảng hạn) sau m ộl thời gian lừ 2 dến 24 giờ (phụ lluiộc' vào niiiu vậi và các lác giả) cân trọng lượng các mẩu vật lừ đó biết dược sự biến thiên Irọiig lượiig cũa inảu. V õ clổ Ih ị vớ i trục y biểu diễn sự biến Ihiên irọng lượng nìầu và Irụ c X h ia i (lic ii tlộ ấin lương dối cân bằng (y = f(x )). Đ iểm cắt nhau cùa clườĩig tliầỉig với (rục lỉo ìiiiỉi là dộ íỉin urưng dối cân bằng (h ay a^) của sản phẩm (h ìn h 2 . 3 ,2 ) Biến thiên Hinh 2.3.2. Xác định hoạt độ nước của thực phẩm Với phương pháp này có thể xác định được khi ở nhiệt độ cao. COiìg có ihể dùng các bình có kíclì ihirớc như hộp Petri nhưng có hai khoang: khoang giữa dặi mầu vặi dịnlì xác định a,,., khoang ngoài dựng dung dịch muối bão hoà. Bảng 2.3.2a. Giá trị hoạt độ nước (ở 25°C) của dung dịch muối bão hoà a„ VVashburn 1926 R ockland VVeast LiCI.HÔ KC2H3O2 (axetat) 0,15 0,12 0,15 0,20 0,23 0.20 MgCl2.6H20 2,33 0,33 0,396 - - Dung dịch m uối bão hoà CrƠ 3 KjC03 Mg(N 03 ).Hp0 - 0,44 0,44 0,55 0,52 0,52 NaCI 0,76 0,75 - (NH,)2S0, 0,81 0,79 0,81 0,82 LÌ2SO 4 - 0,85 - KãcrO^ 0,88 0,88 0,88 KNO3 0,94 0,94 - Na^HPO, K,SO„ 0 95 0,98 0,95 0,97 0,97 CdCI 34 Báng 2.3.2b. Độ ẩm tương đối nhận được từ dung dịch H^so., H;S 04 (% trọ n g lượng Độ ẩm tương dối (a^.100) 0“C 25‘’C 50“c 75“c 10 63.1 64.8 66,(3 GO, 3 25 54.3 55.9 57.5 59.0 35 49.4 50.9 52.5 54.0 50 42.1 43.4 44,8 46.2 65 34.8 36,0 37.1 38.3 75 29.4 30.4 31,4 32,-1 90 17.8 18.5 19.2 20.4 2.4. XÁC ĐỈNH ĐƯÒNG đ Ẳ n G nhiệt HẤP thụ v à PHẢN HẤP thụ Ịỉài 7. Xác (ỉịnh duờnỊỊ dẳng nhiệt hấp thu r« phân hăp Ihụ cứu chè (I. N í i i i v c i i l ắ c ỉ) ạ t n iọ t liav nhiều I iiẫ ii ( d e pliaiii ướl (p liá ii liâp thụ) có trọ n g có 8 - 10 d iê m ) sả n ị) iiã n i k i i ỏ ( lia p llu i) lio a c s;iii lượng dã biết vào trong n iộl d ãv biiih kin cú (lộ iini lương dối của không k lií tãng dần (hấp thụ) hoặc iiiáni dần (piuiii h;'i|) iliụ) clio (lòn klii dạt tkrợc cân báng thì do khối lượng nước của các mẩu sản ịiluini tioiig (.-ác límh kín băn” cách cân. Từ dó sò' liệu thu đưực vẽ clồ thị w = I(.A„|> = (tộ ain, dộ ám tương dôi của klii (Ịuycii Irong cái' hinli kin (lim li 2.4a và 2.4b) f)ò i khi, cũng cần xác dịnh một hệ các dường dáiig nliiệl lại cái.’ Iihiộl (lọ khác Iiliau dc tínli nliiệt liâị) llui cliáng hạn (hìnli 2.4c) 35 a b c Hình 2.4. Các phương pháp để thiết lặp đường đảng nhiệl : a) Sơ đồ tiến hành với một mẫu sản phẩm; b) Sơ đổ tiến hành với nhiều mẫu sản phắin; c) Sơ đồ tiến hành ỏ các nhiệt độ T j, T 2, T ì khác nhau. b. Hoú chấí \'à dụng cụ Để thu dộ ẩiĩi tưưng đối cần có của không khí trong các bìnlì kín người la (iiiiig các dung dịch inuối bão hoà hoặc dung dịch axit sunfuric có nổiig clộ xác (lịiili (xem hảng 2.3.2a và 2.3.2b). Có ihể dùng bình hút ẩm chân không có đường kính khoảng 20 - 25cm. Các dung dịch muối bão hoà (hoặc dung dịch axit ỈI2SO4) dược dổ vào các bình hút ẩm chân không đến cách ghi sứ Icm , trên ghi sứ đặt cốc cân có (lườiig kínỉi khoang 6 cm de đựng mẫu. Muốn hệ thống nhanh chóng dại dtrợc tlộ ấm (.'áii bang, nguừi la dạl các giải giấy lọc có một đầu nhúng ngập t ro n g cỉuiìg dịch Miuổl bão hoà (lioặc dung dịch H 2SO4) quanh thành bình hút ẩm. Trường hợp dung dịch bão hoà là õxit crôm thì dùng bôiìg thuỷ linh thay giấy lọc. c. Clìuẩn bị ỉnảii Nói cluing, việc nghiền mảu là cần thiết nếu làm tăng độ xốp lự Iiliiên của sản phẩm để các phân tử nước di chuyển dẻ dàng do đó làm tăng quá irìn li Irao dổi 36 mà khồng làm thay đổi điểm cân bằng cuối cùng. Nhất là k lii lượỉig nước hấp Ị)hụ liiỊ i thuộc vào bề mặt tiếp xúc "không khí-sản phẩm" lỉù khảu nghiền mầu sẽ làm lang diện tích be mặt do đó tăng quá trình cán bằng. Đó là trưừng hợp các sản plìám dạng linh the thường có kích thước và độ cứiig của các tinh thể vòn ngan cản sự Ihâin nhập của nước. Trường hợp các sản phấm là dầu hoặc rấi ướt ihì làm lạnh (lỏng cho dễ nghiền hoặc nghiền lạnh có mạt nitơ lỏng hoặc tuyết cacbonic. 'lYong ĨIÌỌÌ Iruờng hợp, việc nghiền không được làm nóng sản phẩm để tráiih làm thay dối lính cliất hấp thụ do nhiệt. Ngoài ra, đối với trườiig hợp xây dựng đường đẳng nhiệt hấp thụ thì phải cỉưa mảii sán phẩm đến thuỷ phán dưới 1% hoặc trường hợp xây dựng dáng nhiệl Ịìhan hấp thụ lại phải (hra sản plìánì đến hàm lượiìg nước bằng hoặc cao hơn mức thuý íối da. d. Cách iiếỉi liàỉìlỉ Có thể đưa sản phấm đến thủy phần dưới 1% bằng cách sấy nhẹ trong tủ sấy chàii không trong nhiệt độ 50‘’c trong 16 giờ hoặc bằng cách dể máu sản phẩm vào bìnli hút ẩm clìâiì không có chất hút ấm P2O 5 trong 48 - 72 giừ Cíin chính xác khoảng Ig mẫu vào cốc cân đã biết trọng lượni;, dàn (lều mầu thành lớp mỏng rồi đặl vào bình hilt ấm chân khổng có độ ấm tương dối cùa không khí lang dần. Sau 1, 2, 4, 6 , 8 , 16 giờ để đạt cân bằng (khi trọng luựng liai lầii càn lièn liếp không chênh lệch quá im g). Trirờiig hợp phản hấp thụ, có thể lấy các mẫu dã đạt đến càn bàng trong íhí nghiệiĩi hấp Ihụ ở trên dem giữ ở khí quyển bão hoà hơi nước (clộ ẩm tương đối gần 98%) cho (lên khi hàm ám không vuc;íl quá lần câii irước vài |)hần trãnì {%), Dc niáu vào cláy bìiili húi ấm chân không có độ ẩm tương đối của không khí giỉìĩn dán trong Ihời gian từ 2 , 4, 6 , 8 , 16 giờ. Tiến hành xác định tliuỷ phần các mầu trong bình hút ẩm chân kiiông bầng phương pháp sấy nhanh hay phương pháp Karl Picher. Cho lủ sấy ở nhiệt dộ 130"c trong 1,5 giờ, sau đó lấy nắp đậy cốc cân lại và lấy ra đặt trong bình híit ám chân không để làm nguội trong 30 phút. 37 larợng ẩm càn hãng (% ) trong các mầu san pliám ở (lộ áni liR ín y tlỏi cuii không khí khác Iihaii, dược tính iheo còng thức : N = ^ - ^ ^ x lO O ( % ) G ,-G , í rong dó: G|; khối lirợim của cốc cán không có máii (g); G ỉ 4- khối lượng sản phấm ở điều kiện cân bang; G,; G l + khối lương sản phám khô sau khi sấy. 38 Chưoìig 3 PROTEIN 3.1. Đ Ạ I C Ư O N G VỂ NGHIÊN c ứ u CẤU TRÚC PHÂN TỬ PROTEIN NghttMi cứu Cấu trúc phân lử proteỉn ihường theo các bước sau: Thu lìlụip proĩein à (lạng íiiìli sạch: sử dụng các phương pháp kết lũa thuận nghịch sác kí qua cột trao dổi ion, rây phân lử, phương pháp sác ký ái lực... dc loại bỏ các prolein ỉạp. X(k' (lịnh ĩliàỉih pliầỉì a.xiĩ aniiìì cùa proíeiỉỉ, iheo trình lự: - Thuỷ phân protein thành axit amin, thường dùng lici 6 N ỏ 1l ơ ' c 24h. - Loại axii khòi dịch thuý phân. - Tách riêng các axit amin ĩrong (lịch thiiỷ phàn: Có thế dùng phương pháp sác k í írêMì g iấ y sác k í kết liợp với diện di trên g iấ y sác k í vứi CỘI Erao dổi ion (thường dùng là polysiilen sưnfonai như Dowe\ 30). - Phát hiện axit aniiiì bằng pliàn ứng dặc lìiộu. V í dụ với thuốc thừ ninhidrin, axil amin cho phức chấl màu xanh tím, riêng prolin tạo thành phức màu vàng. Cường dộ màu li lệ với lượng axit amin. - Để dịnh tên các axil amin trong dịch thuý phân cần licn hành phân tích song song 1 mẫu chứa hỗn hợp của axít amin chuẩn. Đối chiếu so sanh sắc kí dổ nhạn được của mẫu nghiên cứu và mẩu chuẩn sẽ biết dược thành phán tí lệ từng axit amin trong mẫu nghiên cứii. - Tính số gốc axil amin trong phân tử. Ngày nay nhờ có máy phân lích tự động ihành phần axit amin có thể hoàn thành việc tách và phân tích dung dịch axit amin trong vòng 2 giờ. Xác định trình tự sắp xếp các gốc axit amin trong chuỗi polypeptii. Các phương pháp được dùng từ trước đến nay như phương pháp Sanger, phương pháp dùng danxil clorua, phươiig pháp Edman. Để xác định trình lự axit amin của mội chuỗi polypeptit thường theo trình tự: - Cắt chuỗi polypeptit ở nhữiig vị trí xác định tạo thành các đoạn peptii ngắn. Để thực hiện điều này thường dùng các enzim phân giải prolein (tripxin, kem otripxin, clo s tricin ...), các hoá chất đặc biệt (CNBr). - Dùng phương pháp sắc kí để tách riêng các đoạn peplit này và tinh sạch chúng. - Xác định irình tự sắp xếp axil amin của mỗi đoạn peptit đã tinh sạch. - Đ ối chiếu trình tự axit amin cùa các đoạn peptit khác nhau (chú ý những đoạn có trình tự axit amin bao phủ lên nhau) để thiết lập trình tự axit amin của toàn bộ chuỗi polypeptit. [777: © FDNB (hoặc đan xicio ru a) 1 - © 2 - © 3 - G 4 K D 5 - © 6 Đánh dấu < Â )-© — © - G H E ) - © Thủy phân Hình 3.1. Sơ đổ phản ứng dùng FDNB hoặc danxil clorua. 3.2. MỘT SÓ TÍNH CHẤT QUAN TRỌNG CỦA PROTEIN Tính chất cùa protein phụ thuộc vào thành phần và trình tự sắp xếp các gốc axit amin trong phân tử của nó. Do cách kết hợp giữa các axit amin trong phân tử 40 prolciii dễ dàng thấy rằng proiein phải còn mang dấu ấn rõ rệt tính chất các mạch bôn của các gốc axit amin cấu tạo nên nó. V í dụ: Phản ứng màu đặc trưng, tính chất điện l i . .. Tuy nhiên, protein có những tính chấi hoàn toàn khác axit amin, đó là những tính chất phụ thuộc vào liên kết peptit, vào cấu trúc không gian phân lử lớn của protein. 3.2.1. KHỐI LƯỢNG VÀ HÌNH DẠNG PHÁN TỬ PROTEIN Protein có khối lượng phân tử (M r) tưcnig đối lớn và thay đổi trong một dải rộng từ hơn mười nghìn đến hàng trăm nghìn daỉton hoặc lớn lìCfn nữa (bảng 3.2.1). Các phân tử lớn này có thể có dạng hình cầu ( hình hạt, hình bầu dục) hoặc dạng sợi. Giữa hai nhóm proiein này có khác nhau về một số tính chất. Các protein hình cầu (spheroprotein) tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, rất hoại động về mặt hoá học. Thuộc nhóm này có hầu hêì protein có hoạt tính xúc tác (enzim): albumin, globulin, m ioglobin, hemoglobin. Tỉ lệ giữa trục dài và trục ngắn của phân tử bé hơn hoặc bằng 2 0 , ở các protein hình sợi, tỉ lệ này lớii hơn nhiều. Phản ứng: 0 ,N V a l— G li— lle — P h e — Lys NHo--- c CH 25°c. Ọ II ■c— Val- NH 0?N HF pH = 7 - 8 •Gli— tle — Phe ■Lys CH NO Thuỷ phân bằng HCI 6 N. 110°c 0 O2N ■CH— c — 0' < c y ~ + Val + Gli + Lvs + Phe + He CH3 NO2 Dinitrophenyl-alanin (DNP-alanin) 41 ọ H5N- - c c — 0 — 0 — O' CH 20‘^C. H3C. pH = 9 .CH3 N NH— C H -C — C — 0 - 0 - 0 + HCI CH3 Thuỷ phàn bằng + 0= s = 0 HCI 6N 110°c o o o H NH - - C ĩ c — O' o ÓH3 Dần xuất danxyl - axit amnin Hinh 3.2.1a. Dùng phản ứng thủy phân Sơ đổ m in h hoa 42 Phan img: o H H 2N — c — c — G ỉi— A s p — V a l — Arg N =c=s CH3 0 H NH— C -N H — c — C -G ỉi-A s p -V a l-A rg Q^ Phenyltiocacbamoilopeptit o H H N C -O H G l r - A s p “ V a !— Arg v c \ CH / s R Phenyltiocacbanoil amino axit Mòi trường axit vưa phải Phenyltiohiơantoin ~ axit amin (5-ũlkilo-5-fenilĩo-2tìohiơantoin) H ỉ n h 3 .2.1 b. D ù n g p h ư ơ n g p h á p E d m a n V í dụ iropolagen (dưn vị cấu irúc cư sở cua colagen) có chiếu dài 3000Ả, đườag kính 15Â. Các protcin hlnh sợi (scleroprolein) lương đối irơ về mặl hoá học chiì yếu có chức năng cơ học. V í dụ: Colagen của da. xương, sụn, gân, răng; keralin của tóc, lông; íib roin của tơ, miozin của cơ. 43 Báng 3.2.1. Khối lượng phân tử tương đối (Mr) của một số protein thường gặp Protein XitocramC Mr (dalton) 116000 Ribonucleaza Lizozim (lòng trắng trứng) 12700 14400 Mioglobin Tripxin 17800 Bromelin 24000 25000 Pepxin 36000 Hemoglobin 64500 Albumin huyết thanh 69000 Hexokinaza 96000 Lactat dehidrogenaza Ureaza 150000 483000 Miozin 620000 3.2.2. TÍNH CHẤT LƯỠNG TÍNH CỦA AXIT AMIN VÀ PROTEIN A x it amin và protein có tính chất lưỡng tính, có nghĩa là vừa có tính chất axit vừa có tính chất bazơ. Theo thuyết Bronsted, một chất có tính chất axit có khả năng cho proton, phản ứng với bazơ tạo thành muối. Tính chất bazơ thể hiện ở khả năng nhận proton, kết hợp với axit tạo thành muối. Phân tử axit amin dồng thời có cả nhóm amin và nhóm cacboxyl. Trong dung dịch ở pH trung tính, axit annin tồn tại chủ yếu ở dạng ion lưỡiig cực (chỉ 1% ở dạng trung hoà), ở dạng ion lưỡng cực, nhóm cacboxyl bị phân li, nhóm amin bị proton hoá. Trạng thái ion hoá của các nhóm này tuỳ thuộc vào pH môi trường. Trong m õi trường axit (pH = 1) nhóm cacboxyl không ion hoá nhóm amin ở dạng proton hoá. Ngược lại trong môi trường kiềm (pH = 1 1 ), nhóm cacboxyl io ii hoá, nhóm amin không ion hoá (hình 3.2.2). Như vậy khi đặt axit amin trong điện trường tuỳ thuộc pH m ôi trường, nó có thể di chiiyển về catot hoặc anot, ở một pH nào đó, axit amin không di động trong điện trường, chứng tỏ tổng số điện tích trong phân tử của nó bằng không, pH này được gọi là pH đẳng điện của axit amin kí hiệu là pHi. 44 NH 3^ NH 2 H— c — CO O' H— c — C O O ' NHa" H— c — C OOH + R + R R Dạng ưu thế ở pH=1 Dạng ưu thế ở pH=7 Dạng ưu thế ở pH=11 Hình 3.2.2. Các dạng ton hoá của axit amin ở c á c pH khác nhau Các axit amin chứa một nhóm a m in , mộl nhóm cacboxyl, mạch bên kliông phân cực (A la, Val, Leu, lle) có giá trị pHi vào khoảng 6 , axit amin có 2 nhóm cacboxyl (Asp, G lu) pH i ở vùng axit, ngược lại các axit amin kiềm pHi ở vùng kiềm (bảng 3.2.2). Báng 3.2.2. Giá trị pHi của mộí số axit amin A x it amin pHi Asp (A) Glu (G) 2,77 3,22 Cys (C) 5,07 Ser Val (S) (V) 5 68 5,96 Gly (G) Leu (L) 597 5,98 Ala lle 6,02 6,02 (A) (1) Lys (K) Arg (R) 9,74 10,76 Tương tự như axit amin, protein cũng là chất điện li lưỡĩig tính, vì trong phân tử protein còn có nhiều nhóm phân cực của mạch bôn (gốc R) của axit amin. V í dụ: Nhóm cacboxyl ihứ hai của Asp, Glu, nhóm amin của Lys, Guaniđin của Arg, imidazol của His, hidroxyl của Ser, Thi, T yr... trạng thái tích điện củíf các nhóm này cũng tuỳ thuộc pH m ôi trường, ờ một pH nào đó mà lổng số điện lích + và điện tích - của phân tử protein bằng không, phân tử protein không di chuyển trong điện trường gọi là pH i của protein. Như vậy nếu protein có chứa nhiều Asp, G lu (axit amin axit), pHi của nó ở vùng axil và ngược lại nếu chứa nhiều axit amin kiềm (Lys, A rg, His) thì pH i của nó ở vùng kiềm giá irị pHi của một số protein như sau: 45 Pepxin 1.0 Hemoglobin Aỉumin trứng Cazein 4.6 4,7 Ribonucleaza Tripxin Albumin huyết thanh Gelatin 49 4,9 Xitocrom Prolamin Globulin sữa 5.2 c 6,8 7,8 10,5 10 6 12 0 ơ mòi trường có pH < pfỉì, protein là lĩiộ i da caĩion. số diện tích dương lớii hơn điện tích âm. ớ pH > pHi phân tử protein the hiện tính axit. cho ion ìrV. do đó số điện tích âm lớn hưn số điện tích dưưng. ơ trong mòi trường có pH = pHi. protein dẻ dàng kết UI lại với nhau, có thể sử dụng tính châì này đế xác định pHi của protein cũng như đế kết tủa prolein. 3.2.3. TÍNH CHẤT DUNG DỊCH KEO PROTEIN, s ự KẾT TỦA PROTEIN Khi hoà tan. protein tạo thànli dung dịch keo. Các phân tử keo có kích thước lớn, không đi qua màng bán ihấm. Sử dụng tính chất này có llìế tinh sạch prolein khỏi các chất phâii lử ihấp bằng phương pháp thẩm tích. Do trẽn bổ mặl phân lứ proieiii có các Iihóm phâiì cực khi lìoà vào nước, các phân từ nước lường cực được hấp thụ bởi các nhóm này lạo thành màiig nước bao quanh phân lử prolein gọi là các lớp vỏ hiđrai. Dùng phương pháp phân tích Rơnghen đã xác định dưực ràng lớp nước ớ sát bé mặt phân tử proĩein có bề dày 3Ả (đúng bằng kích llìước phân tử nước) là lớp nước đơn phân lử. Những phân tử nước ở xa hơn sáp xếp iì irặt tự hơn. Độ bền của dung dịch keo prolein phụ thuộc vào Ii li iểu yếu tố, ví dụ; sự tích diện cùa phán tử protein, mức độ hiđrat hoá, nhiệt dộ. Khi thay đổi các yếu lố này, ví dụ làm trung hoà điện phàn tử protein, loại bỏ lớp vò hiđrat, các plìân tử lớn prolein sẽ kết tụ lại với nhau lạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch, thường gọi là kết tủa prolein (hình 3.2.3). Như vậy dế kết lủa protcin có llìể thay dổi pH dung dịch đến p lỉi của prolein, thêm các muối trung hoà, dung mòi hữu cơ (axetol, etanol) ở nồng độ cao, tăng nhiệt độ. Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết lùa, protein lại có thể tạo thành dung dịch keo bền như trước hoặc mất khả năng này. Trường hợp thứ nhất gọi là kết liìa thuận nghịch. Khi bị kết tủa không thuận nghịch, protein đã bị 46 mất nhiìng tíiìh chất ban đáu, còn gọi là sự biến tính prolein. Những ihay đổi dẻ Ihấy nhất là lính tan, hoại lính sinh học (ví dụ: enziin mâì hoạt lính xúc tác) và khá nàng phán ứng hoá học. N ghiên CL?11 cấu Irííc không gian cho ih ấy khi bị biến lính phân tử proiein không cuộn chặl như irước mà ihường duồi rii hơn. Kết quả là phá vỡ cấu hình không gian cần liiiết dê ihực hiện hoạt lính sinh học cíia phàn tử được lộ ra n g o à i n ê n ỉ à m t à n g k h á n ă n g p h ả n ứim h o á h o c ciia p r o i c i n . Tóm lai, hai yếu tố bão dam độ bến dung dịch keo proteiii là: - Sự tích điện cùnơ dấu của các phân lứ proieiii (ở pH ị pHi) - Lớp vỏ hiđrat bao quanh phân tử protein. anion protein loai nước prolein ỏ pHi cation protein thèm kiểm thém axit tàng pH giàm pH loai nước loai nước protein kèt lùa Hinh 3.2.3. Sơ dồ kết ỉủa protein. ỨỈỈỊ’ cúc yếu ĩ ố kếí ỉ lia proíciỉi Các yếu lố kếi tủa ihiiận nghịch proicin dược dùng dè ilìL i nhận chế phám protein. Đế dạt mục dích này thường dùng muối Irung hoà như (N H 4)S0 4 dung môi hữu cơ như axeton, ctanol và phái tiến hành ở nhiệi độ ihấp dưới 0"c. M uoi trung hoà vừa làm trung hoà diện vừa loại bỏ lớp vỏ hiđrat của proiein, còn dung môi hữu cơ luio nước, phá huỷ lớp vó hidrat rất nhanh chóng. Trong chế phẩm protein nhận được còn lản các chất dã dùng để kết lùa; cần sử dụng các 47 phương pháp thích hợp để loại bỏ các chất này. V í dụ dùng phương pháp thẩm tích để loại bỏ, muối (NH 4 )S0 4 . Các yếu tố kết tủa không thuận nghịch (biến tính) protein được sử dụng để loại bỏ protein khỏi dung dịch, làm ngìmg phản ứng enzim. Đcm giản hơn cả là đun sôi dung dịch protein. Các hoá chất thường dùng để làm biến tính protein là: các loại axit, kiềm ở nồng độ cao. Một sô' axit được dùng phổ biến như: axii tricloaxetic, axit voníramic, axit picric, axit suníoxalixilic. Ngoài ra, để làm biến tính protein người ta cũng thường dùng muối của các kim loại nặng như Pb, Hg, Cu, Fe. 3.2.4. KHẢ NÀNG HẤP THỤ TIA TỬ NGOẠI CỦA DUNG DỊCH PROTEIN Dung dịch protein có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở hai vùng bước sóng khác nhau 180-220 nm và 250-300nm. a) Bước sóng từ ỉ80-220iìiu: đó là vùng hấp thụ của liên kết peptit trong phân tử protein, cực đại hấp thụ ở 190nm. Do liên kết peptit có nhiều trong phân tử protein nên độ hấp thụ khá cao, cho phép định lượng tất cả các loại protein với nồng độ thấp. Tuy nhiên vùng hấp thụ này của các liên kết peptit trong protein có thể bị địch về phía chính các tạp chất này cung hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng bước sóng 180-220nm. V ì vậy trong thực tế khi đo độ hấp thụ của dung dịch protein thường đo ở bước sóng 220-240nm. b) Bước sống từ 250-300nnr. đây là vùng hấp thụ của các axit amin thơm (Phe, Tyr, Trp) có trong phân tử protein, cực đại hấp thụ ở 280 nm. ở bước sóng này Trp có đô hấp thụ lớn nhất rồi đến Tyr. Có thể sỉr dụng phương pháp đo độ hấp thụ của dung dịch protein ở bước sóng 280 nm để định tính và định lượng các protein có chứa axit amin thơm. Hàm lượng các axit amin thcfm trong protein khác nhau thay đổi khá nhiều, do đó dung dịch cùa các protein, khác nhau có nồng độ khác nhau về độ hấp thụ ở 280nm. Ngoài ra nhiều chất khác trong dung dịch cũng ảnh hưởng lớn đến độ hấp thụ của protein. V ì vậy, các phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại thường được dùng để định lượng protein đã tinh sạch hoặc sẽ xác định protein trong các phân đoạn nhân được khi sắc k í tách các protein qua cột. 48 3.2.5. CÁC PHẢN ỨNG THƯỜNG DÙNG ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN VÀ PROTEIN Như trèn dã nói, axit amin là đơii vị cấu tạo cơ sở của protein và peptit. Các axit am iii kết hợp với nhau qua liên kết peptit (-C O -N IỈ-) tạo thành peplit có chiều dài mạch khác nhau gọi là polipeptit. Phàn tử protein có thể bao gồm m^t hay nhiều chuỗi polipeptit. Sau đây là một số phản ứng đặc trưng thường dìing đ ế i|ịn li tính và định lưtpíng axit amin và protein. 3.2.5.ỉ . Phản ứng biure I.à phản ứng đặc trưiig của liên kết peptit, tất cả các chất có chứa |ìr 2 liên kết peptit trở lên đều cho phản ứiig này (axit amin và đipeptit không c6 phản ứng biiire). Trong m ôi trường kiềm mạnh, liên kết peptit trong phân tỉr proteậii phản ứng với CUSO4 tạo thành phức chất màu tím hoặc tím dỏ. Công thức cấu fi|o của phức chất màu như sau: N R ,C=^N- o. CH -N : 0 R \ / CH \CH—R 'O' N' 0 ' / C = N — CH 0 - ; Hinh 3.2.5.1. Phản ứng tạo phức chất màu tím I Phức chất màu có cực đại hấp thụ ở birớc sóng 540nm. Phản ứng iệày được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định krợng protein. Độ nhạy phản ứiig tăiỉg lên nhiều lần khi cố tíitiốe tìiử Poiin-Xiocanto ÍPolin-Ciocalteaii). H iện nạy n b iié tác giả đã cải tiến phương pháp biure làm tâng độ nhậy phản ứng lên hàng chục lần gọi là phản ứng microbiure. 49 3 .2 .5 .2 . Phản ứng vói thuốc thứ Poliìì - Xiocanto lliu ố c ihử Folin~Xiocanlo có chứa axil pholphomolipclic và axil photpho vonphramic. Các chất này một mặl ỉàm tãng độ nhạy phản ứiig biiire, mạt khác phản ứng với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein. Các gốc axit này tham gia trong quá irình tạo phức chất màu. Phức được lạo thành có màu xanh da trừi, hấp thụ cực dại ở bước sóng 750nm. Trong phương pháp Low ry, giai đoạn đầu thực hiện phản img Biiire, sau đó mới ihêm thuốc thử Foiin-Xiocanto để tạo phức màu xanh. Phương pháp này có dộ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ l|.ig /cm \ Vì vậy phương pháp Low ry được dùng khá phổ biến Irong phân tích protein. Tuy nhiên cường độ màu phản ứng còn luỳ thuộc nhiều vào loại protein. V í dụ ở cùng một nồng độ, dung dịch tripxin cho cường độ màu cao gấp 3 lần gelatin: hemogalobin cho cường độ màu thấp hơn tripxin nhưng cao hơn gelalin. Ngoài ra nhiều chất khác có thế làm tảng hay giảm cường độ màu phản ứng. Vì vậv phương pháp này cho kêì quả chính xác khi xác định proiein đã được tinh sạch ít nhiều. Các chất làm tăng cường độ màu phản ứng: phenol purin, axit uric, các chất chứa nhóm -SH , một số ion kim loại (do chúng cùng phản ứng với tlìuốc ihử Folin Xiocanto). Cấc chất làm giảm cường độ màu phản ứiig: etanol, eie ở nồng dộ cao hơn 5%, axeton, Ba(OH )2 ở nồng độ cao hơn 1%: CI;(COOH, HCIO4 triỉng hoà. 3 2 , 5 3 . Phản ứng với ninhyđrin Phản ứng màu đặc Irimg quan irọiig để định tính và định lượng axit amin. Tất cả các a -a x il amin của prolein đều phản ứng với ninhidrin tạo thành hợp châì màu xanh lím» riêng im inoaxit như prolin tạo thành màu vàng. Phản ứng này rấl nhạy: có thể phát hiện được đến microgam axit amin, vì vậy được dùng nhiều trong phương pháp định lính và định lượng axit amin (trong các phương pháp sắc kí và điện li). Cơ chế phản ứng khá phức tạp và có nhiều chỗ chưa thống nhất. Có thể nếu một số phản ứng chính như sau: 50 - Dưới tác dụiig của ninhidrin ở nhiệl dộ cao, axit amin tạo ihành N lỉ^, CO 2 và alíiclìit iươim ứim có mạch ngán hơn axit amin một cacbon, ninhidrin chuvển ihành dixeto oxihindriden. - Dixeto oxihindriden, N H ; mới dược lạo thành, tiếp lục phán ứng với một phân tử ninhidrin khác tạo thành hợp chất màu xanh lím có còng thức như sau: o o H R - Ọ ---- COOH NH3 + C0^ + RCH0 + I. NH2 Dixeto oxihindriden Hợp chất màu xanh tim Hình 3.2.5.3. Phản ứng màu với ninhydrin Đế định lượng axil amin có thế dùng phương pháp so màu đo cường độ màu phản ihìg hoặc dùng phươiig pháp đo lỉiể tích khí CO2 hoặc N ll, được lạo thành. Phương pháp so màu được dùng nhiều hơn. Ngoài axil amin, peptit, protein, muối amon, anioniac..., cũng lạo màu với thuốc tliử ninhidriii. Vì vạy muốn xác dịnh chính xác axit amin phải loại bỏ các chất này. Đế xác dịnh axil amin liên kối trong pcplil lioặc protcin phải thuỷ phân các chất này đế lạo thành axit amin lự do rồi mới ihực hiện phan ứng với ninhydriiL Các phản ihig màu đặc trưiiíĩ cho một hoặc mội số gốc axit amin và có ihế sử dụng để phát hiện axit amin, protein trong dung dịch được tóm tát trong bảng 3.2.5.3. 31 B ả n g 3.2.5.3. Một số phản ứng dùng để phát hiện axit amin, protein TT Phản ứng Chất chính tham gia phản ứng- Gốc axit amin tham Điều kiện chính của phản ứng gia phản ứng Màu Vàng sau I Xanị(ẹpnứÊm 2 Pauli 3. Millor Axit diazobenzosunfonic trong môi trường kiềm _______ Thuỷ ngân nitrat trong HNO3 đặc Xaca(|UBhị i Trp, ty r, Phe Dung dịch kiềm của a - naphtol yà hipobromi!______ ! chuyển '■'1 Tyr, His Kết tủa Tyr màu nàu đ Arg Đỏ Vòng tím ỏ Aaxit giiociỉic H2SO4 đặc Trp ^ ặ t phân (Hopkỉn- Co) Roeníiem íỊ^ màu da ca Đỏ anh đà Adampevic và H oU in thêm kiềm 3 ách Aỉdehyt íoomic 0,1% và dung bảo hoà Trp ĩím 3 .2 j Ị - 4 . P h ả n ứ n g c ủ a n h ó m a - a m i n v ớ i / o r m a l d e h i t ịP Ì} ÌỊt ứ n g X io r e n ie n ) Đá» là phản ứng quan trọng thường dùng để đánh giá mức độ huỷ phâi protein. Pormaldehil phản ứng với nhóm amin tạo thành dẫn xuất metile ì của axi amin theoị phản ứng sau: NH3* R— CH N=CH2 + HCHO —► coo- R— CH + HịO COOH (D(( nhóm amin đã bị khoá nên có thể chuẩn độ nhóm cacboxyl bắng kiềm từ đó tính được sô' nhóm amin. Phương pháp xác định n itơ amin dựa trên 3hản ứiiị này gọi là phương pháp chuẩn độ form ol). 3 .2 .5 .5 . P h ả n ứ n g M i l l o n K h i đun nóng dung dịch protein với một số giọt chỉ thị M illo n thì xuất hiệi màu đỏ và khi nồng độ protein cao hơn sẽ có kết tủa tách ra. Phản lìng này chủ yếi 52 trong dung dịch chứa nhiều tyrozin. Nên dung dịch chủ yếu iriptophan thì cho dung dịch màu \ àng. Dung dịch M illo n chiiấn bị từ thuỷ ngân hoà tan trọng lượng gấp 2 axit UNO, đậm đặc. Dung dịch lúc đầu pha loãng nguội sau đung nóng. Dung dịch này đươc phu |o ffig ‘p S l f ô r i l m g nước cất. ' Ị 1 , í 3.Ậ5.6, Phán ứng Xanthoprotein Njíu đun nóng dung dịch protein với một lượng HNO;, đậm đặc thí xuất hiện màu vàng sẫm hay kết tủa màu vàng. Màu vàng chuyển thành màu da cam ihêm khi vào hay biến thành màu da cam khi thêm NH-ị vào hay biến iịhành màu đỏ nâu kỊũ thêm dung dịch NH4OH kiềm tính. Màu này chủ yếu do phản ứng nitral hoá của ih â n benzen của tyrozin hay nhóm indol của tryptophan. I 3.3. THựC HÀNH Ccíc nguyên liệu và sản phấni của ngành công nghiệp lên men nỗi riêng và thực pháịm nói chung luôn chứa protit và sản phẩm thủy phàn cỉia nó. E»ây là một trong n h ^ g chỉ số quan trọng có ảnh hưởng đến quá trình ch ế biến và chất lượng sản phẩrậ. Trước hết hợp chất nitơ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng ch* nấm men và nhiềuịvi sinh vật khác. Nếu thiếu nitơ thì lên men rượu sẽ bị kéo dài. ^[ước chấm chứa ít c^m thì chất lượng sẽ kém. Lượng dạm amin ít sẽ ảnh hưởng quá trình tạo hươnịg trong sản xuất nirớc chấm và tàng trữ rượu lên men. Ngoài ra ịđạm protit còn ảnh iiưởng đến độ trong và tính bền của bia cũng như rượu q u ả ... I 1: X ác định đạm toàn phần và % protein theo phương ph á p líje k la h l i CI. 'N guyên tấc Bịln chất của phưcmg pháp Kjeldhal là khi đun nóng chất hữu cơ trong môi trường iiịxit sunfuric đậm đặc sẽ giải phóng ra anhydric của axit sunniric (SOOChất n à ỷ .M |fe to l i Ihành so, và giải phóng oxy nguyên tử. O x y giải pịióng ra sẽ hoá hydro và cacbon của hợp chất hữu cơ để tạo thành CO 2 , H 2 O còn nitơ sẽ tạo thành N H , V í dụ: NH2 - CH2COOH + 3 H2SO4 = 2 CO2 + 3 SO2 + 4H2O + NH,, 53 Khi amoniac tạo thành sẽ kết hợp ngay với axit-suiiíuric dư và tạo thành suníat amoni: 2NH, + H,SO, = (NH4),S04 Siinfat amoiii sẽ bị phân huỷ trong môi trường kiềm: (N H J jS 0 4 + 2Na011 = NiụSOa + 2N H , + 2 M2O Khí amoniac thoát ra khi cất lại được thu \ ’ào bình chứa H 2SO4 đã biết trước số lưọng. Căn cứ vào lượng H2SO4 dư sau khi cất ta biết được lượiig N H , đã thoát ra và do đó biết được lượng nitơ chứa trong mẫu phàn tích. b. Tiến liủiili Xác dịnh đạm toàn phần trong nước chấm hay dung dịch có lượng đạm 530g/lít. Dùng pipel hút 5ml nước chấm cho vào bình định mức lOOinl rồi théin nước cất tới ngấn bìiih. Lấc đều rồi lấy lOml cho vào bình Kjeldhal lOOmi. Tiêp tló cho klioảng 3,5 gam hỏn liợp C 11SO4 + K 2SO4 (theo tỷ lệ 6 :1 hay 10:1 ) dể xúc lác hoậc cho seleii vào xúc tác. Quá trình vô cơ hoá với 2 ml H 2SO4 đậm đặc (d = 1,835). Dùng ít nước sạch tráng sạch cố bình Kjeldhal rồi dặt bình vào bếp điện hoặc đèn cồn dun cho tới khi dung dịch có màu xanh của siiníầt đồng hoặc xitiih vàng là được. Đun xong để nguội rồi chuyển toàn bộ dung dịch vào bình cầu ciia máy cất đạm. Tráng bình Kjeldhal nhiều lần bằng nước cất rồi đổ vào bình cất. Mạt khác hút 1 5 m l dung dịch I I2SO4 0,1N cho vào bình tam giác 250ml, cộng thêm 5-lOml nước và 3 giọl m etliyl đỏ hay plienolphtalein rồi đặt bình vào vị trí làm việc. Chuẩn bị xong ta lấy cho tới khi thử giấy quỳ với nước ngưiig thoát ra khôní; còn phản ứng kiềm là được bình thường cất tiến hành khoảng 40-50 phút. Cất xong dùng bình tia rửa sạch axit bám ở ống ngưiig nhúng Irong bình tam giác. Sau đó đem chuẩn lượng H 2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1 N rồi suy lượng H 2SO 4 đã tác dụng với NH,. r, Tính kết quả Hàm lượng Iiitơ trong l l í l nước chím tính theo công thức (tính lượng Iiitơ toàn phần) bao gồm các loại nitơ có trong dung dịch: 54 N ,= iíld^l4H Ì,000 (g/n 0.5 = l.4u. / 0.5 irong dó: a: số m l dung dịch H 2SO4 0 , 1N cho vào bình tam giác; b: số m l dung dịch NaOM 0,1N tiêu hao khi định phân lượng axil dư; 0,0014: số gam nitơ ứng với Im l dung dịch H 2SO4 0,1N; 0,5; số m l nước chấm chứa trong máu phân tích hoạc số ml dịch đạm đem phân tích theo phương pháp lấy mảu và pha loãng. Chú v: Trường hợp xác dịnh đạm trong nguyên liệ u ngỏ, kh oai, sán hay bội khác thì cân khoang 1 gam bột trên cân phân tích xong chuyến toàn bộ vào bình Kjeldhal, cộng thêm 20 ml H2SO4 đậm đặc vào 10 gam hồn hợp chài XIÌC tác. Sau khi vô cơ hoá ta chuyển toàn bộ vào bình định mức lOOml rồi thêm nước cất tới gần bình. Sau đó lấy 40m l đem câì và tiến hành lương tự như trên, chỉ kliác là lượng NaOH 30% phải cho nhiều hơn và khoảng 50ml. Hàm lượng protein irong nguyên liệu lính theo công thức sau (proiein hay đạm toàn phần) p „= 100x6.25 (?f) n trong đó; n: sô' gam nguyên liệu chứa trong mẫu cleni phân tích; 1 0 0 : tính cho 1 0 0 gam nguyên liệu; 6,25; hệ số chuyển Iiitơ thành protein. V í dụ; lượng nguyên liệu đem vô cơ lioá là 1,0256 gain. Lượng axit siiníuric cho vào a=15 in l, khi chuẩn lại ta có b =10inl, vậy _ 1,0256 n=■ 100 X 40 = 0,4402g ^ Thay vào công thức trên ta có; IO)xQ. 0,4402 9 .390/. 55 Bài 2: Xác định đạm amin bằng phương pháp chuẩn (lộ /o n n o ỉ ư. Nguyên íắc Cơ sở của phương pháp là khi thêm íbrm aldehit VÌÌO dung dịch chứa axil amin thì dưới tác dụng cứa fo rm a lịe h ỵt,^á c nhóm amin sẽ bị m ethyl hoá và mất tính kiềm. Nhờ đó axit am iii trở nên axit mạnh hơn và có thể tác dụng vứi kiềm. Cãn cứ vàc ỉượng NaOH liêu hao ta tính được lượng axit và do đó biết được lượng I nitơ theo sc|f đổ phản ứng sau: H R - - c ~ -COOH + HCHO H R-—c - — COOH + H2O N--C H 2 NH2 H R~“ C— -COOH + NaOH —► N— =CH2 H R~ - c - -COONa + H2O N - -C H 2 Phảii ứng xảy ra hoàn loàn ở pH; 9,0 - 9,5. V ì thế khi dùng c ^ ĩ thị là phenolphta|ein phải chuẩn dung dịch tới màu đỏ sẫm. h. / / L chất - Du^g dịch NaOH 0,1 N I - D in g dịch phenolphtalein 0,5% pha trong rượu 50% rồi trung lioà bằng dung dịch ía O H đến xuấthiện màu hồng nhạt. Ị - HỖ n hợp íorm ol: Lấy lOOml dung dịch form ol 40% cho vào cốc khô, sau đó cho thê n 2ml dung dịch 0,5% phenolphtalein rồi dùng NaOH chuấn Ịlến màu hổng nhạt. 1 - Dung dịch axetat chi trung tính: Cân 20 gam PbO và 6 gam PbíCHsCOO) cho vào cốp rót vào lOml nước và đặt trên nồi cách thuỷ cho dến khi dung dịch có màu trắng hoặc trắng hồng. Sau đó cho thêm 190 ml nước khuấy đều dể cho lắng và gạiỊ lấy dịch trong. Tiếp theo cho dung dịch vào bình nút nhám để Ị)ảo quản khỏi tác dụịng của CO;. - Dung dịch Na2SƠ4 bão hoà. 56 Ị c. Tiến lìùỉìli Lấy 5-10 m l nước chấm hay dịch dạm khác nhau từ 8-20g// cho vào bình định mức lOOml, thèm vào đó mảnh giấv quì rồi trung hoà đến môi irường kiém yếu. Tiếp theo cho vào lOml dung dịch axeiaí chì rói thém nước tới ngấn bình. Lác đểu và dem kffi-rồi tấy 20m l cho vào bmh định mức khác có á m ^ lích l-Qtìml. Thêm vào đó lOml dung dịch Na 2SƠ4 để khử lượng chì dư rồi đổ nước cấi lới ^gắn bình, lác đều và đem ỉọc. ' Ị : Lấy lOml dung dịch cho vào bình tam giác 250ml, nhỏ \'à®ị vài giọt phenolphl^lein rồi trung hoà bàng NaOH 0,1N dến xuấl hiện màu hổng íìhạt. l'iế p theo cho 5ml hỗn hợp formoU lắc đều rồi đế yên cho phản ứng. Sau 2*phúl đem chuán hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 0,1N đến xiiàì hiện màu đỏ đậm (co thể màu xanh tím)ị d. Tính kết quả Hàm lượng đạm amin tính theo công thức sau: í / X 0.0014 /A (g//) ' ; ' a: tó mỉ dung dịch NaOH 0,1 N tièu hao khi dịnh phân; i N X 1000 = — n n trong đó: ị n: m l nước chấm tham gia Irong mẫu phân tích irong trường i|ơp cụ thế cùa thí ngịiiệm (hệ số pha loãng): ' 1 _ 50 20 11=-— x - ~ x l O = lin l; 100 100 , 0,0Ỡ14: sô' gam niiơ với 1 Iiil dung dịch NaOl 1 0,1. ! ; G /;| cìúr. Có ihể xác dịnh đạm amin bằng phương pháp iod (hợp chaịt đồng). B à ị. 3; X á c ( l ị n h đ ạ m N I Ỉ Ị ( t r o n g n ư ớ c c h ấ m ) . . . . . Nưđc chấm cũng như một sổ sản phẩm thực phấm khác thường ;chíra một lượng NPÍị ở dạng mụối vô cơ hoặc hydroxyd. Hàm lượng cùa chúng tphii b u ộ c quá trình sản xuất và điều kiện bảo quán. Nếu nước chấm chứa nhiều N H , thì không những gây m ùi vị khó chịu, làm giảm chất lượng của sản phẩm mà có thể gây độc hại cho cơ thể. Hạn chế sự tăng hàm lượiig N IỈ, trong sản phẩm là một yêu cầu quan trọng trong kỹ thuật bảo quản ihực phấm. 57 Để xác định ta lấy vào bình câì đạm lOml nước chấm sau đó cho thẽni khoảng 50ml nước cất. Nối bình với hệ thống cất dạm rồi qua phều cho vào lOg MgO (bảo đảm cho hỗn hợp có tính kiém) và tiến hành cẩt trong 30-40 phút ờ nhiệt dộ khoảng 40-50“C. N H , bay ra cũng thu vào bình chứa axit siiníuric (tương tự xác định dạm loàn phần). Chu Ỷ: 1. Trong các phản ứng trung hoà dung dịch N H ì bay ra, khi phán ứng xác định lượng H2SO4 dir bàng dung dịch NaOH 0,1N trước đây hay dùng chi thị là rnethyl đỏ hay bromathymol xanh có pH bước nliảy gần 7, còn phenolphlalein chuyển màu ở pH 8,2 (hơi kiềm mạnh). Vì vậy hiện nay người la hay dùng chi ihị hỗn hợp là clìâì chi thị Tashiro có pH chuyển màu chính xác ơ pH = 7 thì màu chuyển lừ màu tím trong mối trường axit chuyển sang màu xanh lá mạ trong môi trường kiểm. Chất chí thị Tashiro được chuẩn bị từ lOOml m ethyl đỏ 0,3% trong cồn + 15ml melhyỉen xanh 1% trong cồn. 2. Các bộ cất đạm dế thu N H , bay ra có thể tự lắp đơn giản nếu các phòng thí nghiệm không có các bộ cất đạm đầy đù hệ thống từ bộ cất đơn giản, bộ cái phức tạp có đử các bộ phận, bộ cất đạm tự động cao có cá bộ phận chuẩn và đọc số dịch đo luôn. 3. Í3ộ vô cơ hoá các clìàì bàng H 2SO4 đạm dạc lừ vỏ cơ hoá đơn giản irêii bép điện bếp cát, bếp dầu đến bộ vô cơ hoá kín nhiệt dộ cao sẽ rúí ngán được thời gian vô cơ hoá. Bải 4: Định lượng nitơcủa axit amiìì trong cỉĩè A x it amin là thành phần cỉia protit. Bất kỳ Irong quấ trình trao đổi clìấl ở thực vật hay trong quá trình chế biến chè, axit amin đều là những chất có hoạt tính hoá sinh cao. Hàm lượng và thành phần của các axit amin có liên quan mật thiếl với chất lượng của chè. Nói chung, trong chè thành phẩm loại tốt chứa nhiều axit amin hcfn chè loại xấu. A x it amin góp phần tạo nên hương vị của chè. Do đó nấm vững phương pháp phân tích axit am iii là một trong nhữiig phương pháp thực nghiệm 58 qua n trọng đ ế ngliiên CỨLI đ á n h giá phấin chất tốt hay xấu c ủ a ch è và tạo điéu kiện tàng cư ờ n g hay g i ả m lốn ihất lượng axii aiiìin có irong chè, a. N guvéỉỉ ỉâc Trong chè có chứa nhiều loại axil ainin, chúng có thể tác dụng với photphal dồng trong dung dịch đệm natri borat (Na.BÔ?) dế lạo thành muối dồng hoà tan có màu xanh. Sau khi axit amin tác dụng với pholphal-đồng, lọc bộ phận photphal đổng còn dư, dùng axit axetic đế axit hoà dung dịch tạo đồng axetat, liếp đó cho KI vào để chúng tác dụng với đổng axetal giải plìóns I 2 tự do. Dùng natri-thiosuníầl định lượng I 2 sẽ tính ra lượng axit amin. Sơ dồ phản ứng như sau: COOH COO' 1 R — Ò- R - - c — NH2 1 OH- H NH3* ,1 H coo- c o o — Cu— o o c Ị 2 R — - c — NH3^ + Cu** R c H NH2 H 2N — c — R 1 H H c o o — C u -- o o c R - c NH2 . N C R H -»-2 C H ,C O O H Cu(CH-,COO)2 H 2 Cul -t- I2 + 4CH 3CO O K 2 C u ( C H 3C O O )2 + 4 KI — I2 + Na^SÔg 2Na2S203 —^ — + 2 Nal /;. íỉ o á cììcíĩ 1. Dung dịch chì - axetat kiềm tính 5% (Cân lấy 50g pha trong 1 lít nước cấl). 2. Dung dịch natri-sunfat bão hoà (Cân 164g Na.S0 4 . 1 0 H 2 0 / l lít nước cất). 3. Dung dịch dồng-photphal Irong dung dịch dệm Na 2B4 0 7 . 4. Dung dịch CH.COOH 60% (60ml CH.COOH đậm đạc pha 1 lít). 5. K I tinh thể loại A , R hoặc c.p. 59 6 . Dung dịch hồ tinh bột 0,5% 7. Dung dịch I Ỉ 2SO4 6 N: 16.7 ml H 2SO4 36N pha từ lừ trong 83,3ml nước cấl 8 . Dung dịch muối nalri tetraborat: cãn lấy 57,2 Ig muối natri telraborat (Na 2B4 0 7 . I OH2O) hoà tan troiTg 1500 ml nước cất, cho ihêm lOOmi MCI IN . dùng nước cất âiều chinh thành 2000 ml. Ị 9. bung dịch HCl IN (lấy 84 m l HCl 12N pha loãng thành 1000 m l). 10 Dung dịch Na 2S2 0 , 0,05N: cân lấy 12.5g Na 2S2Ơ:t tinh thể ichính xác 0 ,lg ) hoì, tan trong 1 lít nước cất đã đun sôi, sau đó lọc vào bình mấu, cê ốn định dung dịca mỗi lít dung dịch có thể cho thêm 0 ,lg Na 2S2 0 v Sau đó cất g iir ở chỗ tô l Cách xác: định nồng độ của như sau: cân lấy 0,05 đến 0,06g k i o , hoặc KBrO , CỈIO vào bình có dung tích 5CX)mK cho thêm 50m l nước cất, lắc đệu cho tan, tiếp tục (ĩho thém 100 ml dung dịch có chứa khoảng 3g K I, đồng thờỉ cho thêm lOml H 2SO4 6 N. Để yên trong 3 phút, cho thêm 50 m l nước cất. Saii dó dùng Na 2S2 0 ^(Ịã pha chế ở trên để chuẩn độ, trong quá trình chuấn độ: Lúc đậu lìẻn pha tốc độ 120-130 giọt/ trong một phúl, lắc dều và khi dung dịch có màu vm g sáng thì ngừng lạ lúc này gần đạl tới điếm cuối, tiếp tục cho ihêm 2 m l dung dịch hồ tinh bột giảm tốc độ nhỏ giọt cho đến khi mâl hẳn màu xanh thì ihôi. Biêì được các số 11^1 ta sẽ tính ra n ồn g độ c ủ a d u n g dị ch N íIị S ị O , I c. Ọụiỉg cụ và rliiểt hị 1 - c||n phân tích có độ chính xác 1/ 1 0 0 ; I - niáy lắc, máy lọc hút, bình định mức các loại, bình chữ U; ỉ - binh tam giác loại: 150mU 250ml, pipel loại: Im l, 5nil, lOml; - phễu lọc và một số dụng cụ Ihóng thường khác, d. Tiếỉì lỉàtìli Cl ìiíẩii bị diiỉìg dịch ĩìú iỉglỉiệm Cân chíiih xác 2g chè đà nghiền níiỏ cho vào b ìn íĩ tăm giác có dung tích 150ml, cho thêm 30ml dung dịch chì axetat 5% kiềm tính, lại cho thêm 20ml nước cất, đậy nắp lại, đặt Irong máy lắc, lắc 30 phiíl để kết tủa tạp chất, phân licác axit amin. Lắc xong dùng máy híil lọc để lọc lấy dung dịch. Sau đó cho thêm 60 lOmldung dịch natri-sunfat bão hoà vào dung dịch đã lọc, khử ion chì còn dư trong dung dịch, lại lọc qua giấy lọc sang bình định mức, dùng nước cất diềii chinh đến vạch khắc độ (lOOinl), lắc đều, cất giữ làm dung dịch thí nghiệm. Xl'ic clịiili t i i t ơ t r o n g a x i t aniiit Dùiịĩg pipet hut íâý 2ỗmĩ dung dịch thí nghiệm cho vào bình định mức dung tích 50m ll dùng dung dịch NaOH 0,1N cho từng giọt vào dung dịch A d ' nghiệm, dùng giấyi quỳ làm chất chỉ thị, điểu chỉnh sao cho dung dịch có pH: 8 9. Sau đó cho thêm lOml đồng photphat trong dung dịch đến NajB 4Ơ 7, cho thêm nUPc cất đến vạch khắc độ, lắc đều và dùng giấy lọc m ịn để lọc. Sau khi lọc xong, dùnậ pipet hút lấy lOml ềung dịch đã lọc cho vào bình chữ ư , cho thêm Im l dung dịch i x i t axetic 60% cho Ịhêm Ig K I, lấc cho K I tan hết, sau đó cho thêm 5 giọt hồ tinh bột 0,5% để làm c h ít chỉ thị. Dùng natri thiosunfat 0,005N để chuẩn độ dung dịcặ cho đến khi mất nrû. Gọi lượng nalri thiosiinfat đã dùng là V |(m l). e.T ínli kếl quả N ita c ủ a axit amin (mg %) = N(V, -v,).28.100 G.(100-W )/100 trong đó: N - nồng độ quy về nồng độ đương lượng gam của NaiSaO,; V 2 -• lượng dư đã dùng để chuẩn độ kiểm chung, ml; V, f lượng dung dịch natri thiosuníat đã dùng trong thí nghiệm, ml; G -I trọng lượng của mẫu chè thí nghiệm, g; w --độ ẩm của chè, %; s- sô' lần pha loãng dung dịch; 28 - số n itơ của a xit amin tưcmg đương với 1 m l dung dịch natri hiosuníat 0,1 N. Ghi chít: có thể định lượng các axit amin bằng phương pháp sắc ký giấy hoặc sắc ký côt. 61 lìài 5: Phương pháp xác địìiỉi ỉưìni iượtìg (Uìỉiỉỉ tự do (free a-amino niirogen - FAN) a. H ó a ciìííĩ 1. Dung dịch màu 3 g ninhydrin 1 0 0 g N a ,H P O „ 12 H ,0 3 g fructoza 6 0 g KH ,P 0 4 Hòa tan trong nước cất, định mức đến 1000 m l. Dung dịch màu này ờ chai sảm màu trong điều kiện lạnh bảo quản được trong 2 tuần. 2. Dung dịch pha loãng Hòa tan 2 g K IO , vào 600 m l nước cất và thêm 400 m l cồn 96%. b. Phương pháp - Pha locìng mẫu tới nồng độ 1-8 mg a-am ino nitrogen/lít (đối với dich dường pha loàng 100 lẩn, đối với bia pha loãng 30 lần). - Lấy 2 m l mầu đã pha loãng chuyển vào ống nghiệm và đạy bằng một hòn bi thủy tinh để tránh sự mất mát do bay hơi. - Thêm vào 1 ml dung dịch màu 1 1). - Đun nóng trong 16 phúi trong nồi nước sôi liên tục, sau đó làm nguội irong 20 phút ở nước lạnh 25"c. - Cho vào mổi ống nghiệm 5 m l dung dịch pha loãng (2). - Lắc cán Ihận và đo độ hấp thụ tại 570 nm trong vòng 30 phútsaukhicho thêm dung dịch ( 2 ) vào. - Mẫu trắng dược chuẩn bị cũng với các mẫu thí nghiệm ở trên, chí khác là thay 2 m l dung dịch mẫu bằng 2 ml nirớc cất. c. Mầu clỉuẩỉì Hòa tan 107,2 mg glyxin trong 100 ml nước cất. Dung dịch này được bảo quản ở o o c, m ỗi lần ih í nghiệm pha loãng 100 lần. Dung dịch g lyxin đã pha loãng chứa 2 mg a-am ino nitrogen/lít. Tiến hành các birớc tương tự như đối với mẩu dịch đường. 62 d. Tính toá/i Hàm iượng a-am ino nitrogen (mg//) được tính như sau; X- A, -2-F' trong đó: A| - độ hấp thụ của dung ciỊcli thí nghiệm (dung dịch mẫu); - độ hấp thụ của dung dịch chuân; F - hệ số pha loãng. 63 Chương 4 ENZIM 4.1. GIÓI THIỆU Enzim hay còn gọi là ferment, là những chất men mang tính chất xúc tác các phản ứng sinh học hay hoá học khác nhau. M ỗi enzim có khả nãng xúc lác cho mộl sô' phản ứog nhất định. Hoạt động xúc tác của enzim càng mạnh thì l i r ^ g cơ chất bị chuyển hoá hoặc lượng sản phẩm phản ứng được tạo thành trên một đơn vị tliời gian và tnong một điều kiện nhất định càng lớn. V ì vậy ta không thể xác định trực liếp hoạt động của enzim nhưng có thể xác định tốc dộ chuyển hoá của cơ chất hoặc tốc đ ộ tích tụ sản phẩm tạo thành. Để đạl mục đích này ta có thế dùng nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp đo độ nhớt, phưcmg pháp phân cực kế, phương pM p áp kế, phưcfiig pháp quang phố kế, phương pháp chuẩn độ liên tục, phương pháp sắc ký và phương pháp hoá học. Nhìn chung có thể chia ra hai loại phương pbáp: phương pháp liên tục và phương pháp gián đoạn. Phương ịpháp liên tục thường đồi hỏi những máy móc đặc biệt với bộ phận ghi tự động sự biến đối liên tục cỏa hỗn hợp chất phản ứng trong suốt thời gian enzim hoạt động. Trong phương p h á p gián đoạn, người ta c h o enzim tá c dụng với C0 chất, sau những khỉiảng thời gian xác định lấy một ít hỗn hợp phản ứng dể định luiẹiig cơ chất còn lại hay định lượng sản phấm được tạo thành. M ột số khái niệm: 64 Đơn vị hoạt dậ enzìm - Đơn vị enzim quốc lế (UI) là lượng enzim có khả năng xúc tác chuyến hoá dược mốt m icrom ol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuán. Trong những điổu kiện xác clịnlì (bão hoà cơ chất), tốc dộ phản ứng do enzim XIÌC tác tv lệ \'ới lượng enzim trong hổn hợp phán ứng. Lượng enzim ở dà y không tính bằng mol hoặc m iligam mà dược biếu diẻn bằng dơn vị enzim ( 11 ); m ili đơn vị (inU) hoặc k ilo dơn vị (kU). 1 U I =: 1 m icrom ol cơ chất (10-6 moD/phút Kalal (Kat) là lượng enzim có khả nãng xúc lác chuyến hoá được một mol cơ chất sau một giây ở điền kiện tiêu chuân. I Kat = 1 mol cơchâì/giây ỉỉo a t độ riêng của em ỉm 1 loạt dộ riêng của một chế phấin enzim dặc irirng cho dộ ihuần khiết của chế phẩm enzìm. I loạt độ riêng được biếu thị bằngsố dơn vị enzim ứng với 1 ml dưng dịch (nếu là cỉung dịch) hoặc 1 mg proíeiii (nếu là bột khò) cùa chế phẩm. Nếu chế phám enzim đã tinh sạch, lioạt độ dược biếu ihị bầng số dơn vị enzim trẽn Ị rng enzim. lỉo a t dộ phán tử của eìĩiini lio ạ l dộ phân lử của enzim là số phán từ cơ chấl (hoặc sổ đương lượng các liên kết bị phân giải) dirực clìuycn hoá bưi ỉ phàn lử enzim sau 1 phút. Hoại độ phân tử được tính toán lừ hoạt dộ riêng và khối lượng phân tử của enzim. lỉo ạ t dộ của trung túm xúc tác eniim I ỉoại d ộ c ủ a t ru n g tâ m XLÌC tác eii/inì là số phân lĩr c ơ c hất (hoặc số đương lượng các liên kêì bị ph ân g iả i) dược chLiyển lioá trên niội trung l â m hoạt đ ộ n g sau 1 phúi. lỉo ạ l độ của trung lâm xúc tác enzim được línli toán lừ lioạl dộ phân lử và số trung tâm hoạt động của phàn tử enzim. Về nguyên tắc có thể chia làm ba nhóm phương plìáp sau : 65 Đo lượng cơ chất bị mấi di hay lirợiig sản phấrn dược tạo thành trong một thời gian nhất dịnli ứng với một nồng độ enzim xác định. Đo thời gian cần ihiết ciể thu được một lượng biến thiên nhấtđịnh của cơ chất hay sản phẩm i'mg với một nồng độ enzim nhấi dịnh. Chọn nồng độ enziin như thế Iiào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất liay sản phẩm. Đế thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng: phương pháp đo quang phố, phương pháp đo độ phân cực, phương pháp đo áp suất, phương pháp đo độ nhớt, phương pháp sắc ký và phương pháp hoá học. Nhữiig điều lưu ý khi xác định hoạt độ enzim - K hi tiến hành thực nghiệm cần tránh những yếu tố có thể gây biến tính protein enzim. Các điều kiện phản ứng (pH, nhiệt độ, các cation kim loại...) phải ở trong giới hạn enzim có thể tồn tại bền vững và giữ được ổn định trong suốt thời gian phản ứng. Với nhĩmg enzim cần có chất hoạt hoá hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này vào enzim trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng. Xác định hoạt độ cần tiến hành ỏ pH thích hợp và cố định. pH thích hợp có thể thay đổi khá nhiều luỳ thuộc vào cơ chất và thàah phần dung dịch đệm, lực ion của dung dịch đệm (thường trong phạm vi 0 ,0 1 - 0 , 1 ). Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzim để đề phòng tác dụng kìm hãm enzim do nhiệt dộ cao. - Nồng clộ cơ chất trong phản ímg enzim phải ở trong giới hạn thích hợp clủ thừa để bão hoà enzim, nhưng không quá cao để đến mức kìm hãm enzim. Sau khi dừng phản ứng lượng cơ chất bị chuyển hoá nằm trong khoảng 20 - 30%. - Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5 -3 0 phút. Tốt nhất là xác định tốc độ ban đầu cỉia phản ứng (30-60 giây), vì giai đoạn này tốc độ phản ứng khá ổn định, sau đó bất đầu giảm. Trong một sô' trường hợp hoạt độ của enzim quá thấp có thể kéo dài thời gian phản ứng đến 1 giờ hoặc lâu hơn. Trong trường hợp này cán phải 66 cho ihêm vào dung dịch các chấi diệt vi sinh vạt và tránh dùng dung dịch đệm Ihuạn lợi cho sự phát triển của vi sinh vậi. - Khi xác định hoạt độ enzim phải làm mẫu kiểm chứng song song với mẫu thí nghiệm. Trong mẫu kiểm chứng enziiTi đà bị làm vô hoạt trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất. - Khi chuẩn bị dung dịch enzim để xác định hoạt dộ, tuỳ theo đạc tính và mức độ thuẩn khiết của chế phẩm enzim mà tiến hành chuẩn bị để có được dung dịch eiizim trong suốt. 4.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT Lực ENZIM 4.2.1. PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ NHỚT Phương pháp này thường dùng khi cơ chất của enzim có độ nhớt lớn hơn sản phẩm thuỷ phân của nó. Sự biến đổi độ nhớt của sản phấrn ứng trước và sau khi cho enzim tác dụng là thước đo hoạt động enzim. Phương pháp này thường đế đo hoạt đ ộ n g c ủ a enziĩTi a m il a z a , proieinaza, pectinaza, xen lu la za v.v. 4.2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN c ự c KẾ Phương pháp này thường dùng khi cơ chất của enzim hay san phẩm phân giải của nó có khả năng làm thay đổi mặt phảng ánh sáng phân cực và góc quay riêng của chúng khác nhau. Người ía thường dừng phương pháp này dể xác định hoạt dộ của [3-fructofusanosidaza (saccaraza). Cơ chât cúa enzim là sacaroza có góc quay riêng là -f66‘’5, sản phấm tliiiỷ phân của nó là glucoza và íVuctoza có góc quay riêng lương ứng là +32*’5 và -92“5. Khi enzim tác dụng lên saccarozii, góc quay nghiêng giảm dần và cuối cùng chuyển từ phái sang trái. 4.2.3. PHƯƠNG PHÁP ÁP KỂ Phương pháp này được dùng khi enzim tác dụng tạo thành hay hấp thụ khí. V í dụ: các phản ứng oxy hoá, decacboxit hoá, loại amin v.v. Ngoài ra có thể dùng 67 p h ư ơ n g p h á p n à y d ể x á c đ ị n h h o ạ t đ ộ c ủ a c á c e i i z i m m à i r o n g q u á I r ì n h p h á n Lhig không trực tiếp làm biến đổi những thể tích khí nhưiig thông qua những phản ímg trung gian tiếp theo có thể lạo thành hay hấp thự khí. \ dụ: Phản ihig tạo thành axil do men lipaza xúc lác có thể dùng dung dịch đệm bicacbonal đế tạo thành CO 2 hoặc các phán ứng lạo thành nhóm amin tự do dưới tác dụng của peptid-hydroxylaza hoả, phán ứng có thê tác dung với axit nitơ và lạo thành khí nitơ (phương pháp Vanslke). Đế đo sự biến dối thế lích khí thường tiến hành phản ứiìg trong máy Varburg. 4.2.4. PHƯƠNG PHÁP P H ổ QUANG KẾ Phương pháp này cần lượng nguyên liệu nghiên cứu rất lì, có độ nhạy cao, cho phép xác định chính xác, nhanh chóng hoại độ của enzim. Vì vậy phương pháp này được dùng rộng rãi nhấi trong nghiên cứu enzim. Trong irirờng hợp phán ứng en zim k h ô n g làm biến đối rõ vết q u a n g p h ổ hấ p phụ cQng có thể sử d ụ n g phưcmg pháp phố quang kế bàng cách cho ihêm vào hỏn hợp phản ứng một enzim khác có tác dụng lên sản phẩm phản ứiig dế làm iliay đổi sự hấp phụ. 4.2.5. PHƯƠNG PHÁP CHUẨN đ ộ l iê n t ụ c Phương pháp này thường dùng để nghiên cứu các phản img enzini mà kêì quà của nó tạo ihành axit hoạc bazơ. Dùng thiết bị lự động thêm kiểm hay axil vào để giữ pH môi trường phản ứng cố định, dồng thời ghi đường cong biểu cliẻn lượng kiềm hay axit đã dùng. Tốc độ thêm kiềm hi\y axit đà dùng vào hỗn hợp phản ứiig phản ánh tốc độ phản ứng enzim. Phương pháp này còn có thể dùng nghiên cứu các oxydoreduciazii bằng cách đo thế oxy hoá khử. 4.2.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Phương pháp sắc ký trên giấy thường đùng để xác định hoạt độ các enzim phân giải hoặc chuyển hoá các axit amin (gluiam ai cacbonxylaza. alamin aminolransferaza...). Sau khi cho enzim tác dụng với cơ chất một ihời gian, lấy mộl 6R ít hỗn hợp pliản inig chấm lên giấy sắc ký \’à tiến hành sãc ký theo phương pháp thông thường, hoặc cho hồn hợp lẽn ináy axit amin tự động. Kết qua dịnh tính và định lirợng axit am iii còn lại hay mới lạo ihành trong phan ứng cho phép xác dịnh lioạt dộ của enzim. Phương pháp sắc ký đòi liò i thời gian dài hơn (vài giờ nhưng có lliế cho kết quả cụ thể tẽn \'à lirợng của các sản phấm được lạo thành, \'ì vậy thường được clùiig trong nghiên cứu enzim). 4.2.7. PHƯƠNG PHÁP HOÁ HỌC Phương pháp Iiày Uiường dìing các phan ứng hoá học khác Iihau đế dịnh lircíng các chất bị mất di hay tạo thành trong dung dịch dưới tác dụng của enzim. Các phản únig được tạo thành thường là các phán ứng màu đặc trưng như phản ứng biiire, phản ứng với thuốc thử fo lin của protein. Ngoài ra có thể dùng các phản ímg kliống đặc tiamg như phản ứng của đường khử với thuốc thứ íelling, phán ứng của axit \’ới bazơ. Nhìn chung đế xác địiih hoạt dộng cúa một enzim nào đó thường sử dụiig một trong các phương pháp kể trẽn, theo dõi hoặc xác định sự biến đối lượng cơ chất lioặc sản phám phản ứng sau klioảng thời gian xác dịnh dưới tác dụng inột lượng enzim nhất định. Tuy nhiên trong một số trườiig liợp cũng có thể tiến hành theo cách khác; ví dụ xác d ịn li thời gian cần ihiêì để tạo nôn mộl sự biến đối xác định cỉia cơ cliấi hoặc sàn phẩm phán i'mg dưới tác dụiig ciia một lượng enziin nhất định, hoặc ngược lại giữ tliờ i gian phản ứng cổ' dinh chọn nồng clộ enzim cần thiết để thu được một sự biến đổi xác clịiih của cơ chất hoặc sản phẩm phản ứiig. Tuỳ theo yêu cầu và diều kiện thí nghiệm cần lựa chọn phương pháp thích hợp và sử dụng IIÓ liợp lý ciể xác clịnh hoạt độ enzirn. Mírc độ hoạt động của enzim trong một chế phẩm là một thông tin quan trọng về lượng enzim trong đối iưựiig nghiên cứu, vì ràng trong những điều kiện nhất định, tốc độ phản lìmg do eiizim xúc tác tỷ lệ với lượng enzim có trong hỗn hợp phản ứng. Lượng eiư im ở đây không tính bằng mol hay m iligam mà dược biểu diễn bằng dơn vị hoạt độ enzim (U). Theo quy ước quốc tế, đơn vị tiêu chuẩn của enzim 69 là lượng enzim có khả năng xúc tác chuyển hoá một m icrom ol cơ chất sau 1 phút ở những điều kiện xác định cho trước. ITiông thường tiến hành xác định hoạt độ ở 30"c, với pH và nồng độ cơ chất thích hợp đổi với từng loại enzim nghiên ciru. Clìú ý: a. Trong trường hợp enzim phân giải mộl số liên kết của phân tử cơ chất, ví dụ proteinaza, amilaza với cơ chất linh bột thì đơn vị tiêu chuẩn của enzim không tính theo m icrom ol cơ chất bị chuyển hoá mà tính bằng micromol đương lượng của các nhóm tương ứng được tạo thành. Nói cách khác là không tính theo lirợng cơ chất bị chuyển hoá mà tính theo số liên kết (peptit hoặc glucozil) bị phân giải. b. Trong trường hợp phản ứng giữa hai phân tử theo kiểu A + B = c + D, thì đơn vị enzim xúc tác chuyển hoá 1 micromol cơ chất A hoặc một micromol cơ chất B, hoặc 2 micromol cơ chất A (hoặc B) nếu A =B sau một phút. c. K h i xác định hoạt độ enzim trong dịch ihể thì tính đơn vị enzim trên lOOOml dịch thể. d. Có thể dùng các ước và bội số thập phân của đơn vị để biểu diễn hoạt độ của enzim, ví dụ m ili đơn vị (m ư ), kilo đơn vị (kU). Nhờ có quy lắc thống nhất về đơn vị enzim mà ta có thể so sánh hoạt độ của các enzim khác nhau hoặc các chế phẩm khác nhau của cùng một enzim. Đ ố i với m ỗi chế phẩm enzim, ngoài việc xác định mức độ hoạt động của nó cần phải đánh giá độ sạch của chế phẩm. Hoạt lực riêng là đơn vị đặc trưng cho độ sạch của enzim. Hoạt lực riêng đều đánh giá hay biểu diễn bằng số đơn vị enzim irên Im g protein. Ngoài ra nếu biết chính xác trọng lượng phân tử của enzim có thể lính được hoạt độ phân tử của nó. Hoạt độ phân tử của enzim là số phàn tử cơ chất (hoặc số đircmg lượng của nhóm tương ứng) bị chuyển hoá dưới tác dụng một phân tử enzim sau một phút. Nếu biết được số trung tâm hoạt động độ trung tâm xúc lác. Nó là phân lử cơ chấi bị chuyển hoá sau một phút tính trên một trung tâm xúc tác. Nếu phân tử enzim chỉ có một trung tâm xúc tác thì đại lượng này irùng với hoạt độ phân tử enzim. 70 Nồng độ enzim trong dung dịch thường được bicu diễn băng số dơn vị hoạt động trên ỉm l dung dịch. 4.2.8. NHỬNG ĐỈỀU Lưu Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZIM Bản chất hoá học của enzim là protein nên enzim không bền vừng rất nhạy cảm với lác nhân lý hoá học. Vì vậy khi làm thí nghiệm \'ới enzim cần tránh các yếu tố có thể gây biến tính protein như nhiệt độ cao, pH quá axii hay kiềm, các kim loại nạng hay muối của chúng. Ngoài ra cần tránh tạo bọt trong dung dịch Vỉ m ội số enzim có thể bị kìm hãm trên bể inặl phàn cách. Để đảm bảo chính xác hoạt động enzim cần bảo đảm các điều kiện sau; a. Các diều kiện ỊDhản ứng (pH, nhiệt độ) phải ờ Irong giới hạn enzim có thể tồn tại bền vữiig và được giữ cố định trong suốt thời gian phản ứng trong dung dịch đệm với pH xác định, binh hỗn hợp phản ứng đặt trong máy siêu ổn nhiệt. Dung dịch cơ chất và enzim phải đạl đến nhiệt độ cần thiết trước khi cho vào phản ứng. Đối với các phản ứng lạo thành axit cẩn ước lượng dung dịch đệm ihế nào đế cho pH không bị thay đối nhiều. b. Phản ứng enzim được tiến hành trong điều kiện thừa cơ chất và coíactơ (nếu enzim cần thiết coíactơ). Cần tính trước lượng cơ chất thế nào dể sau khi kêì thúc phản ứng, cơ chất bị chuyển hoá không quá 2 0 % lượng bán đầu. tuy nhiên cũng cần chú ý rằng nồng độ cơ chất hay cofactơ quá lớn có thể kìm hàm enzim. Để xác dịnh nồng độ thích hợp cho phản ứng enzim có thể làm như sau: Xác dịnh tốc độ phản ứng với 1 nồng độ enzim xác định, sau đó tăng lượng enzim lên gấp đôi, nếu tốc độ phản ứng cũng lăng lên gấp hai lần có nghĩa là nồng độ cơ chất đã thích hợp và nồng độ phản ímg chi phụ thuộc vào lượng enzim. Kết quả xác định hoạt độ phản ánh đúng hoạt động xúc tác thực của enzim. c. Thời gian xác định hoạt dộ thường không quá lâu, thường là 5-30phiíl, lốt nhất là xác định tốc độ ban đầu của phản ứng (30-60 giảy) vì ở thời gian đầu phản ứng tốc độ iưưng đối ổn định sau đó bắt đầu giảm. Điều này do nhiều nguyên nhàn khác nhau như do sự giảm nồng độ cơ chất, do tác dụng kìm hãm của các sản phấm được tạo thành hoặc do enzim bị phá huỷ trong quá trình phản ứiig. Trong một số trường hợp, hoạt độ của enzim quá thấp có thể kéo dài thời gian ủ enzim lên đến 1 giờ hoậc lâu hơn nữa. 71 K lii xác dịiih hoạt độ enzim bên cạnh mảii thí nghiệm (enzim tác dụng với cơ chất) cần làm mẫu kiểm Ira. trong đó enzim đã bị mất hoạt dộng trước kh i tiếp xúc với cơ chất, bàng cách đun sôi dung dịch enzim trước khi cho vào hỏn hợp phàn i'mg. Hoạt độ cũa enzim được tính bằng hiệu sỏ' lượng cơ chất hoặc lượng sản phám phản ứng... giữa mầu thí nghiệm và kiểm tra. 4.2.9. CHUẨN BỊ DUNG DỊCH ENZIM ĐỂ x á c đ ịn h h o ạ t đ ộ x ú c t á c Dung dịch enzim cần được loại hết tế bào vi sinh vậy hay cơ chất nuôi cấy nó, chứa nó thường có hai loại: Enzim ngoại bào: nếu vi sinh vật nuôi trong m ôi trường lỏng, sau khi nuôi cấy ly tâm lạnh môi trường ở 500-600 vòng/phút để nhận được dung dịch trong suốt. Nếu vi sinh vật nuôi bằng phương pháp bề mặt sau khi nuôi cấy, cân 10-20g môi trường, chiết rút bằng dung dịch đệm tương ứng pH xác định dê enzim có tliê tồn tại bền vững. Lượng dung dịch đệm dùng để chiết rút gấp 10-20 lần đối trọng (khoảng 200ml). Lọc dịch nhận được qua giấy lọc xếp được ly tâm để nhận được dung dịch trong suốt. Enzim nội bào: Trước hết cần phá vỡ màng tế bào vi sinh vật. Để phá vỡ màng tế bào có thế dùng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp cơ học dùng siêu âm hoặc dùng enzim. Tuy nhiên cần chọn phương pháp thích hợp sao cho không ảnh hưởng đến hoạt động của enzim nghiên cứu. Tiếp theo chiết n it và lọc để nhận được dung dịch trong suốt. 4.3. THỰC HÀNH Enzim rất đa dạng về chủng loại và được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp nên số lượng các bài thực hành vể xác định hoạt độ enzim rất phong phú. Những thí nghiệm đại cương về enzim hay chuyên sâu có thể tìm thấy ở các tài liệu Thí nghiệm Hoá sinh rông nghiệp hay Thí nghiệm chuyên ngành công nghiệp lên men. Trong khuôn khổ giáo trình này chúng tôi chi nêu một số bài thí nghiệm hay 72 dùĩig đế kiêm tra chất lượng cua bán íliành pliâm hay thành plìấm Irong còng nghiệp chế hiến ihực phám. 4.3.1. ENZIM PROTEOLITIC Vé nguyên tác, enziin proteolitic xúc lác cho phán ứng ihủy phân các lièn kết peptit; R -C ll-C O -N H -C H R ' + H .o ^ R C Il-C O O H + H ,N -C 1 IR ’ Nói chung các cnzim thuộc nhóm nàv có lính clìuvến hoá cao đến vị trí của liên kết pcplil, bản chất các axil amin iham gia trong ỉién kết peptil, nhiều enzim proteolitic còn có thế xúc lác phán ứng thiiý pháii liên kết este, liên kếl amit và phản ứng chuyển vị gốc axii ainin. Vì vậy để xác định hoạt độ nhiều enzim proteolilic có thế dùng nhiều loại cơ châì khác nhau; các prolein hoặc peptit tư nhiên hoặc tổng hợp, các esle và axil cùa axii amiiì. T iiy từng loại enzim cán chọn cư châì thích hợp. Sau dáy là nìộl so plurơng pháp Ihirờng dùng đế xác định hoạt dộ mội số enzim proteolitic. Bài I : Xác dịnh hoạt độ phân giải protein bànị* phương pháp chuẩn độ Fonìiol a. N û yè n ĩắ c Theo mức dộ thủy phân prolein, nhóm cacboxvl và amin (NH 2 ) tự do trong dung dịch tăng lên dán, do đó có thế dựa vào sự tang một trong các nhóm này dế xác dịnh hoạt độ enzim. Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng tbrmol bao Vày nhóm amin và chuấn dộ nhóm cacboxyl bàng dung dịch kiềm có nồng dộ xác clịnh. Từ lượng kiềm đã dùng dế chuán độ lưựng m iligam dạm amin tưưng ứng. Phản ứng chủ yếu: H R— c — COOH + HCHO •COOH + H,0 N=CH2 NH2 H R— c H R— c- COOH + NaOH N=CH2 H R— c — COONa + HÔ N=CH2 73 Hoạt động enziin ở đây được tính bằng m iligam đạm amin được tạo thành sau 1 giờ ở điểu kiện nhiệt độ và pH xác định, cũng có thể tính bằng đơn vị hoạt động enzim. M ột đơn vị hoạt động là lượng enzim mà sau 1 giờ ở 4 0 "c và pH thích hợp có thể phân giải proteiii tạo thành 1 mg đạm amin b. Hoá chất: - Dung dịch đệm có pH thích hợp cho từng loại enzim. - Dung dịch gelatin 2%: càn 2g gelalin sạch, ngâm trong cốc thuỷ tinh với 15-20ml nước cất trong 30phiìt, sau đó cho 25-40ml dung dịch đệm và đun cách thiiỷ ở 70-80"C khuấy đều bằng đOa thuỷ tinh cho đến khi hoà tan hoàn toàn, thêm dung dịch đệm vào lOOml. Dung dịch có thế giữ trong tủ lạnh 2-3 ngày. Trước khi dùng đun nóng đến nồi cách thuỷ cho đến 40"c - Dung dịch thymolphtalein 1% trong cồn 50% - Hỗn hợp íormol: Cho Im l dung dịch thym olphtalein vào 50 m l dung dịch íorm ol 40% cho vài giọt dung dịch NaOH 0,1N đến khi có màu xanh nhạt. c. Tiến liâiìli Chuẩn bị 2 bình tam giác lOOml. Bước 1 (thí nghiệm) cho vào lOOml dung dịch gelatin 2% trong dung dịch đệm có pH thích hợp cho hoạt động tìmg loại enzim, thêm 5ml dung dịch proteinaza, lắc đều giữ ở nhiệt độ 40"c trong Igiờ. Sau 1 giờ lấy bình ra khỏi tủ ấm, thêm lOml hỗn hợp form ol và chuấn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu xanh da trời. Bình 2 (kiểm tra) cũng làm như trên nhưng cho dung dịch íorm ol vào với gelatin, lắc đều rồi mới cho dung dịch enzim vào ở diều kiện này enzim bị kìm hãm hoàn toàn, sau đó cũng tiến hành chuẩn độ song song với bình thí nghiệm cho đến khi có màu xanh giống ở màu của binh thí nghiệm. d. Tíiili kết quả Hoạt độ phân giải protein của Im l dung dịch nghiên cứu là: Hdp = (a - b).l,42 .f/(t.v) đơii vị 74 trong đó: a: sô' ml dung dịch NaOH O.IN dìing đế chuẩn dộ bình thí nghiệm; b: số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng chuẩn bình kiểm tra; f: hệ số chỉnh lượng dung dịch NaOH 0, IN; l: thời gian enziin tác dụng (giờ) ; v: thể tích dung dịch enzim đã dùng (m l) ; 1,42: Là số mg đạm amin tương ihig với 1 ml dung dịch NaOH 0, IN. Dựa trên nguyên tắc của phương pháp nêu trên, hiện nay các chế phấm enzim hay gặp thường được xác định theo một số phương pháp đơn giản hơn và có cải tiến. Chế phẩm enzim proteaza dùng trong sán xuấl, từ nấm mốc theo phương pháp bề mặt. Hoạt độ proteaza (Hđp) là khả nâng xúc tác thủy phân protein đến peptit và axit amin. Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định hoạt độ proteaza của các chế phẩm enzim. Sau đây chúng tôi xin giới tliiệii vài phương pháp hiện được áp dụng nhiều ở nước ta. lỉài 2: Xác định hoạt độ phán giải protein hằng phương pháp Vintette và Vanxmit íi. Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở xác định nhóm cacboxyl của peptit và axit amin được tạo Ihành do thuỷ phân protein. Theo phương pháp này, một đơn vị hoạt độ proteza là lượng enzim có khả nàng xúc tác thuỷ phủn protein để tạo ra Im l đạm amin trong Ig iờ ở điều kiện 4 0 "c và pH thích hợp (7,38 hoặc 4,49) b. Hoá chất Chuẩn bị dung dịch đệm từ các dung dịch sau dây: - Dung dịch Na 2HP 0 4 : Cân 1 1,876 gam rồi hoà tan thành llí t - Dung dịch K H 2PO 4: Cân 9,087 gam rồi hoà tan th à n h l l i t 75 ' Muốn có dung dịch đệm pH = 7,38 ta lấy 8 ihế tích dung dịch NÌI2HPO 4 hoà lẫn 2 the tích dung dịch K H 2PO4. - Muốn có dung dịch dệm pH 4,49 ta lấy một thế lích dung dịch jNa2HP (34 hoà lẫn \'ới 9 ihể tích dung dịch Na 2FỈP0 ^ - Dung dịch gelatin 5%: Cân 5 gam gelatin vào cốc nhò rói làm t r ư ơ n g với 15-20ml nước trong khoang 15phút. Sau đó thêm vào 20-25 m l dung dịch dệm có pH thích hợp (với nước chấm lấy dung dịch có pH = 7,38) rồi dun tới 70-80"C. Khuấy cho tan rồi rói vào bình định mức lOOinl. Tiếp theo lại cho dung dịch đệm vào phần chưa lan và làm lương tự cho đến khi geỉatin tan hoàn toàn. 'ĩấ t cả chuyến \'ào bình định mức lOOml làm nguội tới 20”c rồi ihêm dung dịch đệm đến ngấn bình. Dung dịch này có thể bảo quản 2-3 ngày ở nhiệt độ 2-5‘t “ Dung dịch thimolphtalein ì% trong cón 90% - Dung dịch NaOH OAN - Dung dịch chiếl enzim; cân 10 gam chế phám nấm mốc, nghiền nhó trong cối sứ hoặc ih iiỷ tinh với ít cát và 5ml nước. Tiếp theo cho iOml dung dịch đệm chuyến vào cốc thêm 85 ml nước (tổng cộng ỈOOrnl) và giữ ở nhiệt dộ 30''c trong nửa giờ và đem lọc* c. Tiến lià iỉli Dùng pipet lấy 10 ml cÌLing dịch gelalin cho vào ống nghiệm, xong dặl vào nồi cách thuỷ có nhiệt dộ 40"c. Sau 10 phút ta cho vào ống nghiệm 2 ml dung dịch chiết enzim, lắc đều và lấy ngay 1 ml hỗn hợp cho vào bình tam giác lOOml dã chứa sẩn 20ml cồn 96% và 6 giọt thiinolphlalein. Lắc dều rồi clìLián độ bằng dung dịch NaOH 0,19í dến xuất hiện màu xanh da trời. l ỉỏn hợp còn lại giữ thôm 3 giờ ờ nliiệl dộ 40"c. Sau đó lấy ra Im l cho vào bình tam giác chứa sẩn 20ml cồn 96% và 6 giọl thimolphtalein. Tiếp theo đem chuán bằng (lung dịch NaOH 0,1% đến xuất hiện màu xanh da trời. d. Tínlì kết quả Hoại độ proleaza tính theo cồng thức: Hđp = (a-a„).v.l,4/(l.n.), đơii vị/g 76 irong dó: a, Uí,: số ml dung dịch N aO lỉ 0,1N tiêu hao trong ih í nghiệm trước và sau ohàn img men; \'; thể tích hồn hợp phan ứng { 12 ml); 1,4; sổ ing dạm amin tương ứng với Im l dung dịch NaOH 0 ,lN ; t: thời g ia n phả n ứng ; n: số gam chế phám men tham gia trong phản ứng ; n = 1 0 .2 / 1 0 0 = 0 ,2 gam. Nếu ih í nghiệm liến hành \'ới những dicLi kiệỉi cụ thế trôn thì la cớ hoạt độ proteaza Help == (a-a„) .12.1,4/(3.0,2) = 28 (a-Uo), đơn vị/g Bùi 3: Xác dịnh dộ làm dóng sửa (ỉ. N,iĩiiycti ỉác Eìn/.im proteolelic có khả nũng làm dòng sữa inạnh nhấl là renin có trong dạ dày bê con dã biết từ lâu. Tuy Iilìiên Iigiiỵẻn liệu nay không du cung cáp enzim cho kỹ n g h ệ làm p h o m a t. Vì vậy m a y chục năm gán dá y người ta ngh iên cứu d ù n g CÍÍC proleinaziì thực vật \'à vi sinh vặi dế thay thế reiìiii. Ẩiì Độ dang dùng các proleiiuiza thực vật đặc biệt là enzim cứa Piciis-carica ĩrong sán xiiảì íbniat. 'l\iỵ nhiên khi dùng proteinaza của thực vật, phomal thường có \'Ị dắiìg vì vậy hiện nay người la chiì ý nghiên cứu sứ dụng proleinaza vi sinh vật, Irong dó proteinaza lừ Miicoì' pusilus Liỉiílí có lìoại dộng làm dông sữa khá niạnlì nên còn gọi là Miicor reiỉiiì. Xác dịnh hoạt độ làm dòng sừa cần ihiết vào thời gian cần thiết đế làm đòng dung dịch sữa dã loại mỡ, có nồng dộ xác dịnh. Để so sánh hoạt dộ làm đông sữa của các chế phẩm khác nhau dùng lích số lượng enzim (E) và thời gian (t). Lượng enzim tính bàng m iligam , ihời gian líntì bằng phúi hay giây. Tích số Et càng lớn, hoại động càng yếu. h. líoâ chất Dung dịch bột sữa đà loại mỡ 10% trong CaCl2 0,01 M 77 c. Tiến hành Cho 0,5 ml dung dịch enzim vào ống nghiệm dung tích 25 m l, thèm 5ml dung dịch sữa 10% trong CaCỈỊ 0,0 IM . Tất cả các dung dịch phải đạt 35"c truớc khi trộn vào nhau. Tiếp tục giữ ở 35"c, ghi thời gian tạo thành kết tủa protein của sữa. Dung dịch enzim cần pha loãng thế nào để thời gian làm đông sữa vào khoảng 5 phút. d. T í n h k ế t c/uả Đơn vị hoạt độ là lượng enzim mà trong điều kiện thí nghiệm này làm đông dung dịch sữa trong 1 phút tương đương 400 đơn vị. Hoạt độ riêng là số đơn vị trên m iligam protein. Chú ý a. Để xác định được chính xác thường làm 3 ống nghiệm song song, thêm renin vào mỗi ống nghiệm cách nhau 1 phút, lắc cấn thận, quan sát ống nghiệm vào theo dõi đồng hồ bấm giây để ghi thời gian. Thời gian làm đông sữa ở 3 ống nghiệm phải cách nhau không quá vài giây. b. Trước khi làm thí nghiệm phải làm thí nghiệm sơ bộ để tìm độ pha loãng thích hợp của dung dịch enzim sao cho thời gian làm đông sữa vào khoảng 5 phút. c. Để dễ quan sát, chuẩn bị ống nghiệm nhỏ hơn và đimg mực đỏ pha loãng đặt vào ống nghiệm lớn hơn và ghi thời gian từ khi cho dung dịch enzim vào đến khi xuất hiện kết tủa trên nền đỏ. 1. Hoạt độ các chế phẩm proteaza có nguồn gốc nấm mốc và vi khuẩn thường được xác định ở các trị số pH sau: pH = 2,5 ± 0,2 đối với proteinaza axit pH = 5,5 ± 0,2 đối với proteinaza hơi axit pH = 7,2 ± 0,2 đối với proteinaza trung tính pH = 9,5 ± 0,2 đối với proteinaza kiểm 2. Dung dịch enzim 2a - Đ ối với proteinaza axit: (pH của hỗn hợp phàn ứng là 2,5 ± 0,2): cân Ig chế phẩm phản ứng trên cân phân tích, chà cẩn thận chế phẩm bàng que thuỷ tinh 78 trong cốc nhỏ với một một ít dung dịch clệm vạn năng 0,1 M pH 2,5. Sau đó chuyển toàn bộ vào bình định mức dung dịch 1 0 0 ml và thêm đung dịch đệm này đến vạch mức. Nếu muốn pha loãng dung dịch enzim thì cũng dung dịch dệm vạn năng 0,1M , pH 2,5 để pha loãng. 2b. Đ ối với loại proteinaza hơi axit: (pH hỗn hợp phản ứng là 5,5 ± 0,2): cân 0,1 - Ig chế phẩm nghiên cứu trên cân phân tích, chà tiếp chế phẩm trong cốc nhỏ bằng que thiiỷ tinh với một lượng nhỏ dung dịch đệm vạn năng 0,1 M, pH 5,5. Sau đó chuyển toàn bộ vào bình định mức 100 ml \ à dùng dung dịch đệm này pha đến vạch 1 0 0 ml. 2c. Đối với loại proteinazíi trung tính; (pH cỉia hỗn hợp phản ứng là 7,2±0,2). Cân 0 ,1 -lg chế phẩm nghiên cứii và chà kỹ trong cốc nhỏ bằng que thuỷ tinh với một ít dung dịch đệm vạn năng 0,1 M , pH 7,2±0,2 . Chuyển toàn bộ vào bình định mức 100 ml rồi pha dung dịch đệm này đến vạch mức. Pha loãng dung dịch enzim tiếp bằng dung dịch đệm vạn năng 0,1 M , pH 7,2. 2d. Đ ối với proteinaza kiềm tính: (pH của hỗii hợp phản ứiig 9,5±0,2). Cân 0 , 1- lg a m chế phẩm nghiên cứu và chà cẩn thận trong cốc nhỏ bằiig đũa thuỷ tinh và cho ít dung dịch đệm vạn năng 0,1 M , pH = 9,5 chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 m l rồi thêm dung dịch đệm đến pH 9,5 tới vạch mức. Pha loãng tiếp theo dung dịch enzim cũng bằng dung dịch đệm vạn năng này. 3. Dung dịch cazeinatnatri (pH = 2.5) 3a. Đ ối với proteinaza axit (pH = 2,5): cân 2g cazeinatnatri khô và hoà tan trong 90ml dung dịch đệm 0,01 M pH = 5,5. Sau dó đưa pH của dung dịch xuống 2,5 bằng cách thêm vào 3,0-3,5 H C l 1 N. Khi Iixit lìoá dung dịch cazeinatnalri bằng axit clohyđric xuống thấp hơn 5,1 (pH< 5,1) thì dung (lịch bị vẩn đục chút ít (tạo thành các váng nhỏ), còn ở pH = 4,8 sẽ có các váng lớn lắng xuống và hỗn hợp phân thành 2 pha kết tủa và dung môi. K hi axit hoá tiếp tục, dung dịch cazeinatnatri bằng HCl cho tới pH = 3,1-3,2 thì các váng lắng bị hoà tan dần và ở pH = 3,053,00 lại thu được dung dịch đồng nhất và khi pH = 2,5 hoặc pH < 2,5 ta vẫn được dung dịch đồng nhất. 79 Vì vậy phải tliè'm HCl ihại nhanh cho tới pH = 3 và kliuấy mạnh liên lục dung dịch, tiếp đó thêm lừng giọt dung dịch cho tới khi dung dịch có pl 1 = 2,5. Cuối cùng chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức dung tích lOOinl và dung dịch đệm vạn năng 0,1 M pH 2,5 cho tới \’ach mức. 3b. Đối với proteinaza liơi axit (pH = 5.5) Hoà tan 2 g cazeinatnatri khô trong 90 m l dung dịcli đệm van nâng 0,1 M có pH = 5,5. Thêm một vài giọt dung dịch HCl 1 N dể đưa pH của dung dịch cơ chấl về 5,5. Sau đó chuyên toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml \’à thêm dung dịch đệm 0.1 M pH 5,5 cho đến vạch. 3c. Đối với proteinaza trung tính (pH -- 7,2) Hoà lan 2g cazeinatnatri khô vào 90ml dung dịch dệm \'ạn nàng 0,1M có pH = 7,2. Nếu pH của cơ chất < 7, thì thêm từng giọt NaOH IN cho tới pH = 9,5. Chuyển dung dịch sang bình định mức lOOml và thêm dung dịch đệm O.IM pH 9,5 đến vạch. Để rút ngắn thời gian hoà tan c;izeinatiiatri người ta plia duiig dịch cơ chất ở 70"c irêii máy khuấy từ. 'rhời gian bảo quản dung dịch cazeiiialnatri 2% trong tủ lạnh không quá 2 ngày. 4.3.2. KIỂM TRA HOẠT ĐỘ CỦA CÁC CHẾ PHẨM ENZIM AM ILAZA TRONG CÒNG NGHIỆP Bài 4: C h ế phẩm nấm mốc dùng trong sản xiiăt rượu a. N ịîiycîi tắc Trong sản xuất rượu người ta thường đánh giá c h ít lượng của các chế phẩm nấm mốc theo các chỉ số sau: hoạt độ amilaza, malt;iza, gliicoamilaza, và dcxtriiuiza. ở ta hiện nay chỉ đánh giá theo hệ số Linơ. Chi số này có thè dùng dể so sánh chấl lượng của chế phẩm sản xuất ra trong tìmg ihời kỳ và ở các nơi khác nhau nhưng chưa phản ánh đầy ciủ bản chất của liệ enziin dường hoá tinh bộl. Phương pháp xác định chi số Linơ còn nhiều chỗ chưa hợp lý và chưa có quy định thống nhất, vì thế trong tương lai gẩn cần cải tiến \'à dùng các phương pháp phù hợp chính xác hơn. 80 lio ạ t độ amilaza có thê đánh giá theo một irong hai phương pháp so màu sau đây. So màu hằng nuìt thường 1 'heo phương pháp này người ta dánh giá hoại độ amilaza theo khả nãng ihuý phàn tinh bột của enzim chứa trong Ig chế phám đến sán phâiĩi không cho màu với iod \ ’à biếu diễn bàng đơn vị. Đơn vị hoạt động amilaza là lượng men có khả năng phân giải Ig tinh bột tan thành siìh phám không cho màu với iod trong thời gian 1 g iờ và ở điều kiện nhiệt độ 30'’c , pH = 4,7-4,8. I b. Hóa clỉấỉ Pha dung dịch đệm axetat natri 1 ' Dung dịch axii axeiic IN : lấy 57,25 ml (hoặc 60,12g) axit axetil' tinh khiết Ị rồi pha thành Hít. I “ Dung dịch axetat natri IN : Cân 82,09g axetat natri rồi hoà thànlì 1 lít dung í dịch. ị 1 - Dung dịch đêm pH 4,7-4 ,8 nhận được khi pha 2 dung dịch trên lệ 1:1 - Dung dịch đêm pH = 6 nhận được khi pha một thể tích axit assetic với ỉ 6 ih ể tích a x e ta t nalri. Ị I DUng dịch tinh bột 1%. Cân l , lg tinh bột vào cốc, sau đó cho ml nước lạnh và lắc đều rồ i cộng thêm khoảng 30ml nirớc nóng 50"c. Khuấy đềulrồi đặt vào đun cách th iiỷ cho đến khi tan hoàn toàn. Để nguội rồi chuyển toàn tịộ vào bình định mức lOOml sau đó cộng thêm lO iĩil dung dịch đệm axetat có pH =14,7-4,8 rồi dổ dầy nước cất đến ngấn bình (trường hợp xác dịnh hoạt độ amilaza c ỉiị chế phấm vi khuẩn thì lấy 1 0 m l dung dịch đệin có pH = 6 ). I Dung dịch iod: cán 4,4g K i và l,4g I 2 tinh thể. Sau đó cho tất c|i \’ào lọ và cộng thôm 20-40m l, khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi címyểB l ^ - l ỉ ộ vào bình định mức lOOml và thêm nước cất tới ngấn bình. Dung dịch này được gọi là dung dịcli iod cơ bản, cần dược bảo quản trong bình mầu nâu và đặt vào chỗ tối. Dung dịch có thể bảo quán và dìing trong 3 tháng. Dung dịch iod phãn tích dược chiiấn bị 81 từ dung dịch cơ bản trước khi đem dùng. Lấy 20ml dung dịch cơ bản cho vào cốc đà chứa sẵn 4,4g K I hoà cho tan hết rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức lOOml. sau đó thêm nước cất tới ngấn binh. Dung dịch có thể sử dụng trong 15 ngày. c. Tiêíì lỉàỉìlì Chuấn bị dung dịch enzim: cân 5g chế phẩm nấm mốc rồi dem nghiền nhỏ với cál hoặc thuỷ tinh liếp theo hoà với lOml dung dịch đệm và 90 m l dung dịch nước. Chuyển toàn bộ vào cốc hoặc bình lam giác và giữ ở nhiệt độ 30“c trong 30 phút. Tiếp theo đem lọc qua giấy, nước trong thu vào cốc khô và dùng nó để xác định hoạt độ amilaza. Dùng pipet lấy 25 ml dung dịch tinh bột cho vào bình tam giác lOOmK sau đó cộng thêm 20ml nước cất và 5m! dịch men amilaza. Lăc dều và giữ ớ nhiệt độ 30“c (trước khi tiến hành cần giữ nhiệl độ của tấl cả các dung dịch ớ 30'’C). Sau 10 phiil la bắt đầu thử màu với iod bằng cách lấy 1 giọt dung dịch ihuỷ phân cho vào tấm sứ tráng rồi nhỏ dung dịch iod vào. Ta làm liên tục thừ màu như vậy cho đến khi dung dịch thuỷ phân không làm đổi màu của dung dịch iod. Đánh dấu ihời gian từ khi cho dịch amilaza vào cho đến khi thuý phân đến sản phám không cho màu với iod. Thời gian này phải trong khoảng từ 10-20 phúl. Nếu nằm ngoài giới hạn trên thì cần ihay đổi số m l dịch men cho phìi hợp và làm lại thí nghiệm. Chú ý là lượng nước cất cộng với dịch amilaza phải luôn bằng 25, còn thể tích dịch ihuỷ phân phải bằng 50ml. Hoạt độ amilaza sẽ tính theo công thức sau: aXX aX T trong đó: 0,25: lượng tinh bột chứa Irong 25 ml dung dịch (gam); a: lượng chế phẩm nấm mốc tương đương với số dịch amilaza đưa vào (gam); x: thời gian thuỷ phàn (phút); 60: hệ số chuyển thành giờ. 82 \ / (lụ\ Lấy 25inl dung dịch linh bộl cộng với 20 ml nước cất và 5ml dịch ainiỉaza (tương dương 0,25 gam chế pliáin nấm mốc). 7‘hời gian (huỷ phân 20 phút. Như vậy hoại dộ amylaza sẽ bảng: ^ _ 0 ,2 5 x 6 0 HdA = - = 3 dơn V /g 2 0 x (U 5 Sau dó cần nhân với 100/( IOO-\V) đế quy về Ig chất khô luyệi đối (W là độ ám cLÌa c h í phẩm nấm mốc). Phương p h á p so m à u b à n g mắ t llurờng có ƯLI diể m đơ n giản nhimg ké m chính xác. VI thế hiện nay ít dùng cho nghiên cứu nhưng dùng so sánh, xác định sơ bộ hoạt lực nhanh hơn. Phương p h á p so màu bằng diện qiưing sắc ké a. Nguyên tàc 'ĩheo phương pháp này thì inột đơn vị hoại dộ amylaza dược biểu diẻn bàng lượng men có khá năng xức tác thuý phàn Ig tinh bột irong 1 giừ ờ diều kiện nhiệt độ 30"c và pH 4,7-4, 8 . Đồng ihời phải dám bao tý lệ giữa enzim và đối chất sao cho sau 10 phút lượng tinh bột đirợc thuý phân vào khoảng từ 20-70% . b. Hoủ clỉấĩ - Dung dịch amylaza, dịch tinh bột vù dung dịch đệm chuán bị lương tự như trong phưưng pháp so sánh màu bàng lĩiat thường. - Dung dịch iod: cân 0,25g iod và 2»5g K I cho vào cốc lOOml. Sau đó cho ùr từ 5-lOm l càì khuấy cho tan hê't rổi chuyên toàn bộ vào bình định mức lOOml và thê m nước cất tới n g ấ n bình. D u n g dịch cần dược bà o cỊuản trong binh m à u nâu và bao quản chỗ tổi. Trước khi làm thí nghiệm ta chuấn bị dung dịch iod phân tích bằng cách lấy 2 ml dung dịch cơ bản pha thành lOOml. Dung dịch này khi do trèn máy so màu quang diện phủi có mật độ quang học vào khoảng D = 0,160±0,01 (với chiều dày CLivct = Ic in, k ín h lọc s á n g c ó bước sóng = 4 53 nm). -D u n g dịch HCl 0,1 N 83 c. Tiếỉì IỉòiìIì: Lấy 2 ống nghiệm (cỡ 18x180) khô và cho vào mỗi ống lOml dung dịch tinh bột 1%. Đặt cả 2 ống vào máy điều nhiệt và giữ ở nhiệt dộ 3()"c khoang 10 phút, sau đó dùng pipel, cho vào ống nghiệm (1) 5ml nước cất (mẳu kiếm chimg), ống nghiệm (2 )ị-^ t--d ịc h umilaza (máu ihí nghiệm). Khuấy idiaiìb và lOphút. Tiếp theo lỊíy Im l của mẫu kiểm chứng cho vào ống nghiệm (3) chứa sẵn itoinl HCl 0 J N. Tirơrịg iư cũng lấy 1 m l của mảu thí nghiêm cho vào ống nghiệm (4) ichứa sẩn 10 ml dunậ địch HCl 0,1N. M ục đích là để ngừng hoạt động của enzim ậ iữ đúng thời gian pạản ứiig là 10 phút. Khuấy đều dung dịch trong ống nghiệm (3) ị ầ (4) rồi từ đó mỗi ặng lấy ra Im l cho vào các ống nghiệm (5) ( 6 ) đà chứa sẵn lOml dung dịch iod phân tích (chú ý pipet phải riéng biệt đế tránh sai số). Lắc đều rổỊ dem đo mạt độ quíiịttg học trêm máy so màu với chiều dài lớp chất lỏng là 1 cm và kính lọc sóng có bư(fc sóng X = 656nm. i Mậl ịlô quang học của dung dịch kiểm chứng ứng với lượng tinh bột Ịban dầu, còn mật đệj quang học của dung dịch thí nghiệm sẽ ứng với lượng tinh b^t còn lại sau khi ihuỳ phân. Hiệu số mật độ quang học giĩra dung dịch kiểm chứiigỊvà dung dịch thí ngậiệm sẽ tương ứng với lượng tiiih bột đà chịu tác dụng của amyl|^za. d. T íhìỉ kết quả I LượỊig tinh bột đã được thuỷ phân sẽ tính theo công thức: ' c = ! ị D,-D, D trong đó: ! D ị’. ĩitót độ quang học của dung dịch kiểm chứng; D^: nfật độ quang học cùa dung dịch thí nghiệm; 0 , 1 : lUỢng gam tinh bột chứa trong 10 m l dung dịch 1 %. Hoạt độ amilaza được tính theo công thức: H d A .li2 5 4 x C - 0 ^ ^ ^ trong đó: n: lượng chế phẩm nấm mốc tương ứng với 5ml dịch amylaza (gam). 84 Ị 1 / dụ: khi phân tích ta cân 5 gain chế phám nấm mốc có dộ ấm 44% và pha thành lOOml. Sau dó lấy 2m l dịch lọc pha thành 50ml. Như vậy troiig ĩ> ml sẽ chứa: 3 - - X 00 50 5 -O .O lg Kbi xác định mật độ quang học trên máy so rnấii ta nhận dược = 0,702, = 0 ,3 i2 Da đó 0.1 =0,04694 0,720 ) Hiịỉạt độ amylaza sẽ bằng; _ 7,264x0,04694x0,03766 , H dA = ---------------- — ----------------- = 30,33 đv/g 0.01 NỊếu tính theo chất khô tuyệt đối thì: H dA = 30.33 X 100 = 54,I6đv/g 1 0 0 -4 4 I BiỊiig thực nghiệm người ta đã tính được rằng H dA theo phươn|| pháp này thường hơn khoảng lừ 4,5-5 lần so với hoạt độ amylaza nhận được tlteo phương pháp so k à u bằng mắt thường. Zíệi 5 ; X ác định hệ s ố LŨIƠ ịLineur) a.'Nguyên rắc 'ị lệ ệ n nay irên các nhà máy rượu của ta chi dánh giá chất lượng chế pliấm nấm m ố Ì theo hệ số Linơ. Dưới đây cliúng tôi xin giới thiệu phưcmg hệ sô' L iiỊơ mà chúng ta đang thực hiện nhưiig có cải tiến đôi chỗ. xác định Ị b.lH oáchẩi í D|ung dịch tinh bột 2%: cân 2,2g tinh bột (có trừ bớt độ ẩm 10%j trong cốc khô, xong~cTl0 v?io ít nước lạnh khuấy đổu rồi đổ thêm khoảng 50ml nước nóng và đun cách thuỷ (có tliể trên bếp diện) cho đến hoà tan hoàn toàn. Tiếp đó làm nguội rồi chuyển hết vào bình định mức lOOml, tráng cốc 2-3 lần bằng nước cất tới ngấn bình (hiện nay ở các nhà máy không cho dung dịch đệm). 85 Dịch chiết men: cân 5g chế phẩm nấm mốc, xong nghiền nhò với ÍI th iiỷ tinh vụn rổi chuyến toàn bộ vào bình định mức lOOmK Iráng sạch cốc nhiếii ỉấn và dố vào bình. Tiếp theo cho vào lOml dung dịch độrn axetat natri rồi llìêm nước cất lới ngần bình. Đậy núi rồi đặt vào nồi cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 5 5 "c trong 30 phút. Sau dó đem lọc vào cốc khò và dùng để thuỷ phân linh bội. - Dung dịch KO H hoặc NaOH 2,5N - Dung dịch methylen xanh 1% -D u n g dịch HCl ỈN - Dung dịch íerixyanua kali: cân 12 gam K^Fe(CN)f, và hoà ihànli 1 hì. Trước khi sử dụng ta cần chuẩn lại nồng độ, của dung dịch và làm như sau: Lấy 20 inl dung dịch íerixyanua 1,2% cho vào bình tam giác 250ml. Tiếp dó dùng ống đong cho vào bình khoảng từ 5-6 m l K O H hoặc NaOH 2.5N và 2-3 giọt methvlen xanh. Trước đó cần chuấn bị dung dịch đường glucoza hoãc frucioza 0,5%. Dung dịch này dùng làm chuán nên phải pha từ đường linh khiêì hoá học và cản chínlì xác 0,5000g xong pha thành 100 ml trong bình định mức. Đặt binh lam giác (có chứa các hoá chất kế trên) lên bếp diện, đun sao cho sau 2-3 phút thì sôi. Khi dung dịch bát đầu sôi ta dùng buret hoặc pipet nhò dịch đường 0,5% cho vào đến khi lĩiấ i màu của methylen xanh và dung dịch irở nén màu vàng nhạt. Nếu kếl llulc phản ứng mà lượng dịch đường tiêu hao là 5,00ml thì ta bảo 20ml lerixyanua kali urơng ứng với 5x5=25 mg glucoza. Nếu sổ dung dịch đường khác 5ml thì cần tính cho hệ số sai lệch để đưa vào công thức xác định hệ số Linơ. c. T iế ỉì l i à ỉ i l i Dùng pipel hút 20ml dung dịch linh bột 2% cho vào bình lam giác ỈOOml (không nên dùng bình lớn hơn) sau đó đạt bình vào nổi cách thuỷ và giữ ở nhiệi dộ 56*’c sau 10 phút ta dùng pipet cho vào bình 2ml dịch amylaza, lắc nhẹ và n ili kín rồi giữ hổn hợp ở nhiệt độ 55“c trong 30 phút cho ai-nylaza hoạt động. Đổng thời cần chuẩn bị nước sôi bên cạnh và sau phiít thứ 30 ta nhúng bình vào nước dang sôi 10-15 phút để ngừng hoạt động amylaza. Tiếp đó đem làm nguội bình và dung dịch thuỷ phân này để chuẩn 2 0 ml kali íerixyanua (làm tương tự khi chiiấn dịch đường ở trên). Mặt khác ta làm thí nghiêm kiểm chứng để irừ bớt lượiig chất khử chứa trong dịch amylaza. Để xác định ta cũng lấy 20ml íerixyaniia kali vào bình tam giác 86 250ml xong thêm 5-6ml KO H và 2 đến 3 íĩiọt mcthylen xanh. Đạt bình trên bếp điện và đun sôi, tiếp theo nhỏ dịch thiiỷ phân hoặc dịch amylaza phản ihig cho đến khi mất màu xanh của meihylen xanh. cl. Tính kết quà í lệ số L in ơ tính iheo công thức: . 1.. Hs = — X X— , xO.Ỉ > trong đó; x: số ml dịch thuỷ phân liêu hao khi chuấn 2 0 ml ferixyaiiua kali; y: số ml dịch amilaza tiêu hao khi chuấn íerixyaniia kali; 0 , 1 : tỷ số pha loãng dịch amylaza trong thí nghiệm thực 2 / 2 0 = 0 , 1 . Chú ỷ: Nếu hệ số F ^ 1 thi cần nhân với F đế biết được hệ số L in ơ thực, tiếp theo cần nhân với iOOA 100 - W ) để quy về chất khỏ tuyệt đối. W: độ ám của nấm mốc cẩn xác định song song với hệ số Linơ. V’/ dụ: Số m l dịch thuỷ phân tiêu hao khi chuán 20ml ferixyar.ua là 6,2. Số ml dịch amylaza tiêu hao là 8,3 . Hộ số F = 1,03. Độ ẩm của chế phẩm là 40% H ê số Linơ = — X — X 0,1 = 14,9 6,2 8,3 Hệ số L in ơ thực và sau khi quy về chất khô tuyệt đối Hê SỐ L in ơ = * 1 0 0 = 25,5 100-40 Bài 6: C h ế phẩm am ylata dùng trong sản xuất bia Năng lực đường hoá của thóc malt a. Nguyên tắc Trong sản xuất bia nãng lực đường hoá đựơc biểu diễn bằng mg maltoza tạo thành do tác dụng của enzim chứa trong 0 ,lg malt sau 30 phút ở điều kiện 30"c và pH = 4,7 ^ 4,8 87 Đối với malt vàng năng lực đường hoá (CÒII gọi là lực (liastaza, ký hiệu là DC) dược đánh giá như sau: DC < ỉ 00 rál xấu DC - 200 - 250 lõi D C = 100^150 xấu DC > 250 râi tối DC trung bình 150 -í-2()0 h. H )ú )CỈ chất cluĩĩ 1 D unkdịch tinh bột 2% (chuấn bị tương tự như khi xác định hệ số Lirịư) Dunặ dịch thiosuníat natri 0,1N Dung dịch NaOH IN Dung dịch iod 0,1N Dung dịchHỊSO a IN r. Tith hành Cân 1 0 - 2 0 gain malt đã nghiền nhỏ trong cốc đã biết trước trọng luiẠng xong cho thèm 450ml nước nóng 40"c rồi khuấy đểu và giữ ở nhiệt dộ 40‘’c trơng 1 giờ. Sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Lau khô phía ngoài cốc rồi đem cận và đổ thêm inrớc cất tới 520g tiếp theo đem lọc vào cốc khô và dùng để đường ihoá tinh bột. Hoặc r,ghiền pha loãng vào bình định mức 500ml. Ị ' [ Lấy J25 m l dịch linh bộl 2% cho vào bình định mức 250ml và đạl vào nồi cách tliiiỷ j0"C . Sau 10-15 phút ta cho vào 12,5ml dịch chiết men của ma!lt và giữ 30 phút satiđó cho thêm 3ml dung dịch NaOH IN dể ngừng hoạt động củaỊamyiaza rồi đổ nước cất tới ngấn bình và đem lọc được dịch thuỷ phân trong. , Đê’ )íác định lượng maltaza tạo thành ta lấy 50ml dịch thuý phân cho vào bình tam gịác 250 rnl SIUI dó cho 25 ml dung dịch 0,1N iod và 3ml N aO Ịl IN và chiiẩii lư ợ n | iod dư bằng dung dịch 0,1 N thiosunfii natri, lượng iod tiêu iiao phái vào khoảnỄ 5-15ml. Nếu ngoài giới hạn trên thì cần làm lại thí nghiệm vàịhay đối í lirợng malt cho phù hợp. Song song với thí nghiêm chính ta cần làm thí nghiệm kiểm ch ứ iiỊ để biết lượng iod tb u hao cTiolỉĩĩâĩT^ữiĩg^^vổrđỊch^cTĩi^lÌTralrva n ĩĩli bội; í ă lấ ỹ ĩS ml dịch chiết malt cho vào bình tam giác 250ml và cộiig thèm 25-30ml Iiước cất, xong cho vào 25 m l dung dịch iod 0,1N, 3ml NaOH IN rồi cìing để yên 5 phút. Tiếp iheo cho vào 4,5ml dung dịch H2SO4 rồi chuán lượng iod dư bằng thio siin fit natri 0,1N với 88 chi thị là dung dịch tinh bột 1%. Tiếp theo ta lấv 25 mi (lung dịch tinh bột 2% vào bình tam giác 250ml, cộng thêm 25 inl nước cất, 10 nil dung dịch iod O.IN. 3ml dung dịch NaOH IN và dế 5 phúi. Sau dó cũim cho 4,5inl I Ỉ 2SO4 IN và chuàn lưựiig iod còn lại bằng ih io siin tit nalri O.IN (/. T iT ĩĩi ]cẽĩ q i u ì I loạt lực diastaza xác clịnh theo công thức DC = a - ỉ b +c .K.17,1 trong dó: a, b, c: lượng iod O .IN tiêu hao trong thí nghiệm chính, dịch chiếi malt và tinh bột ; 17,1: số mg maItoza Tmg với 1 mi dung dịch thiosuníit natri O.IN; K: hệ số pha loãng phụ thuộc lượng mali. Trong trường hợp của thí nghiệm K = 1. Néu lấy 10 gani inalt thì phái pha thành 510 gam hay 500ml và lúc đó K - 2. \ / d iỊ\ lirợiig dịch 0,1N iod tiêu hao trong tlií nghiệm c h ín h là 25 - 11,2 = 13,8 m l, tiêu hao trong 20 m l dịch chiết malt là 25 - 20.3 = 4,7 ml và tiêu hao do kối liợp với 25 m l dịch tinh bột là 10 - 9,5 = 0.5 ml. DC = 1 3 .8 - r4 ,7 - 0 .5 .1.17,1 = 219.4 đơn vị 10 B à ì\ 7; X á c đ ị n h h o ạ t đ ộ d ư ờ n g ì i o á c ủ a n i a l t b à n g p h ư ơ n g p h á p c h u ẩ n \ \ 'i n d i s c h - K o l b a c h ( W K ) a . N g u y ê n tắ c Plurơng pháp dựa trên cơ sớ thiiý phân linh bột bởi enzim có trong ciiing dịch chế [)háin m alt nghiên cứu. Xác định lượng đường khử tạo thành thông qua lượiig iod tạo phức với tinh bột sẽ tính được hoạt dộ enzim DP ( Diastatic Power) theo chi số W K. Đưn vị hoại độ đường hoá là lượng mg maltoza được tạo thành bởi enzim có troiig 100 gam m ali ở diều kiện tiêu chuán pH = 4,3 và nhiệt độ 40"c 89 b.ỉlo á chất và dung dịch eniim - Dung dịch đệm axetat pH = 4,3 (±0,1) : cho 30 g axit axetic băng \'ào bình định mức 1000 m l. bổ sung nước cất tới vạch mức. Hoà tan 34 g axetai nairi (N a Q H , 0 2 .3 H 7 0 ) với nước cất, cho vào bình định mức 300 m l, bổ sung nước cấi rới vạch mức. Phoi irộn hai dung dịch trên, nhận được 1.5 lít dung dịch đệm. Kiếm tra lại trên máy pH met; - Dung dịch axit clohvdric 0, IN ; - Dung dịch iot 0,11VI; - Dung dịch hvposLinfit natri 0,1N: Hoà tan 24,82 gam Na 2S.0 v 5 H 2 0 và 7,6 gam Na2B4 0 7 . 1 0 I Ỉ 2 0 irong 300 - 400 ml nước cất, cho yiio bình định mức 1000 ml. bổ sung nước câì lới ngấn bình; - Dung dịch hydroxyt natri IN ; - Dung dịch axit siiníuric 0,5M: Hoà tan 24,82 gam Na 2S2 0 v 5 H 2 0 và 7,6 gam Na 2B4 0 7 . 1 0 1 Ỉ 2 0 trong 300 ml; - Dung dịch ihymolphtalein 5 g//: Hoà tan 0,5 gam thym olphtalein trong 100 mỉ dung dịch etanol 96% (v/v); - Dung dịch tinh bột 20 g//. - Chiết rút enzim: Cân 20 gam malt vàng, 40,0 gam malt den hay 10,0 gam chế phẩm mall đà được nghiề n nhó c h o vào cớc thuỷ tinh, bổ suiig 4 8 0 iTil nước cất (dà loại đổng). Khuấy irộn nhưng Iránh đế tạo thành grumeaux, sau đó đặl Irên máy khuấy lừ ớ nhiệt độ 40*'c trong thời gian 1 giờ. Cuối cùng sấy khô bên ngoài cốc và bổ sung nước câì đế đạt 520 g; 540 g hay 510 g lương ứng với các loại m all sử dựng trong nghiên cứu. Khuấy trộn đều và liến hành lọc. Bỏ 200 m l dịch lọc đầu liên, lấy 50 ml dịch lọc liếp theo để phân tích. c\ Tiến hành Mẫu thí nghiệm: HÚI 100 m l dung dịch tinh bội 20 g/1 cho vào bình định mức 200 ml. Bổ sung 5 ml dung dịch đệm axetat, sau đó đật vào trong máy điều nhiệt ở nhiệt độ 20"c và giừ nguyên ở nhiệt độ này trong thời gian 20 phúl. Bổ sung 5 ml dung dịch enzim, khuấy đều và đặt lại vào máy điều nhiệt và đê thêm chính 90 xác 30 phút nữa. Bổ sung 4 m l dunR dịch NaOH 0,1N để vô hoạt enzim. Đinh mức tới vạch ngấn bằng nước cất và khuấy trộn (ĩều. Kiếm tra dộ kiểm của dung dịch bàng cách bổ sung m ội giọt thymolphtalein. dung dịch phải có màu xanh. Mảu kiếm chiìnig: Hút 100 m l dung dịch tinh bột 20 g/! cho vào bình địỉih mức 200 ml. Bổ sung 2,35 ml dung dịch NaOH 0,1N, khiiấv trộn dểu. Ỉ3Ổ sung 5 ml dung dịch enzim. Đ ịnh mức tới vạch ngấn bằng nước câì và khuấy trộn đều. Kiếm tra độ kiềm của dung dịch bầng cách bổ sung mội giọi thymolphtalein, dung dịch phái có màu xanh. Định lượng đườiig khử bàng cluiân dộ iod: Hút chính xác 50 m l dung dịch trong bình định mức cho vào binh tam giác nút mài 150 ml. Bổ sung 25 m l dung dịch ioci, 3 mỉ dung dịch NaOH, k lìu íy irộn kỹ. Đậy bình để tránh tốn thất iod và giữ nguyên trong thời gian 15 phút. Bố sung 4,5 ml dung dịch H 2SO4 và chuẩn độ lượng iod dir bằng dung dịch hyposunĩit natri cho tới khi mất màu xanh. Lượng dung dịch iod dùng đế clìLián dộ phải nàm trong khoảng 6 và 12iĩil. Nếu không, làm lại thí nghiệm bằng cách sử dụng nhiều hoặc lì mali hơn. d. Tính toán kết quả Lượng maltoza tạo thành trong quá trình tlìLiỷ plìân tính theo công thức : DPI = F ( V T r - V T n ) trong dó: D P I: Mức độ đường hoá của 100 gam nialt, đơn vị \VindischKolbach (W K ); DP2: Mức độ đường hoá cúa 100 gam m all khô tuyệt đối, đcm vị \Vindisch-Kolbach (W K ); V T r: lượng dung dịch Na2S2()tdùng để chuẩn mầu tráng, ml; V T iiilư ợng dung dịch Nci2S2 0 ì dùng để chuẩn mẫu thí nghiệm, ml; 91 F: hệ số chuyển đổi đối với 100 gam malt : F10g = 68,4; F20g = 34,2 hay F40g = 1 7 ,1 ; \V: độ ẩm của mall, %: W K > 250 inalt rất tốt; W K = 100 ^ 150 mak kém; w k = 200 ^ 25l)^maĩĩtot7 '... ' “W K < ĩo ò mãũ"rấĨ iỊé m . 150 + 2 0 0 m alt trung bình; Hcịạt độ amilaza của chế phám enzim nguồn gốc vi khuẩn tính the© đv’/g : m i i l(k t độ amilaza của chế phẩm enzim nguồn gốc nấm mốc tính thíD đv/g : 7,264.c - 0,03766.,^ ^ ^ m HdỆt độ amilaza của chế phẩm enzim của malt lính theo đv/g : „ ^ ^ ^ 6 . 8 8 9 .C - 0 .0 2 9 3 8 8 , , ^ ^ ^ m trong đó: m: lượng chế phẩm nghiên cứu, mg C: lượng tinh bột bị thuỷ phân, gam. 1 0 0 0 : hệ sô' chuyển mg thành gam. 5,885; 0,001671; 7,264; 0,03766; 6,889; 0,029388 là cá hệ sô' của í^hươiìg trình tính hoạt độ, thu đirợc bằng phương pháp xử lý tèán học sô' ệu thực nghiệm \ ’ề sự phụ thuộc của lượng tinh bộl bị thuỷ phân vào lượng nzim lấy để thí nghiệm. Trong các hệ sô' này đã có đưa vào tỊiìra số tính huyển ra 1 g iờ tác dụng của enzim. Bc i 8: N âng lực đường hoá cửa c h ế phẩm nấm m ốc a. Nguyêiì tác Trong sản xuất bia người ta không đánh giá chất lượng của chế phẩm nấm mốc theo các chi số như trong sản xuất rượu mà theo năng lực đưừng hoá. Năng lực 92 đư ờ ng hóa dặc trưng ch o khả năng của am yiaza xlI c tác t h u y p h â n li n h bôl đ ế n d ư ờ n g k h ử và tí n h i h e o m a l l o z a . M ộ ĩ d o iì y ị lỉo ạ Ị (lộ (Ịirờíii^ l ì ó a d ư ợ c XCỈỈỈ l ù l ư ợ n ^ ỉ u e / i đ ủ k í u i Ị ì á ì ì g p l u ì ỉ ì l y ì g o ì ì i ỉiỉili l ) ộ í ỉl ì ùi il i n u i i ĩ ( ì z a s a i ỉ I íî ở (Ỷ t l i ê i i k i ệ i ì l ỉ l i i ệ t clộ 3Ơ 'C p l l 4 ,7 - 4 ,8 vã ỉiiứ r clộ tliu ỷ phân k lió n ^ (ỊIỈÚ 3()7c. Năng iực dtièfng hoá (H dĐ) biéu dién theo dơn vị irêii cytt-ichô hoặc đv/m l d ịc li men. Cơ sỡ của phương pháp dựa vào thuỷ phân tinh bộl tịăng dịch am ylaza rcli sau đó xác định hàm lượiig chấtkhử theo phương pháp iod. ‘ I 1 I h. lểpá chất: - DÌỉiig dịch 0,1N thiosuníit natri: cân 25 gam N cIị S.íO , tinh khiếtIrồi dùng i ■ ! nước căt kliông chứa CO 2 pha thành 1 lít, sau đó đem bảo quán trong bình ịnàii nâu. Ị í - Diing dịch 0. IN iodxân 25 gíim K I và 12.7 gam ụ tinh khiết rồi hl)à tan và pha thành ^lít. Dung dịch cần bảo quản trong bình mầu nâu. - Dùng dịch NaOH hoặc KOH 0,1N ị - Dụng dịch H C l IN - Diing dịch H 2SO4 ( 1 :4) lấy 1 thể tích axit siiníuric đạm đặc pha Ịv'ới 4 thể tích nước dất. 1 - D iiiig dịch tin li bột 1% vàdịch chiết amylaza (xemphần xácđ ịii|i hoạt độ amylaza). ■ i í'. Tiụ'n hành Lây 1 bình cầu hoặc tam giác lOOml đem sấy khô, xong cho vào 2èml dung dịch linh blột đặt vào nồi cách thiiý có nhiệt độ 31"c. Siiu klioũng 10-15 p l út ta cho vào bình Iđến lOml dịch amylaza khuấy đến và giữ ở nhiệt độ 30"c trong 10 phút, 'rhể |tích chung của hỗn hợp phải bằng 30ml vì thê' trường hợp ịciio dịch amylaza ít |hơn lOm l thì sau khi cho dịch tinh bội, cần thêm nước cất ílé' sa I khi cho dịcli a in y l^ a thể tích chung là 30ml. Sau 10 phút thuỷ phân ta cho vào liỗn hợp phản ứng ỉ m l H C l để ngìmg hoạt động của enzim. Để xác định đường khử theo phương ph^ẩp rón’ ta drayển toàn bộ hỗn hợp phản ứng vào b ìT iừ tam -pác 250 3 OO1Ĩ 1 I (tráng nhiều lần bàng 60 - 8 O1Ĩ 1 I nước cất). Tiếp theo cho vào đó 20ml dung dịch iod O.IN và 60 m l dung dịch NaOH 0,1N lác dểu và đế yên 15 phút. Sau dó 93 cho vào 2ml H2SO4 (1:4) rồi chiiấn lượng iod dư bằng dung dịch 0,1N thiosiiníai natri đến đổi màu. Song song với thí nghiệm chính kế trên ta làm thí nghiệm kiềm tra tương tự, chi khác là cho 2 m l HCl 0.1 N trước khi cho dịch amylaza và không giữ để thuỷ phân. Hiệu số giữa lượng NhsSịO, tiêu hao troiig thí nghiệm kiếm tra và thí nghiệm chính sẽ cho ta lượiig dung dịch iod 0 , 1N để kết hợp \'ới đưừiig khử tạo thành do tác dụng của amylaza. Đem số iod tiêu hao nhân với 17,1 ta sẽ được lượng maltoza tạo thành. d. Tính kết qud Hoạt động dường hoá sẽ tính theo công thức sau: g trong đó: g: lượng chế phẩm enzim tham gia trong phản ứng thuỷ phân tính theo gam: k: hằng số tốc độ phản LÍiig theo công thức; 1 a 2,303 a K - _ In — = ..Ig t a- X t a- X a: lượng tinh bột tối đa có thể tạo thành maltoza trong điều kiện thuỷ phân, tức là 0,2.75% = 0,15 gam hay 150 mg (20 m l dịch tinh bộl 1%). 4.3.3. XÁC ĐỊNH HOẠT L ự c ENZ1M XENLULAZA Xenlulaza là các enzim xúc tác quá trình chuyển hoá xenliiloza thành các sản phẩm hoà tan. Hiện nay còn có nhiéii ý kiến khác nhau về phức hệ enzim này và cơ chế tác dụng của chúng trong quá trình phân hiiỷ xeiiluloza. Nói chung các tài liệu nói đến hai enzim chính của phức hệ enzim này là enzim C| và enzim Q . Enzim C| có khả năng phàn giải (phân huỷ) sợi xenlulaza tự nhiên có tính đặc hiệu không rõ ràng do đó cũng chưa xác định được tên hệ thống của nó. 94 Enzim c , có hai loại: loại ihứ nhất exo p-l,4-elucaiioza xúc tác cho pháii ứiig cắt đirt gốc glucoza từ đầ'.i không khứ của c h u ồ i ,\enliiloza. Loại thứ hai là endo P-l,4-gliicanoza hoạt động tuv tiện liơn nhimg nói chúng nó xúc tác cho phản ứng thuỷ phân các liên kết bên trong phân tư mạnh hơn các liẽn kết ở dầu tận cùng ciíc chuỗi xenkilaza. Để xác định hoạt dộ của xenliilaza có thể dùng nhiều cơ chất khác nhau như; Sợi bông, giấy, bột xenlulaza các dần xuất của xenlulaza... Cơ chất thích hợp nhất cùa enzim C| là sợi bống. Để xác định hoạt độ xenlulaza có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp thường dựa vào inột troiig các nguyên tắc sau đây: a: Xác định sự giảm trọng lượng của cơ chất xenliilaza không hoà tan. b. Xác định sự giảm tính chất của các sợi hoặc các màng mỏng. c. Xác định sự thay đổi dộ đục của dung dịch cơ chất. e. Xác định sự giảm độ nhớt của dung dịch cơ chất. g. Xác định sự tăng các nhóm khử tận cùng. h. Dùng phương pháp so màu đế xác định sản phẩm hoà tan của xenlulaza. i. Xác định bán kính vòng tliiiỷ phân trên môi trường thạch xenliilaza. Nồng độ enzim trong dịch môi trường thường được biểu diễn bàng đơn v ị/ ml hay dơn v ị/g ... lĩài 9. Xác định hoạt độ xenliilam bằng cách do đường kính vòng thiiỷ phán a. Ngityên tắc Cho enzim tác dụng lên cơ chất xenlulaza trong môi trường thạch, cơ chất bị phân hiiỷ, độ đục của môi trường bị giảm, mỏi trường trở nên trong suốt. Độ lớn cùa phần m ôi trường trong suốt phản ánh hoạt động của enzim. b. Tiến hành Chuẩn bị môi trường có chứa 2% thạch, 0,5% Na-CM-xenlulaza irong dung dịch đệm xitrat photpliat pH 5,0 đổ vào hộp Petri. Sau khi ihạch đông, khoét nhữiig lỗ nhỏ trên mặt thạch, cho vào 0,1 - 0,5 ml dung dịch eiư im , giữ ở 40"c sau 24 giờ đo đường kính phần m ôi trường trong suốt ở chỗ eiizim tác dụng. 95 Biếu diễn hoạt dộ eiizim bằng m ilim el đường kính vòng thuv phân. Bài 10: Xác định hoạt dộ pectinazci ịlIdPc) a. Ngiivêii rắc Phương pháp dựa trên cơ sở xác dịab-các-enziffl-xhuỷ 4 ) h â a c h â ì là pectiii. Đori vị hoạt động pectinaza là lượng enzim xúc tác sự thuý phân Ị] g pecnn tới các sảậ phẩm không bị kết tủa bởi ZnSOj khi tiến hành thuỷ phân iroỊiig những diều kiện nhất định: nhiệt độ 30''c, thời gian thuỷ phán 1 giờ, pH = 4.0, Hoạt độ pectinaza biểu thị bằng số đơn vị hoạt độ trên 1 gam chế phắm. T ỷ lệ giữa enzim và cơ chất titìng m ôi trường phải đảm bảo cho 30% pectin bị phân giải. lỊượng sản phẩm của'.sự thiiỷ phân pectin không bị kết tủa bới ZnS0 4 được xác địnhịtrên giao thoa kế UỊRP-2 h. tặoá chất vù dịch enzinì D iỊiig dịch enzim gốc: - T& các chế phám đặc: cân o .lg chế phẩm enzim nghiên cứu trẽnìcâii pliãn tích cho \|io cốc nhỏ dung tích 25-30ml chà máu với 1 iirợng nhỏ nước cật. Sau đó chuyến tcệo bộ vào bình định mức 50ml, trộn đều, thêm nước cất đến iạch. Lọc dung dịch qua giấy lọc, dùng nước lọc để thử nghiệm. T iiỳ thuộc và® hoạt độ p cclin aza m à lấy m ột lượng d u n g d ịch cần thiết. Ị - Tệí canh trường nấm mốc: cân 1 gam canh trường khô đã nghiổaị nhỏ trên cân kỹ Ihitậl và chuyến sang cốc 250ml, thêm vào đó 100 m l nước câì và ậiữ ở 30"c trong vònặ 1 giờ, ihinh thoảng khuấy đều. Lọ(Ị dịch qua giấy lọc. Xác định hoạt độ pectinaza trong dịch lọc. ì - Dịmg dịch pectin 1% (cơ chất): cân một Iưựng mẫu, cân chất pectiỊi với tính toán sao c^ho trong 250ml dung dịch có 2,5 gam pectin linh khiết (theo sc liệu thử nghiệm) ơho từ từ mẩu cân vào bình nón dung tích 30ml đã có sẩn khaing 30ml nước cất. Ịchú ý khi cho pectin vào nước phải khuấy liên tục. Sau khi clỊiiyến hết mảu càn \^ õ 'T iiĩh con ĩc h u ẳ y iĩq n ĩ) pHĩH và'^đe y e ĩ ĩ l glơ ơ nHIệt dọ phòng. Khi hêt giờ thêm vào đấy một lượng xác định dung dịch amoíiiac đậm đặc (vừa thèm vừa khuấy) để đưa về pH 4,0. Tiếp đến thêm nước cất clio đủ 250m l. Khuấy trộn cẩn thận và lọc qua 2 - 3 lớp vải màn. Plia dung dịch pectin 2 - 3 g iờ trước liic tiến hành 96 ihử nghiệm. Màu cũa cÌLing dịch cơ cliất phai xáin sáng.Cấí giữ dung (iịch này ở tủ Ịạnh có ihế dùng trong 4 ngày. Chú ỷ\ Pectin không được chứa các ion kim loại nặng, có thế cho phcp pcclin chứa inộl lượng nhỏ các ion da trị như canxi. m agie... Đẽ diều chế cơ chất, người la dùng pectin củ cải đ ư ờ n g có hàm lượng p e c t i n > 70% và mức độ meioxy! hoá cúa nó khống lì hơn 3 5 *vr. - Dung dịch ZnSƠ 4 hoà tan 15g ZnS0 4 trong lOOm! nước K ié Ị Ị ì ĩr c ỉ iịia o t h o a k é ịÌ Ị ì í e r f e r o ì ì ie t v e ì Dùng dưng dịch saccaroza 0,259f ngãn phai của cốc đo (cuvet) của giao thoa kế (\ớ i chiều dài ciia cạnh là 4 cm) đựng nước cất. còn ngãn trái cốc đo dựng dung dịch saccaroza 'Tính hệ số hiệu chinh K theo công thức K = X /X | trong đó: X: chi số của máy phải bàng 780: X,; độ lệch khỏi số cúa máy. c. T i ê n ỉìíUìii Lấy số ống nghiêm (2cm X 18cm) vừa bàng số mảu thử cần xác định và cho vào mồi ống 2 0 m l dung dịch cơ chất rồi đặt chúng vào máy điều nhiệt hay nổi cách ihuỷ với nhiệt độ không đổi 30" ± 0,2‘*c. Giữ các ống nghiệm ở nhiệi dộ này 10 phúl sau dó đế nguyên ớ nổi giữ nhiệt và cho vào mỗi ổng lOml dung dịch enzim. K lìu íy trộn đều và giữ ở 30"c trong vòng 1 giờ dế ihuỷ phàn pectin. lỉế t giờ nhấc các ống nghiệin ra và tlìêin vào hổn hợp phản ứng 2 nìl dung dịch ZiìS 0 4 13% dế vô hoại enzim và kết lua các sản phấm thiiỷ phân của pectin. Khuấy trộn thật dều hỗn hợp dựng trong ống nghiệm và lọc qua giấy lọc. Nếu dịch lọc vẩn đục ihì phải lọc qua 2 Ìây đó dến khi nhận dược dung dịch trong suổt. Dung dịch này là dung dịch nghiên cứu. Tiến lìành đặt một thí nghiệm kiểm chứng song song. Muốn vậy cho vào ống nghiệm 2ml ZnS 0 4 15%, lOml dung dịch enzim nghiên cứu và 20ml cơ clìấl. KhuAy đều hỏn hợp trong 2 - 3 phút, sau dó đem lọc. 97 Đổ dung dịch nghiên cứu vào ngãn trái của cốc đo còn dung dịch kiểm chứng vào ngãn phải rồi đo trị số chuyển dịch của các giải giao thoa sự chênh lệch các chỉ số khúc xạ của dung dịch kiểm chứng và dung dịch thí nghiệm tạo nên. T rị sô' chuyển dịch này đọc trên thang chia độ (n) của giao thoa kế. Để đảm bảo độ chính .xác phải pha loãng enzim sao cho nhận được trị sô' của n nầm trong vùng từ 4(X) - 1250. d. Tính kết quả Hoạt độ pectinaza (HdPc) tính theo đơn v ị/ gam bằng công thírc: 0,06425.11 + 19,62 HdPc = ------------- -------------m. 1 0 0 trong đó: n: số chỉ của giao thoa kế đối với thí nghiệm đã cho; m: lượng chế phẩm enzim chứa trong 10 m l dung dịch enzim lấy để xác định (gam). 0,06425; 19,62; 1000 các số liệu hệ số thực nghiệm thu được bằng phương pháp xử lý toán học, các sô' liệu đo được khi nghiên cứu về sự phụ thuộc giữa các sản phẩm thủy phân pectin tạo thành trong những điểu kiện của phương pháp và lượng đơn vị hoạt động enzim lấy để phân tích. Ghi chú: - Trong trường hợp có sự sai lệch về chỉ số (x) của máy, phải thay đổi chỉ số nhận được (n) của máy bằng đại lượng n.k vào công thức tính hoạt độ pectinaza. 4.3.4. ENZIM C ATALA2A Bài 11: Xác định hoạt độ eniiin cataỉaia a. Nguyện tắc Catalaza: H 2O 2 oxydoreductaza phổ biến rộng rãi trong tế bào động vật, thực vật và có trong tế bào các vi sinh, vật hiếu khí. Calalaza xúc tác phản ứng phân giải H 2O 2 ihành nước và oxy phân tử, ngoài ra nó còn oxy hoá các rượu và một số hợp chất khác làm thay đổi thành phần axit va một sô' chất khác. V ì vậy nếu hàm lượng catalaza cao trong một sô' chế phẩm hay nguyên liệu thì nó xúc tiến quá trình oxy 98 hoá mạnh hơn. Để biết và xác địnli nó, tìm ra một số nguyên nhân hư hỏng thực phấm hay so sánh hoạt lực catalaza có thể dựa vào lượng oxy phân tử được tạo thành (phương pháp áp kế) hoặc lượiig H 2O 2 bị phân lìuỷ (phương pháp chuán độ bằng K M n 0 4 ). b. Phươnỉị plìáp chuẩn độ hằtìiỉ KMnO^ Chuán bị hai bình tam giác dung tích lOOml cho vào mỗi bình 5ml dung dịch chiết có enzim. Thêm vào bình ihứ nhất (xem nhir bình kiểm ira) 3 ml dung dịch H 2SO4 10%. Sau đó cho vào mỗi bình lOml dung dịch H 2O 2 0,1%. Đặt hai bình vào tủ ấm 30"c trong 30phúl. l ’hêm vào bình thứ hai (bình thí nghiệm) 3ml dung dịch II2SO4 10%. Chuấn đồng thời hai bình bầng dung dịch K M 11O 4 0,1N Im l dung dịch K M 11O 4 0 ,iN lương ứng với K7mg H 2O 2 . c. Tính k ế t cỊiiã Hoạt độ catalaza được tính bằng mg H 2O 2 bị phân giải (C) C = ( A - B ) . 1,7 trong dó: A: số m l dung dịch K M n 0 4 0,1N dùng chuấn độ mảu kiểm tra; B: số m l dung dịch K M n Ơ 4 0,1N dùng chuán dộ mẫu thí nghiệm. 4.3.5. ENZIM PEROXIDAZA Peroxidaza râì phổ biến trong ihực vậi \'à đóng vai Irò quan trọng trong các quá trình oxy hoá. Peroxidaza làm hoại hoá các peroxit đặc biệt là H 2O 2. Peroxidaza xúc tác các phản img oxi hoá nhiều poliphenol và am iii thơm tạo thành các phẩm vật khác nhau. B ài 12, Xác định hoạt độ của enzùn peroxidaia a. Nguyên ỉắc Trong thực tiễn phương pháp xác định hoạt độ peroxidaza phổ biến là phương pháp dựa trên sự oxy hoá pirogalol thành purpurogalin khi có H 2O 2 . Phản ứng xảy ra theo sơ đồ sau: 99 Purpurogalin lạo ihàỉih dưới dạng kếi lủa màu nâu không taiì trong nước, nhưng râì dẻ tan trong eĩe \'à H 2SO4 đậm đặc. Tuỳ thuộc \'ào cơ chất dược chọn dùng pH tối thích mỏi peroxidaza có thay đổi chút ít. Đa sò trường hợp thí nghiệm dược liến hành trong môi trường kiềm yếu hoạc irung lính ơ nlìiột dộ Ihường 20“c. Độ nhạy với nhiệt cúa peroxidaza rất cao, nó có thế bị vô hoạt ngay sau khi sôi rất ngắn. Độ nhạy của nó đối với sự dư 1Ỉ 2O 2 cũng rấi lớn, do dó liến hành xác định hoại độ pcroxidaza trong những ihế tích lớn. pha thật loàng. Lượng purpiirogalin tạo thành có thể xác định bằng hai cách. - Kết tủa purpurogalin sau khi lọc và rửa sạch, hoà tan bằng H 2SO4 80% đem chuẩn bằng KMnO^ 0,1N - Kếl lúa purpuogalin rửa sạch, hoà tan trực liếp bàng ele và đem xác định bằng phương pháp so màu, đối chiếu với ptirpuogalin lin h khiêì tan irong eie. Cììíi ý: Khi xác định hoạt độ peroxidaza bằng phương pháp dùng piroganol làm cơ chất cần chú ý là pirogalol và H 2O 2 dùng trong thí nghiệm có ảnh hưởng râì lớn đến hoạt độ cíia nó, do đó lượng dùng trong ih í nghiệm không dược quá một giới hạn xác định. Ngoài ra phài luân theo mộl cách nghiêm ngặt các trật tự quv định khi trộn lần ihuốc ihử và dịch chiết enzim vào dung dịch H 2O 2 khi chưa thêm pirogalol. h. Hoá cluít Dung dịch H A 1% Dung dịch pirogalol 1% pha trước khi dùng H,S0 4 đậm dặc (d=: U84); I Ỉ 2SO4 80% K M Ĩ 1O 4 0,1N Ele elylic Purpurogalin tinh kliiếl Dung dịch đệm photphaí pH = 8 100 9 c. Tiến Ììàỉih Chuấn bị dịch chiết peroxidaza: Cân lấy vào cối sứ 2 - 3 gam nguyén liẹu (lá, rẻ. h ạt t h í n g h i ệ i n . . . ) , n g h i ề n thật c á n t h ậ n với 2 0 m l d u n g d ị c h đ ệ m p h o t p h a t pH = 8 T 9, có thêm 4 giọt toluen hoăc cloroform và bột tlìuý tinh hoặc cát sạch (khòng có Fe). Chuyến loàn bộ hỏn hợp vào bình định mức 100 ml báng dung dịch đệm và sau đó thêin dung dịch đêm clìo đếii \'ạch. Lọc, nước ih ii được dùng đế xác định hoạt dộng của ptM'oxidaza. Cho vào bình tam giác 250ml, dung dịch pirogalol 1% mới pha và thêm Im l H 2O 2 1% giữ ở nhiệt độ như vậy (20 - 25‘'C). Hồn hợp cho vào trong máy điều nhiệi hay trên nổi cách thuỷ ử 25"c và đế yên trong 1 khoảng thời gian xác định (15 phút - 2 0 giờ) luỳ thuộc vào hoạt lực của en/im. Song song với thí nghiệm kiếm chứng: lấy vào bình tam giác 250ml, 40ml dung dịch enzim đun sôi 10 phúi với ống sinh hàn thu hồi. Làm nguội và cho ihêm 10 inl pirogalol 1 %, m l H 2O 2 1 % như ở mẫu thí nghiệm. Trong thời gian phản ứng purpurogalin được tạo thành ở dạng kết tủa mầu nâu. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 1-2 ml Ĩ I 2SO4 đậm đạc. Lọc kêì tủa purpurogalin irong mầu thí nghiệm cũng như kiểm chứng qua phẻu ihuỷ tinh xốp (G-2). Rửa kết tiìa bàng nước cất cho đến khi nước rửa không còn khử KMnO^. Sau đó hoà tan kết tủa trực liếp trên phều lọc bằng H2SO4 80% (10 - 20ml). Rửa phều lọc bằng nước cấi (lượng nước rứa gấp 7 - 2 0 lần lượng axil đem dừng), Nếu pha loãng không dủ nước, địnli phân sẽ khó, trái lại pha loãng quá mức sẻ làm kết lủa purpurogalin trở lại. Đun nóng dung dịch thu dược tứi 50" - 60'‘c và chuán bàng dung dịch KM1ÌO4 0,1N cho tới khi dung dịch có mầu hổng bổn irong 30 giây (theo mức dộ thêm KMnO^ mầu của dung dịch chuyển lừ máu nâu sang màu thầm rồi xanh nhại và cuối cùng sang màu hồng khi có dư 1 giọt K M n () 4). d . Tính k ế t cỊitả Độ hoạt động của peroxidaza được biểu thị bằng số ml KM11O4 0 , 1N ứng với Igam phẩm vật nghiên cứii khô sau 15 phút tác dụng. Hoạt độ peroxidaza (HdPer) có thể lính theo công thức; 101 HdPer = í^ — y m irong đó: a, b - s ố ml K M n 04 0,1 N d ù n g định phân m ẩ u thí nghiệm và k iể m chihig; m - trọng lượng mẫu thí nghiệm tương ứiig 40ml dịch chiết enzim đem phân tích. 4.3.6. ENZIM LIPAZA Bài 8. Xác định hoạt lục enzỉm lipaia a. Nguyên tấc Enzim lipaza thuộc nhóm esteraza xúc tác thuỷ phân chất béo, giải phóng axit béo tự do theo nguyên tắc: H2C— o —CO—R CH—0 —CO—R Q + H2Ó— o — C O -R HoO H2C— OH —► ^2° C H -O H + RCOOH H2Ò— OH Nếu trong các loại nguyên liệu có nhiều lipaza thì lượng axit béo tạo thành nhiều và nó dễ bị oxy hoá gây nên hiện tượng ôi của chất béo dễ dàng. Thông thưừng hoạt độ lipazii phụ thuộc và pH môi trường cho từiig loại enzim. Upaza của thực vật pF*i = 4,7 Lipaza pancreatic pH = 7,0 5,0 8,0 Đvín vị hoạt lực lipaza biểu Ihị bằng số m ililit dung dịch N aO n 0,1N dùng dế trung hoà lirợng axit béo tự do giải phóng ra do tác (lụng của lipaza trong thời gian 24 giừ ở nhiệt độ 30"C. b. Hoá chất và cơ chất Hoá chất - Dung dịch đệm axetat: pH = 4,7: .rộn 250 ml CH,COOH IN và 250ml CH,COONa và cho nước cất đến 1 lít. 102 - Dung dịch đệm photphat: 7-7,5 3ml 0,066M K H 2PO4 (9,079g/l) + lOml 0,066M Na 2HP 0 , ( 1 7 .8 7 g N a 2HP 0 4 .7 H 2 0 trong 1 lít) - Dung dịch NaOH 0,05N - 0.2N (không có cacbonat) trong etanol ( Ig - 4g NaOH hoà tan trong lượng nước cất ít nhất và đổ cồn đến 500ml) hoặc KOH. - Dung dịch th im olp h talein trong cồn (1%), 1 gam thimolphtalein/lOOml etanol 50% Cơ chất Nguồn gốc lipazii từ thực vật, vi sinh vật có thể thu được từ các cách sau: - Dung dịch huyền phù dầu hướng dương tinh khiết trong dung dịch đệm axetat; 1 ml dầu sạch + 5 ml dung dịch đệm axetat + 5 m l nước cất một vài giọt toluen, lắc đều tan huyền phù mịn. - Nhũ tương o liii: 73 m l nước cất, 0,2g benzoatnat, 7g gamarbic trộn đều. Sau đó cho thêm dần dần 93 ml dầu oliu, nhũ lioá 1 0 - 1 5 phút trong máy đổng hoá (emiilgateur). Nhũ tương có thể bảo quàn được 6 tháng ở nhiệt độ 10"- 14‘’c . Trước khi dùng thì trộn đều. - Từ dầu lạc, đậu; nếu dầu chưa có loại tinh khiết thì có thể tạo ra nó bằng cách lấy dầu như trên cộng 5 ml NaOH 1% và rửa bằng nước nhiều lần tách hết phần nước và sau đó rửa sạch hết NaOH thử bằng dung dịch phenolphtalein 0,5%. Sấy khô dầu theo phương pháp huyền phù dầu hướng dương được dầu tinh khiết. c. Cách xúc dịiili Dựa dung dịch huyền phù trên, ta có hai cách làm cụ thể: Lấy dung dịch huyền phù dầu hướng dương trên cho vào bình tam giác 100 m l, tráng sạch bình bằng 5m l nước cất, và cho vào Im l dịch chiết enzim (lượng dịch chất enzim từ 1 - 5ml tuỳ theo hoạt động lipaza mạnh hay yếu). Lắc đều và để ở máy điều nhiệt ở 30"c trong 24 giờ, sau thời gian đó rót qua bình 50ml hổn hợp etanol và ete (tỷ lệ pha 4:1), cho thêm 5 giọt thimolphtalein, khuấy đều và chuẩn bằng dung dịch NaOH (0,05 - 0,2N) tuỳ theo lượng axit béo giải phóng ra nhiều hay ít chọn NaO H cho thích hợp . Có thể giai đoạn đầu dùng NaOH 0,1 - 0,2N, giai đoạn sau dùng 0,05N để cho kết quả chính xác hơn. Bên cạnh đó ta làm mẫu trắng. 103 Làm urơng lự như trên nhưng không cho \'ào tú ấni mà cho Iigav \'ào 50ĩnl hỏn hợp etanol và ete (4:1). Chuấn bảng dung dịch NaOH 0.05. 'lư thế tích NaOH quv dối ra thế tích dung dịch NaOH 0,1N. d. Tíìììì k ế ĩ c Ịiid Từ số ml NaO IỈ 0,1N của mảu thí nghiệm irừ di số ml N aO Il 0, IN của mảu irãng (sau khi quy đổi \'é) là biết được số ml NaOH Ơ,IN trung hoà lượng axil béo tự do tạo ihành (lo hoat lực cùa enzim lipaza có trong số ml dịch chiết inen cho vào. Từ dấy tính loán biếu thị ra số inl NaO IỈ O.IN cấn thiết dế irtiiig hoà lương axil béo tự do giải phóng ra do lượng enzim lipaza chièì ra từ 1 hoặc 10 gam nguyên liệu ihí nghiệm, thường khoảnc 1 - 2 ml. Phươnịi plìủp dùnỉị Iiliù tươn^ dcìỉi oliit Lấy 0,25ml H 2O 2, 0,3ml nhn tưưiìg dầu olÌLi, 0,1 m l dung dịch dệm phophat và 0 ,ỉm l dịch chứa pilaza, khuấy đéii trong ổng nghiệm, sau đó gÌL~r 6 giờ ở Irong tú ấm hay nồi cách ilìLiỷ ở 37"c. Sau đó thêm 0.3ml etanol 959Ỉ và 1 giọi chi ihị màu Ihimolphtalein. Khuấy đều và chuấn dộ bãng dung dịch NaOM 0,0í^N. Song song llií ngliiệm kicm ira ta ỉàm thí nghiệin mảu tráiìg bàng cách thay 0 ,1 rnl dung dịch lipa/.a băng a l a i i o l . Hoại dộ lipaza lính iheo còng thức: /0 trong đó: a, b - số ml dung dịch NaOH 0,05N chuấn mẫu ih í nghiệm và mảu iráng; 10 - quy tính cho Im l dịcỉi chiếi enzim lipaza; 2 - quy đổi NaOH 0,05 ra NaOH 0 ,1 và số inl. Từ số đưn vị hoại dộng này trên Im l (lịch chic't men lipaza có ihể suy ra cho 1 gain chế phấm hay 10 gam chế phắm baii đầu ihco phưưng pliáp chiêì và pha loãng dịch inen của các loại chế phẩm khác nhau và theo từng loại ilìí nghiệm, từng hoạt lực lipaza khác nhau mà pha loãng, chiết cho phù hợp. Đế chiết chế phấm enzim lipaza lừ cơ chất ta vẩn có thể làm như các loại enzim khác nhimg enzim ỉipaza chịu nhiệt tốt hơn, có ihể chiết ở nhiệl độ 40" - 50"c và sau đó làm nguội để 104 chuyển sang bình định mức pha loãng. Tuy vạy tronu quy dịnh chuán chung nên chiết và ngâm chiết ờ nhiệt dộ trung bình 30"c cho các loại nguyên liệu khác nhau đế dẻ so sánh và lốt nhất nên ngâm chiết Irong dung dịch đệm llìích hợp từng loại ciư.im. 4.3.7 XÁC ĐỊNH H O ẠT L ự c ENZIM TRONG NẤM MEN BÁNH MỈ Đó dánh giá chất lượng của men bánh mì ngoài xác định hoại ỉực các enz.im c h u n g n ế u c á n t h i ế í I i h ư t r ê n , n ế u k h ồ n g . t h ư ờ n g t r o n g s á n XLiâì d á n h g i á m ộ t s ố c h i tiêu quan irọng đế đánh giá chái lượng của men bánh niì và dịnỉi lượng nó cho sán xuàì nha; hoạt lực enzim zimaza, maltaza. do dộ nớ của bột theo thời gian và nhiệt dộ cùng lượng men như nhau, xác dịnh dộ UỊO váng ... Sau dây giới ihiệii cụ thế thêm các phương pháp. Bùi 14. H oạt lực zimaza hay malicaa a. Níỉiiyé/I tắc Hoạt lực ziinaza hay mallaza biếu ihị băng ihời giaii cẳn ihiết đế lách ra dược lOml khí CO 2 khi sử dụng 20inl dung dịch dường .saccaiT0 2 a, glucoza hay maltoza cùng với một lượng men ép cố định, ơ dây thế hiện lốc độ lên men đường glucoza, maltoza, hay saccaroza. Tliống thường hoạt lực zimaza nằm trong khoảng 30 - 40 pluil là men tôì, và hoạt lực mallaza không quá 80 - 90 pliút là men lôì. Cách xác định: Dùng hệ thống inicromanomelre của Elesco (hình 4.3.7). Cùn lượng inen ép khoảng 0,5g hay men klìỏ dà hoạt hoá khoảng 0,2 - 0,3 cho vào cốc nhỏ cỉia hệ thống. Đổ vào cốc lOinl nước câì 35'*c và khuấy cán thận ihậl đều dược dung dịch huyền phù nấm men, cho ihẻm vào cốc lOnil. Dung dịch dường glucoza, saccaroza liay malioza 10% \'à dậy Iiáp irên kín vào ngay và chuyển van 3 ngã từ vị trí A sang vị trí dể cân bàng áp suấi bên troiig với khí qiiycn, sau đó van này chuyển vào vị trí B và đặl cốc điều nhiệt ờ 35"c. Đánh dấu thời gian lừ lúc khuấy huyền phù nấm men với dung dịch đường cho vào và quan sát sự tăng dần của dung dịch NaCl trong ống do áp kế và xác dịnh thời gian khi châì lỏng đó đã nâng lên được lOml. Thời gian này chính là đơn vị đo lốc dộ lên men của đườiig này hoặc hoạt lực enzim của nấm men. G íc chủng nấm men khác nhau sử dụng trong sản xuất thường 105 hoạt lực zimaza thay đổi trong khoảng 40-60 phúl, còn hoạt lực rnaltaza sẽ từ 70 80 đến 160 phút. Hình 4.3.7. Hệ thống micromanometre: 1. cốc nhỏi 2. nút kín; 3. ống đo áp suất: o to 4. ống dẫn; A 5. van ba ngã. 50 Chu ý: Sau khi phân tích xong sẽ đố dung dịch ra bàng cáchvặn van về vị trí mở lấp ra và đố dung dịch lừ cốc ra, rửa cốc sạch, lau khô. Trước khi tiến hành xác định cần chuẩn bị: Rót dung dịch NaCl bão hoà với dung dịch methylen xanh vào lắp của ống đo áp kế. Dung dịch rót từ đáy của ống đo và đánh dấu của mức đó là mức 0. VỊ trí xoay van phải đánh dấu bầng vazơlin ống đo được khác độ với độ chính xác Im l = 2 0 mm. Ghi cliír. Có thể xác định nhanh bằng phương pháp tạo váng. Đây là phương pháp hay dùng để đánh giá nhanh sơ bộ chất lương của men ép hay men khô của men bánh mỳ. Thường lấy 5g men ép hay l-2 g men khô, cho vào cốc nhỏ và 50ml nước thường (hoặc cho thêm 2,5-5g đườiig). Hoà men vào cốc và quan sát bể mặt khi men nổi lổn sau Iphút. Nếu đê’ lâu hơn 5 phút mà men chưa tạo váng là men chưa được tốt. Từ đó đánh giá các phương pháp lực nở để xác định lượng men cho vào bột cho thích hợp. 106 Bài 15, Xác (lịnh lực nở của men a. Nguycỉì ĩắc Dùng hộp nhôm hay tôn có kích Ihirớc xác định thông thường có cấu lạo: Mạl trên của khuôn : ]4,3 và 9.2cm hav 150xl00mm Mật dưới : 12,6 và 8,5cm hay 140x90mm Chiều cao : 8,5cm hav 84mm Dùng thanh gỗ đặt ngang qua bột và đặt lên ihành hộp, đặt cao K5cm. Để tính ihời gian bột nở đến thanh gỗ đạt ngang trên bề mặt bột. b. C ckii .\tk' cíịiilt L.ấy 280g bột mì chất lượng lốt cho vào tíi ổn nhiệt trong 2 giờ ờ nhiệt độ 30"c. Cùng thừi eian đó cân 5 gam men ép (cân chính xác dến 0,01g) và cho vào tủ ấm ờ nhiệt độ 35“c cùng với lỏOml nước muối 2,3%. Lấy 10 - 20ml cÌLing dịch nước muối cho vào chén có mcn, ]ảc đểu cho tới khi khõng vón cục, rồi đem dổ vào bình nhào bột cQa phòng hoá nghiệm, nhào với tổc dộ 135 vòng/phút. Dung dịch inuối còn lại đổ nốt vào thùng, rắc ít bột khỏ lèn trên rồi nhào lại trong vòng 5 phút. Nếu trong phòng hoá nghiệm khòng có máy nhào có iliê nhào bàng tay, nlìimg phải nhào kỹ đúng theo chế độ quy định. Bộl nhào xong nạn thành hình bánh mì dài và dế vào khuôn sái đã xoa dấu (khuôn ở trên). Dùng thanh gổ để ngang qua bột, đật cao l,5cm và cho vào lủ ấm 35‘'c. Tính thời gian cho bột vào khuôn đến khi thấy bột nở đến ngang thanh gổ trong khuòn. Đó là thời gian nở của bột, hay qua đó clánh giá chất lượng men tôì hay xấu. Đ ối với men khô: lấy 2,5 garn mcn hoà với 30ml niróc ihường và đưa vào tủ ổn nhiệt để 30"c trong 30 phúi. Sau đó trộn với 15 gam bộl và lại cho vào tủ ốn nhiệl trong 2 giờ ở nhiệt độ trên. Đổng ihời cho vào tỉi ấm 35"c, 265g bột (đà lấy 15 gam ở irên). Sau đó cho men vào với 130 ml dung ciịch muối 2,5% và cho vào lủ ấm 30 - 35“c. Nhào bột 5 phút và để xác định thời gian nở giống như men ép ở trên. Quan sát khi bột nờ lên đến bề mặl thanh gổ, đánh giá thời gian đó là thời gian hay lực nở của men. 107 Chất lượng của nìcn bánh mì bán trên ihị trường được đánh giá iheo bang 4.3.7. Bàng 4.3.7. Đánh giá chất ỉượng men bánh mi Loai men Men rất tốt Thời gian nở hay lưc nở (phút) ị 65-80 Men tốt 80-90 Men yếu >100 Men rất yếu >120 Ngoài ra người la còn đánh giá thời gian (độ bền vững) ciia men. Trạng thái bị cháy xệ, xẫm mầu hay hình dạng bề ngoài để dánh giá chất lượng men chính xác hcín. lỉáỉ 16. Xác địỉìh dộ bén vừng của men khi bảo quản Dừng phương pháp xác định lực nở của men ở trên sau 10 ngày báo quản I lần. Nếu hệ men của nấm ineiì bển vữiig thì lực nớ trong hoặc sau 10 ngày bào quàn chi lảng lén 1 - 2 phúl. Nếu hệ men khồng bển vCmg thì lực nở kém, thời gian nớ kéo dài thêm 5 - 1 0 phút sau 10 ngày bảo quản lấy mẫu phàn tích. Bài 17. Xác định hoạt íìộ của eniỉni P-gliicosidazci Nguyên tắc của phương pháp là cho cnzini x ik lác phảnứngirong một thời gian xác dịnh, sau khi dìmg phản ihig đo lượng cơ chất mất đi haylượng sản phám sinh ra để xác định được hoạt độ của chế phẩm eiưim . Một dơn vỊ hoạt độ P-glucosidaza (U I) được định nghĩa là lượng enzim có dược trong ch ế phẩm dùng để XIÌC tác ih iiỷ phân cư chất và g iải phóng ra 1 micromol san phám irong thừi gian 1 phút ớ pM 4,8 và nhiệt dộ 50"c. ớ dây cơ chất là p-NPCỉ (pani-nitrophenylglucoza), sản phẩm tạo ra là p-NP (para-nitrophenol) a. Ngnyêềi tắc San phám của phán img ihuỷ phân cơ chấl p-NPG bởi enzim P-glucosicỉaza là p-NP sẽ chuyển màu vàng trong môi trường kicm và có dộ hấp thụ quang cực dại tại bước sóng 405nm. Phương trình thuỷ phân p-NPCi bời P-gliicosidaza như sau: 108 p-glucosidaza -g!ucoza ------------- ^--------- ► O^N-( ( ■HH p P-NPG ) )-♦-ịì-D-glucoza ^____ P-NP Lượng p -N P trong các mẫu phán ứng dược suy ra lừ đường chuấn. Đường chuán này dược ihiếl lập bàng cách xày dựne mối quan hệ giữa nổng độ dà biết của các mẫu có nồng dộ /> N F khác nhau với dộ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm (O D 40s)- Tìr đó có thể dẻ dàng suy ra được lượng cơ châì lính theo m i c r o m o l p-NP giải phóng ra do lác dụng cùa enzim [3-glucosidaza. h. Phương pháp Ịiến Ììảììỉĩ + CliLiân bị ống nghiệm chứa Im l dung dịch Qơ chất /7-NPG lOmM (được pha trong dung dịch đệm axelat pH 4,8) dược đun nóng irong bể ổn nhiệl (t = 50“C) với thời gian 3 phút. + Hút 0,2 ml dung dịch enzim cần xác định hoạt độ (đã được pha loãng tới nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm trên. + Lác đ ề u , g iữ c h o ph ản ứng diễn ra Iroiig 15 phút ờ nhiệt dộ 5(y’C. + Dìing Im l Na 2CO, IM lạnh đế dừng phán ứng và tạo môi trường kiềm. + M ảii kiểm chimg được thực lìiộn tương tự nhưng bao gồm : 0,2 ml dịch enzim bị vò hoạt ngay bằng 1 ml Na^COi IM , bổ sung thêm vào hổn hợp này 1 ml cơ chất và cũng giữ trong 15 phút. + llà m lượng p-N P giải phóng ra được đo trên niđy so màu quang điện ở bước sóng 405 nm so với mẫu kiếm chứng. c. Công íliửc íínlỉ đơn vị hoạt dộ f}-gliicosỉdaza HDE - — ^ •n 0,2-15 troiìg đó: HDE: hoạt độ enzim P-glucosidaza (U l/m l); a: nồng độ p-N P giải phóng ra (tra theo dồ thị đường chuấiì); 0,2: thể lích dịch e iư in i tham gia vào phản LÌììg, nil; 109 15; thời gian tiến hành phản ứng, phút; n; hệ số pha loãng dịch enzim. Đồ thị dưừng chuiiìn 1.2 : Ip -M M 110 Chương 5 GLUXIT G liix it là một trong những thành phần chính tạo nên thực phẩm. Trong thực phẩm nguồn gốc thực vật, tinh bột và gluxit chiếm từ 80-88% chất khô. Chúng còn có nhiều trong các phụ gia dùng trong công nghiệp thực phẩm như chất kết dính và chất keo gelaiin (tinh bột biến tính). G lu xil biến đối trong quá trình chế biến do chịu nhiều tác động, ví dụ; hiện tượng tổn thất tinh bột lìoạc thay đổi thành phần các loại đường... Phân lích và kiểm tra thành phần g luxit của nguyên liệu, sự thay dổi của chúng trong các quá trình công nghệ và cuối cùng là kiểm tra chất lượng cùa các chỉ tiêu về hàm lượng các chất gluxit đóng một vai trò quan trọng. Hầu hết các qui trình sản xuất ihực phẩm đểu cần kiểm tra và phân tích thành phần gluxit, có thể kể đến các quá trình chế biến lươiig thực, sản xuất tinh bộl, san xuất dường mía, đường glucoza, mantoza, fructoza, sản xuất rượu cồn, sản xuâì bia và các sản phấm lèn men khác hoặc trong công nghiệp sản xuất thuốc lá ... Các phương pháp phân tích và kiếm tra giới ihiệu trong phần này còn được áp dụng dể phân lích thành phần g liix it irong các thức ăn kicng, trong công nghiệp sản xuấi các dược phẩm, m ỹ phẩm, trong chế biến gỗ và bao b ì... 5.1. ĐỈNH LƯỢNG GLUXIT BẲNG p h ư ơ n g p h á p s o m à u 5.1.1. NGUYÊN TẮC s o MÀU Nguyên tắc của phương pháp so màu trên máy là đo mật độ quang của dung dịch rồi suy ra nồng độ, dựa vào định luật hấp phụ ánh sáng của Lambert - Beer; 111 Ig ^ - k . c . b - D í trong đó: D : mậl dộ quang; ỉ„ : cường dộ áiih sáng ban đáu; I : cường độ ánh sáng khi đi qua dung dịch; K : hãng số; b : chieu dày lớp dung dịch (cm); c ; nồng độ dung dịch (g//). K h i phân líc h g lu x it, mật độ quang của dung d ịch CÌLÍỢC so sánh với dung dịch chuẩn là nước cất. Có nhiều loại máy so màu, khi phân lích dịnh lượng gluxit la có ihể sử dụng các loại mấy so màu có sẩn trong phòng thí nghiệm. Dù loại máy nào, dế tiến hành phép do cẩn thực hiện các bước sau đáy: C ììiiấ iì b ị (liỉỉiịỊ dịch so ììiùit Dung dịch so màu phái trong suốt để tránh sai số cho phép đo, vì vậv Irước khi đo mật độ quang dung dịch phải được lọc kỹ. lốt nhất là sỉr dụng chất trợ lọc diatomit C h ọi ì kínlì lọ c súỉig lìuy c h iê u dù i hước s ó n g (ỊĩiUỉìỉị p h ố p h ù h ợ p vài d t m g dịch Muốn thế ta xây dựng dồ thị sự phụ thuộc giữa mại độ quang (D) và chicLi dài bước sóng ( X). 'n n i diểm cực dại của D dể lìm bước sóng nhàn) Iránh sai số cùa phép do. Ngoài ra còn thực hiện ih í nghiệm với dung dịch cỉùng dế tạo màu, lìm sự dóng dạng cua hàm so D = f (Ằ.) cúa dung dịch hoá chấl lạo màu và (lung dịch thực phẩm. Nếu không tìm ihấy sự đồng dạng thì chất tạo màu không sử dụng dược. Trên hình 5.1.1 biếu diền sự phụ thuộc của mật độ quang vào bước sóng CLUI dung dịch ferrocyanua làm châì tạo màu và dung dịch đường khử trong phương pháp xác định đường khử trên máy cực phổ Cộ- 4. 112 0 Ạ Hinh 5.1.1. Sự phụ thuộc D = f(>.) Đở thị trên cho cho thấy các đường biểu dién đồng dạng \'à chl) dicm cực dại ớ 2 giấ trị X - 32()nm và Ằ ~ 420nm . N lìư vậy d iiiig d ịc h feiTocyaiuiệi chọn làm chát tạoỉmàu ià phù hợp và dế xác định đườĩig khử tii chọn bước sóng 420iiin vì nó ch o tíiểm cự c dại cao nhất. ^ 'ỉ'rên các máy so màu có thế ghi rõ bước sóng hoác số kính lọc fiđng (lừ 110). Trong Inròmg hợp dó ta cần ira cứu sự liên hệ giữa so kính lọc sứĩig và birớc' sóiig liiv thuộc vào các lơại mấv trong các bán lý lịch máy kèm theo. Njzoài ra còn có ihế dựa vào màu clLiĩig d ịc h đ ế c h ọ n màu kính lọc sáiig, báng 5.1.1. Ị B ảng 5,1.1. Màu dung dịch và kinh lọc màu phù hỢp Màu kính lọe Màu d u n g dịch Tím Xanh lá cây Xanh Vàng Xanh lá cây hơi đâm Da cam Xãnh đâm’ t. !i Đo Xanh hơi vàng Đỏ đậm Vàng da cam Xanh Đỏ Xanh hơi lá cây 1 13 Chọn côc do ịC iiv e t) Sau khi đã chọn được bước sóng cẩn chọn cốc đo, trong đó dựng dung dịch, để giá trị của mật độ quang (D ) nằm trong vùng ổii dịnlì và khõng ra ngoài bảng chia độ. Thực tế cho thấy giá Irị mật độ quang nằm trong khoáng 0,2-0 ,8 phép đo ít sai số nhất. Nếu giá irị của D > 0,8 cần pha loãng dung dịch. Đê định lượng gluxit thường dùng cốc đo có chiêu dàv Icm Xảy dựng đường chuẩn CÌIO ìììồi lo ạ i ỈÌÌÚỴ vù ỉììổỉ lo ạ i (lung dịcìì Đường chuẩn liên hệ D = f(C) phải nằm trong khoảng liên hệ tuyến tính mới có giá trị. Sau khi có đường chuẩn ta xác định nồng độ dung dịch nằm trong vùng đó. Lấy ví dụ xây dựng dường chuán để xác định hàm lượng đường khử bãng phương pháp so màu với íerrocyanua: lấy hàiig loại bình tam giác lOOml, dùng pipel cho vào m ổi bình 20ml dung dịch ferrocyanua ( lOg/1); lOml K O H l,25N , sau đó cho vào m ồi bình lần lượt 5.0; 5.5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0ml dung dịch đường khử tiêu chuán, thêm nước cất vào các bình để chúng đều có thể tích v= 40ml. Đặt lần lượt các bình lên bếp điện đun sôi đúng 1 phút, làm nguội dưới vòi nước và đo mật độ quang D (cuvei Icm ; 420nm). Lấy kết quả và lặp dường chuấn D = f(C). Sử dụng đoạn có phụ thuộc tuyến tính của đổ thị để xác định nổng độ dung dịch theo D. Đo mậi độ quang D của dung dịch Sau khi đã chuẩn bi xong dung dịch và máy (nên bật máy trước khi thao tác 5 phút để có trạng thái ốn định). Cho dung dịch cần đo và dung dịch chuẩn vào cuvel và tiến hành đo D. T im điểm 0 của máy (với dung dịch chuẩn D=0). tuỳ loại máy, giá trị cùa D sẽ được thể hiện trên các bảng chia độ hoặc được hiện lên các bảng sổ. Trong thực tế, dối với m ỗi loại nguyên liệu cần phân tích đều cho san giá trị bước sóng được sử dụng trong các tài liệu iham khảo. V ì vậy người thao lác không cần mất nhiều thời gian chuẩn bị. Điều quan trọng là phải chọn đúng và linh hoạt xử lý trong thực tế, nếu không làm được như vậy kếl quả sẽ kém tin cậy. 114 5.1.2. X ÁC ĐỊNH CÁC H EXO ZA BẰN G PHƯƠNG PH ÁP s o MÀU Bàỉ L Phương ph áp anthrone a. Nguyêỉỉ ĩắ c Phương pháp định lượng hexoza bằng anthrone (9 ,1 0 -d ih y d rO '9 -o xo a n tra ce n ) ra đời từ năm 1946. Ngày nay đã có nhiều cải biên, chủ yếu là về nồng dộ anthrone và nồng độ axit, nhiệt dộ phản ứng và thời gian phản ứng. về nguyên tác cũng giống phương pháp trên, lợi dụng phản ứng lạo màu giữa các đường và anthrone trong axit sunturic. h. Hoá chất Dung dịch anthrone tinh khiết 0,2% trong axit suníuric (tránh nitrat). Duiig dịch chuẩn trước khi phân tích ít nhất 4 giờ và sử dụng trong ngày. c. Tiểỉi ìiàỉih Cho vào các ống thí nghiệm sạch 2ml dung dịch cần phân lích (chứa = 200mg oza lổng số). Làm lạnh sơ bộ dung dịch trong nước đá 15 phút, thêm 4ml dung dịch anthrone. Lắc bàng máy lác ống (Vortex), đậy ống bằng lìáp tròn thuỷ tinh, cho vào nồi cách ihuỷ 80^’c trong 8 phút, sau đó làm nguội nhanh các ống irong ihùng chứa đá, dể mẫu trong bóng tối 30 phút rồi đo D ớ 585nm. cl. Tỉnìì k ế í (ỊIU Ỉ Khả năng hấp phụ của các hexoza khác nhau. So với galactoza» hệ số hấp phụ như sau: maniioza 83% fucoza 200% glucoza 193% friictoza 162% xyloza 30% Làm thí nghiệm kiểm chimg với các oza chuẩn giống như phương pháp trên. Mặc dìi khả năng hấp phụ các hexoza cực đại ở 620nm nhưng so màu ở 585nm để tránh ảnh hưởngcủa các protein với số lượng hơn nhiều so với phương pháp trên. 115 lỉài 2. Phương phápfericyanua a. Nguyớìi tắc Đirừng khứ trước khi dun nóng với dung dịch kiéin cùa ícricyanua sẽ khử IIÓ thành íerocyanua, bản lliân chuyến ihành axit dưừng, cỉuiig dịch mất màu. CH 2 0 H(C H 0 H),C + 6 K ,[F e(C N ),] + 6 K O H (CH 0 H ),(C 0 0 H )2 + 6 K JF e (C N ),] + 4H.,0 a.xit íỉitờiiíỊ h. H aề chất - K,[l*e(CN), iOg/l - K O ụ 1.25N 70g K O H // -C ác chất lắng trong để tách protein r. Ticii hành □ Chuá I bị dung dịch mẫu (lắng protein bàng các chất làm trong dung clịch). pha loãng ư ẫu dể hàm lưựng đường khử chứa 0,2g/100ml. Lấy 5-8m l dung dịch lọc thêm 20ml íericyanua + lOml KO H và nước cất dến v= 40m l. Đun sôi Iroiig 1 phút, làm nạuội so màu với nirớc cất Ở420nm. (ỉ. T úBi kểl qiuì Dựa 'ào mật dộ quang D theo đường chiian tính đirợc hàm lượng dining khử trong nguyên liệu: m trong đó: a : lư M g RS trong dung dịch đo D, xác định bằng đường chuấn; m: lưij||g nguyên liệu tương dương với sò m l dung dịch mầu dùng đế io I); I k :: hệ hẹ sô số ph^ụ^tlniộc hăm lượng đường khử trong ciiing dịch dừợc thể hiẹn trong bảng 5.1.2. I 1^ Báng 5.1.2. Hàm lương dường khứ vá hé số k tương ứng Hàm lượng RS so với đường chung Ị 1-5% 5-10% lQ-15% 15-20% Hẻ sò k 0,9 0,91 0.93 J 0,94 5.2. XẨC ĐỊNH BẲNG p h ư ơ n g p h á p p h â n c ự c 5.2.1. NGUYÊN TẮC XỊấc định g liix il bàng phương pháp phân cực dựa trên tính chất :ơ bản của g lu xii làịkhả năng phân cực ánh sáng. Ánh sáng chia làm hai loại: áiili sáng tự nhiên và ánh sáng phân cực. Ánh sáng tự àhiên dao động trong nhiều mặt phắng thảng góc với tia. còn á|dj sáng phíln cực chi liio động trong một mạt pháng vuông góc với tia. a) b) H inh 5.2.1. Dao động của tia sảng: a- tựnhiền; b- phản cực G ịiix it là một trong những hợp chất hữu cơ có khả náng phân CỊ» ánh sáng. K lii ánh! sáng đi qua dung dịch chứa g liix it sẽ tạo thành một góc quay cực. T rị số góc quaý cực phụ thuộc vào nồng clộ của chúng trong dung dịch. Ta sử dụng phân cực kế hi0 ặc kế để phân tích. Góc quay mặt phắng phân cực a ti lệ \'ới chiều dài ánh sáiig đi qua, với nồng độ chất có hoạt độ quang học trong cÌLing dịch và góc quay cực riêng phán của chẫt dó. 117 a = [a].l.c/100 trong đó: /: chiều dài ống phân cực; c: nồng độ g/lOOml. Nếu nồng độ tính bằng % trọng lượng thì c=p.d p% (g/lOOg dd); d : ti trọng dung dịch; [a ]: góc quay cực riêng đặc trưng cho các gluxit. T rị sô' [a ],/" của một số gluxit được thể hiện ở bảng 5.2.1 Biết được góc quay cực a; [a ] và 1 biết được nồng độ dung dịch: a. i oo g/ 1 0 0 cm-’ a hoặc: a. i oo c= r a g/ 1 0 0 g dung dịch (%) l.d Bảng 5.2.1. [a]o^“ của một số loại gluxit (*) Các chất Saccaroza [a]n^“ + 66,5° Đường khử Glucoza-fructoza 1;1 __ Mantqza .... 138,3.. Glucoza + 52^5 Fructoza -91,3 Dextrin + 194,8 + Tinh bột các loại (*) Khoai tảy 194,5 Gạo 185.9 ......Ngô....... Lúa mach ....................... ...... 184,6 184,0 Lúa mì 182.7 Đại mach 181,5 Kiều mach 181,3 (*) theo Evers 18 - 19,45 5.2.2. THựC HÀNH Bài 3. Xác định đường saccuroia u. Nguyên tắc Làm trong dung dịch trirớc khi phân cực để tránh ảnh hưởng của các chất có góc quay cực khác và loại bỏ các chất màu ảnh hưởng đến kết quả đo. Gíc chất làm trong thường sử dụng là: Axetat chì trung tính Pb(CH,C 0 0 )2.3 H 2 0 và axetat chì kiềm tính 2 Pb(CH^COO) 2-Pb(OH )2 ở dạng bột hoặc dung dịch. Axetat chì lắng hàng loạt các chất như axit oxalic, o xit axit protein, sapoiiin, các chất màu, các chất pectin, các chất màu m elanoidin... Chú ý là không dùng quá lượng axetat chì vì một sớ kết lủa có khả năng hoà tan khi dư axetat chì như các protein. N itrat chì là chất làm trong mạnh hơn, đó là một hỗn hợp gồm hai dung dịch Pb(N 0 ,) 2 và NaOH. 340g Pb(NO 0 2 -/l/; 32g NaOH/1/ dùng lượng bằng nhau (5-lO m l). K h i sử dụng cho nitrat chì trước, NaOH sau. Clìíi ý: Lượng chì dư trong dung dịch có thể loại bỏ bằng dung dịch NaH 2P0 j hoặc 1 giọt axit axetic đậm đặc. Thước đo độ đường: theo qui định thirớc đo độ đường trong đường kế chỉ 100"s khi ta hoà tan 26g đường saccaroza tinh khiết trong lOOml nước cất và phân cực trong ống 2 0 0 mm ở 2 0 "c . 26g gọi là lượng cân tiêu chuẩn, 2 0 0 mm là ống phân cực tiêu chuán. K h i cân mẫu với lượng căn chuẩn và phan cực kế bằng ống tiêu chuẩn, số chỉ trên thước đo cho la biết % đường trong mẫu. Trong thực tế phân tích ta có Ihể lấy bội sô' hoặc ước số của ehúiig. V í dụ; nếu lấy 13g pha trong lOOml phân cự c trong ốn g 2 0 0 m m thì thành phần đường sẽ là Px2, trong đó: p - s ố đọc trên máy. Hoặc pha 26g mẫu trong lOOml phân cực bằng ống lOOmm thì thành phần đường cũng bằng Px2. b. Dụng cụ và lioá cliđl - Đường kế - Chiết quang kế 119 - Bếp đun cách thuỷ - Các bình định mức V50, 100, 200, 250 m - Các cốc đựng dung dịcli - Phẻii lọc và giấv lọc ________ - Cá' ỉ loại ống hút - Dung dịch axetat chì trung tính: 250gPb(CH,COO)2.3H2O + 50ml ịiước cất, khuấy đều, lọc. Nước lọc trung hoà bằng axit yếu. Pha nước cất đến khấc llịít. - Dung dich axetat chì kiềm tính: lOOg oxit chì (PbO) + 230g axil éhì trung tính + 5 0 ư | nước cất. Đun sôi trong 1/2 giờ để thuỷ phân oxit. Để nguội,ịlọc, pha bàng nước Bất đến l l i t (54Bx) - DuỊíg dịch nitrat chì: 340g Pb(NO,) trong llít 32g NaOH trong 1 lít. - HCl 24,85Bx: 510,57ml HCl dậm đặc trong 1 lít - Na 3 : 231,5g N a Q trong 1 lít - Thim hoạt tính 5g/100tĩil - A x it axetic đậm đặc - Ete etylic - Bộị kẽm. c.TiỴn hành j Xík )ặnh hàm lượng saccaroza trong đườiìg kính ! Cân 26g đường bằng cân phân tích vào 1 cốc khô có miệng rót (đã eiâii trọng lượng cốc) Hoà tan đường trong cốc bằng khoảng 40-50ml nước cất đã điin Iióng, dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho đường tan hết. Rót toàn bộ dung dịch đuỊrng sang bình định sạch đuờng trong cốc, que th u ỷ tinh và phễu bằng mộỊ ít nước cất, chuyển tất cả vào bình định mức. Thêm nirớc cất đến gần vạch định mức, để yên khoảng 15-20 phút cho nhiệt độ dung dịch đường gần bằng nhiệt độ trong phòng. Thêm nước cất đến vạch bình định mức, đậy nút bình lắc đều, để yên 1-2 120 phứt 1'ổi lọc. K h i lọc nhớ đậy phễu, lọc bằng k íiih ihuý tinh đế iránh IIƯỚC bay hơi làm thay đối nồng độ. Mé lọc đầii dổ di. Nirớc lọc pliải trong suốt. Rót dung dịch vào ống phân cự 2 0 0 mm; nhớ tráng ống bãng dung dịch nước lọc 1-2 lầii và rót dung dịch vào inép ống đế tránh tạo bọt. Đậy nắp ống pliân cực bàng nắp thuý tinh bàng c á d ị diíỵ xiiig náp ưùu rái-vạj^ 4 ú lixa osu vàQ-giiệiìg ống. Lau khô Bíii dầu ống bằng một miếng giấy lọc. Đira ống ra ánh sáng q u iii sát. ống phải được; nhìn thông suốt và không có bọt, nếu có bắt buộc phải làm laị. Đạt ốiig pliân cực irào máy, bật điện và bắl đđu đo. Ghi kết quả và ghi nhiệt độ t. c/. iV/í/; kếí quả Hàm lirợiig đường saccaroza tính theo %\ X X = P t[ 1+0,0003(1-20)] trong đó; Pt: hàm lượng đường đọc được trên máy; t: im iệt độ. Bù !4. X ác định hàm lượng tinh bột (phương pháp Everse) a. ỉỉgiiyêii tắc T h iiỳ phân tinh bột bằng axit HCl loãng, sau đó đo góc quay cực của dung dịch thuỷ phân, tính ra nồng độ dung dịch khi đã biết góc quay cực riêng phần của loại tinh lộ lđ ó . h. lìụiìg cụ vù lioủ chất - pkan cực kế hoặc đườiig kế; - Binh định mức lOOml; - Ống đong 50-100ml; - n Sì cách thuỷ; - Phễu lọc và các ổng dựĩíg đủìig dĩcĩi; đùã thnỹ“tTiĩh; ~ - Hoá chất; HCl 1,125%; 30ml HCl đậm đạc/lOOml; ZnS 0 4 30%: 30g/100ml; 121 K^PeíCN), 15%: 15g/100ml; Molipdat amonium. Tiến lìàiili Lấy 2-3g tinh bột (nếu các sản phẩm hạt lấy 5g sản phẩm đã nghiền nhỏ) càn bằng cân phân tích vào cốc cân bằng thuỷ tinh, chuyển lượng cân vào bình định mức lOOml qua phễu nhỏ, thêm vào bình định mức 50ml HCl nồng độ 1,124% (tìmg ít một để tráng được lớp bột dính quanh cổ bình). Lắc đều, cho bình vào nồi cách tliLiỷ đã đun sôi. Trong 3 phút đầu lắc nhẹ bình đều đận và thường xuyên, chú ý không để bột dính vào thành bình và mức nước trong bình cách thuỷ phải cao hơn mức dung dịch trong bình. Sau 15 phút lấy bình ra, thêm nước cất đến thể tích chung 80-90mI rồi làm nguội bình đến 200C. Làm trong dung dịch và kết tủa protit bằng 4ml dung dịch molipdat amoni (riêng với bột lúa mạch lấy 6 m l). Cũng có thể làm trong dịch lắng protit dung dịch bằng 0,5-2ml dung dịch axit vonữamic 4%, hoặc 0 ,5 -Im l dung dịch axit pioric 1% hay bằng Im l ZnS0 4 30% và dung dịch íerrocyanua K 4Fe(ơ^)fi 15%. Sau khi lắng protit, cho thêm nước cất đến khấc độ, lắc đều, lọc. Mẻ đầu đổ đi và phân cực trong ống 200ml. ci. Tínlì kết quả Hàm lượng tinh bột g/100 trong 5g mẫu được tính theo công thức: a . 100.0,3462 a trong đó: a: góc quay cực do được; /: chiều dài ống phân cực, dm; [a]o^": góc quay cực riêng (tra bảng); 0,3462: hệ sô' chuyển đổi từ phân cực kế sang đường kế. Everse đã chuyển đổi thành hệ sô' K cho các loại tinh bột theo các hệ sô' sau để nhận kết quả đọc được bằng đường kế, bảng 5.2.2. 122 B ảng 5.2.2. Tinh bột và hệ số K tương ứng Loai tinh bôt Hê sô' K Khoai tây 1,755 Gao 1,866 Ngô 1,879 Lúa mạch 1,885 Lúa mỳ 1 898 Đại mạch 1,912 Kiều mạch 1,914 K ê ...... ' 1,818 Đậu tẩm (vica sativa) 'IJ 4 7 Sắn (*) 1,780 S ố liệu có ĩhể tham khảo Như vậy nếu dùng đường kế: 5g/pha trong lOOml/phân cực ống 200/đo được p. Hàm lượiig tinh bột = PxK Nếu lấy lượng cân khác 5g hoặc pha loãng và dùng ống phân cực bằng các bội số của chúng thì phải tính kết quả theo các hệ sổ cần thiết. Nếu dùng phân cực kế Ihì kết quả đọc được nhân với hệ số 5,12 cho các loại tinh bột. ưu điểm lớn nhất của phương pháp xác định linh bột bằng phân cực kế là tiến hành thí nghiệm nhanh chóng, có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất. Nhược điểm: hệ số góc quay cực quay riêng phần của tinh bột có thể thay đổi, phụ thuộc vào điều kiện sản xuất và giống cây trổng, đặc biệt thấy rõ khi phân tích nguyên liêu đà bị hư hỏng. Ngoài ra trong quá trình thao tác, khi đun nóng với HCl ngoài tinh bột, một phần hemicelluloza và các hợp chất khác có ảnh hưởng đến góc quay cực Bài 5. Xác định hàm lượng dextrin a. Nguyên tắc Dựa trên tính quay cực của các đường hoà tan và dextrin có trong dung dịch, đồng thời dựa trên tính kết tủa của dextrin trong cồn. 123 b. Tiên lìàỉìlỉ ỉlỉí nglìiệỉìì Lấv 23in! dung dịch mẫu cho vào bình dịnh mức VỈOOml; thèm 30ml nước cất và 2ml dung dịch axetat chì, lắc đều. Thèm 2ml dung dịch Na.HP 0 4 , cho nước đến khấc, lọc. Phán cực iroiig ống 100 được a l . l i y 5ml dung dịch mẫu cho vào bình định mức 50ml, cỉổ^đầy cồn 96*’ đến khấc, lắc dều, lọc. Phân cực trong ống 100 được a2. Hám lượng dexlrin có trong lOOml dung dịch mầu (ví dụ dịch ẹường hoá) được línlp theo công Ihức: _ 4 .a ,- 1 0 .a . D ( g / 1 0 0 m l) = ------' 3,26 0,82 X 0 ,3 4 6 g trong đó 4: hệ số pha loãng dung dịch lần 1 ; IC : hệ số pha loãng hỗn hợp đường rượu; 0 ,1 2 : hệ sô' điều chinh khả năng quay cực của các chất hoà tan khậc có trong dung dịcỊc 3,16: góc quay cùa dextrin, được xác định bằng thực nghiệm; 0, j 46: hệ số chuyển đổi. H im lượng dextrin tính theo % khối lượng: D% = D.IOO B.,.d Gm chú'. Theo thực nghiệm dối với dịch đường hoá thì tinh bột không cần thiết dùng axetat chì dể làm trong mà chỉ cần lọc trong suốt dung dịch, Tuy nhiên để chính xác cần làm ihử với mẫu cụ thể. 124 5.3. PHƯƠNG PHÁP HOÁ HỌC 5.3.1. CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU TRƯỚC KHI PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ĐƯỜNG T iiỳ đối tirựng phân tích các sản phẩm mà cácii chuaĩrbỊ diirĩg dịcii iịiầ u dùng để địiih lirỢBig đường có khác nhau nhimg nguyên tắc chung là có thê’ đ|ing nước hoặc dùng cồn để chiết dường. C liiề đường bằng nước K lii; nguyên liệu thí nghiệm không chứa nhiều tinh bột hoặc in ii in, dùng nước để clîết; Cân và cho vào cối sứ l-2g mẫu nguyên liệu đã nghiền u ỏ và sấy khô với cá^ loại hạt và thực vật khô; cân 5-lOg nếu là nguyên liệu tươi nghiền nhỏ. Thêm 30ití1 nước cất nóng 70-80"C. Chuyển toàn bộ hổn hợp vào bình Ểịnh mức lOOml, đuà cách thuỷ ở nhiệt độ 75-80"C trong 30-40 phút. Loại protit b in g dung dịch axetaệchì hoặc nitrat chì dư bằng dung dịch bão hoà Na 2 SƠ 4 thì đun cách thuỷ 10 phút ở (SOPC, còn dùng Na 2PƠ4 thì để yên hỗn hợp 10 phút. Sau đó thêníi| nước cất đến vạch c|iia độ, lắc lọc. Dịch lọc dùng đế phân tích đường. C ììiằ đường bảng rượií ị T rư ặ ig hợp nguyên liệu chứa nhiểu tinh bột và inulin như các lo ^ củ... ta chiết đườnj| bằng rượu 70-80‘'C. Đun cách thiiỷ hỗn hợp trong bình có lắp ống sinh hàn khí. Tlniteg hợp này không phài kết tủa proiein bằng axetat chì Iil^ ir trên vì lirợng protệin chuyển vào dung dịch rất ít. I Ghi ịp/;íí: Đối với các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ (ví dụ các loại quả) trong quá tịrình đun chiết, đường saccaroza có Ihé bị Ihuỷ phân một phàn, ềo đó khi xác định rỊêng đường saccaroza hoặc đường khử, trước khi đun cách thu^ hỗn hợp cần trung lỊoà axit bằng dung dịch Nu2C0 i bão hoà đến pH 6,5 - 7,0. 5 .3 .Ì THỰC HÀNH ] Bài ặ. X ác định đường khử bằng phương pháp Bectran a. Ngiỉvèỉì íắc Troiig môi Irường kiềm các đường khử (glucoza, friicloza, mantoza...) khử oxit đồng (2 ) thành o xit đồng (1 ) (Cu"^ -> C u "'). Đ ổ đ ịn h lượng đường khử dùng 125 thuốc th ử Peh ling : d u n g dịch sLiiìíai đ ổ n g (P elin g I) và d u n g d ịc h m u ố i xecnhet: muối kali-nairi lactrat kép (Pehling II) hoặc gọi là Pehling A và Pelìling B, theo tí lệ 1:1. K hi trộn Pehliiìg I và Pehling II, đầu tiên tạo thành C u(O H )2 có màu xanh da trời. C u (0 H )2 HO ^ HO c c H COONa o - - ■ COOK o c ^ c COONa Cu COOK + H 2O H Như vậy muối xecnhet giữ cho ion Cu^ trong m ôi trường kiềm không bị kết tủa dưới dạng Cu(OH) 2. M uối phức này không bền, vì vậy các đường có chứa nhóm andehyt hoặc xeton dễ dàng khử thành Cu^ tạo ra kết tủa o xit đồng (CU2O) có màu đỏ, bản thân đường bị oxy hoá khi tác dụng với dung dịch Pehling. CHO J_| (CHOH), C H p .l + Cu ° o coon + H jO -> s (CHOH), II + COOK "O ^ MO c + C u .O ịđ ỏ COOR Để định lượng oxit đổng I được tạo thành trước hết oxi hoá nó bằng SLinfat sắt 3 hoặc sunfat kép sắt amon trong môi trường axit suníuric, Cu* sẽ bị oxi hoá trở lại thành Cu^^ còn bị khử thành CU2 O + Pe^íSO,), + Tiếp đó lượng 2 II2 SO 4 = 2 CuSƠ 4 + FeSƠ 4 + H 2 O tạo thành được xác định bằng cách oxi hoá nó bằng dung dịch KM 1 1 O 4 chuẩn độ trong môi trường axit 10 FeS0 4 + 2 K M n 0 4 + 8112804 = SPe^lSO^), + 2 M 11SO4+ K 2SO4+ H 2O Dựa vào lượng KM 1 1 O 4 tiêu tốn người ta lập bảng tỉ lệ giữa lượng KM nƠ 4 1/30N và lượng đường khử (bảng 5.3.2) để dễ sử dụng. b.Dụng cự - Phễu lọc đường (xốp) chuyên dùng để xác định thành phần đường. - Bình Bunzen nối chân không - Bơm chân không - Bình tam giác lOOml, bình định mức 50ml, lOOml, cốc và phều lọc. 126 r. Hoủ chát - Pehling I : 40g CUSO4.5 H 2O /Ilít - P e h lin g II : 200g muối xecnhet+!50g NaOH/ llít - Dung dịch Fe 2(S0 4 ), Irong axit sLinfiiric: 50g FC2(S0 4 ), +200ml H 2SO4 đậm đặc (d = l,4 )/lil Hoặc dung dịch sunfat kép sất amoni. 8 6 g (N H 4) 2S0 4 .Fe,(S 0 4 ),. 2 4 H 2 0 + 2 0 0 g (108,7ml) H.SO 4 d = l,8 4 // K M n Ơ 4 1/30N; l,06g K M n 0 4 / l l í t nước cất đun sôi. Nồng độ K M n Ơ 4 được xác định bằng oxalat amoni hoặc axit oxalic một ngày sau khi pha Bảng 5.3.2. Bảng thực nghiệm của Luxisun Glucoza KMnO^ 1/30N (mi) 0.2 A (mg) Fructoza KMnƠ4 1/30N (ml) Glucoza Fructoza (0 ^ .ÌT M l, 18 19.2 20,1 19 20^3 ] 21^.2 20 21.5 I 22. 4.. 2.90 21 22.7 4,10 22 _ , 23,8 . 23j Z... 2 4 .9 ] ] ' 5,30 23 25,0 26,2 24 26.2 ^ 27.5 7.70 25 27 A 28.8 8.90 26 28,6 30 2 10.0 27 299 31.7 .... 11,1 28 3 1 ,2 ] 33.1 J 2.2 29 32,5 ...34,5 33.8 35.5 ......0 ,0 (^ g ) ..... 0.0 0.8 0,85 . . . .. 1,8 „ V 3 .2,8'... . 4 ... 5 z . ' 5 .0 ... 1..6,1... 7 .... L 2 .... 8 8.3 9 ' 9 .3 .... 10,4 10 ......1.1.5.. 11 1 ' 12.. 13,3 11 14.5 31 15.6 32 16. 7 .. 33 ... 14 15 15,9 16 17. 0. 18.1 17 '' 37.1 36,3 ..... 17.8 34 38.9 18,9 35 4 0 I2 38.6 127 d. Tiếìi liùnli Dung dịch mầu sau khi đã được chuấn bị (xem ở trên) được lấy lOml (0,840mg đường) cho vào bình tam giác VlOOml, thêm 5ml Pelìling 1 và 5ml Pehling II. Đun sôi hỗn hợp trong 3 phút tính từ khi xuất hiện bọt khí đầu liên. Sau khi đun sôi dung (^ịch vẫn giữ màu xanh biếc đạc trưng. Nếu dung dịch mất màu chứng tỏ lượng Pebling cho vào không đủ. Lúc đó phải làm lại thí nghiệm hoặc cho thêm lượng Penling hoặc giảm lượng mẫu. Đế yên, lọc bằng phễu lọc đường lG -4) vào bình lọc cHồn khòng benzen. Rửa bình và phều lọc bằng nước cất nóng 3-4 lần. Chí ý giữ phần lớn lượng oxit đồng I nằm lại trong bình tam giác vii lớp oxii đồng tron oxit hoá bình và trên phễu luôn được phủ một lớp nước nóng để CU2® khỏi bị O2 của không khí. Hoà tan kết tủa oxit đồng I vào bình bui zen khác bằng cácỉ' cho nhrmg lượng nhỏ (5m l) dung dịch suníat sắt 3 trong mệ)i trường H 2S0 , vàc bình có chứa kết tủa C 112O và chuyển sang phễu lọc. Tráng cẩn hận bình và phễu Icc 3-4 lần bằng nước cất nóng. Nước tráng cũng thu vào bình. E ịnh phân dung dịch bằng K M 11O 4 1/30N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt khôAg mất đi trong 20-; 0 giây. Biết lượiig định phân, tra bảng suy ra lượng đường trệng dung dịch thí Iiị hiệm. Làm thí nghiệm kiểm chứiig song song thay dung dịch đu^ng bằng nước cất. e. T [///; kết quả H ài^ lượng đường khử tính theo % RS% = a.V.100 V,.m.lOOO trong đó: a: sằ mg glucoza tra bảng ínig với số ml K M 11O 4 1/30 N trừ đi sô' m KM nO . 1/30N của mẫu kiểm chứng; V: cỊung tích bình dịnh mức; V,: lượng dung dịch mẫu thí nghiệm lấy để xác định đường khử (trong ví dụ trên lOml); m: lượng mẫu (g) nguyên liệu thực phẩm; 128 100: hệ s ố c h u y ể n đối %; 1 0 0 0 : hệ số chuyển đổi sang mg. Bài 6. Xác định đường khử hằng phương pháp Lane-Eynon Phương pháp Lane-Eynon cũng dựa trên cơ sở khử dung dịch Pehling nhưng khác với phưcnig pháp Beclran không phải hoà tan kết tủa và định phân bằng K M n 0 4 nên đòi hởi lì thời gian hơn. Phương pháp này được sử dụng rất rộng rãi trong ngành sản xuất đường mía, đường glucoza, sản xuất bánh kẹo và các sản phẩm lên men. So với phương pháp Bectran kết quả giảm đi khoảng 1-2% a. Ngnyâỉì tắc Đường khử có khả năng khử làm mất màu m eiyl xanh. V ì vậy dùng vài giọt m etyl xanh làm chất chỉ thị cho phản itag oxy hoá đường khử bằng Pehling. Cho vài giọt m etyl xanh vào dung dịch Pehling và đun sôi rồi giỏ từng giọt đường khử vào, đầu tiên đường khử sẽ khử đồng của Pehling, màu của m etyl xanh không đổi. K h i tất cả đồng của Pehling đã bị khử hết, đường sẽ khử m etyl xanh làm nó mất màu, đó là dấu hiệu kết thúc quá Irình định phân. Yêu cầu tiến hành định phân nhanh và luôn giữ trạng thái dung dịch sôi ổn định vì hợp chất dẽ bị oxy hoá và trở về trạng thái màu ban đầu. b. Diuig cụ - Nồi cách th iiỷ - Bình tam giác 150ml - Nhiệl kế - Pipet - Bình định mức 20, 100, 200, 500ml - Buret đầu cong - Các cốc đimg - Bếp điện c. Hoú chất - Pehliiig I: 34,63g CUSO4.5 H 2O / 0,5 lít - Pehling II: 173g muối xecnhet + 50g NaOH/ 0,5 lít (Pehling I và Pehling II theo Sockle) -D u n g dịch H C l( d = h l9 ) 129 - M etyl xanh 1- 2 % d. Tiến hành và tính kết quả Xác định đường trong các nguyên liệu dạng rời (các loại bột nghiền nhỏ) Cân 50g nguyên liệu nghiền nhỏ, chuyển định lượng vào bình định mức 500ml bằng nhiều mẻ nước cất, rửa cẩn thận lượng cặn và xơ), rót cẩn thận vào bình đến khoảng 3/4 thể tích, cắm nhiệt kế vào bình, đun nóng nồi cách thuỷ 2 giờ, t" =80"c, lắc thường xuyên. Sau đó làm nguội, thêm nước cất đến vạch, giữ nhiệt độ 20"c, lắc đều, lọc qua giấy lọc khô. Dùng pipet lấy lOml nước lọc cho vào bình định mức có thể tích thích hợp để hàm lượng đường trong đó hoảng 1%. Để định lượng sơ bộ lượng đường trong mầu, cần làm thí nghiệm: lấy lOml Pehling I và lOml Pehling II cho vào bình tam giác thể tích 150ml, dùng pipet cho 5ml dung dịch đường đã chuẩn bị ở trên \ ’à 5 giọt metyl xanh. Lắc đều, đun sôi trong 2 phút, nếu mất màu xanh chứng tỏ lượng đường lấy dư, cần dùng bình định mức lớn hcfn để pha loãng dung dịch đường đã chuẩn bị. Dùng pipet lấy lOml nước lọc, thêm 3ml HCl (d = l,1 9 ), lắc đều, giữ trong nồi cách thuỷ ở 68-70"C chính xác trong 5 phút, theo dõi nhiệt độ bằng nhiệt kế nhúng trong bình. Làm lạnh bình đến 20“c trong vòng 2-3 phút, trung hoà bằng Na 2C 0 , đến màu xanh của giấy quì, làm lạnh, đưa đến vạch của bình định mức bằng nước cất, lắc, lọc. Nước lọc đổ vào buret có đầu cong để định phân. Đầu tiên thực hiện định phân sơ bộ; Dùng bình tam giác 150mi, cho lOml Pehling I + lOml Pehling II, thêm ít giọt metyl xanh, đun sôi, sau đó nhỏ dần dung dịch dường từ buret(vần giữ sôi dung dịch) cho đến khi mất màu xanh, thêm 4 giọt metyl xanh và tiếp tục đun. Nhỏ dung dịch đường đến khi mất màu xanh, dung dịch chuyển sang thành màu đỏ hoặc màu da cam. Tổng thời gian định phân không quá 3 phút. Sau đó thực hiện quá trình định phân chính. Cho vào bình tam giác 150ml lOml Pehling I +10ml Pehling II, dùng pipet cho vào bình gần hết sô' m l dung dịch đường cần tiêu tốn đã biết ở thí nghiệm sơ bộ ở trên, chỉ bớt lại 0 ,5 -Im l. Đun sôi hỗn hợp 2 phút, vừa đun sôi, cho thêm 3-5 giọt m etyl xanh để trong 2-3 giây vài 130 lần. Phản img kết thúc khi dung dịch đổi từ màu xanh sang màu đỏ hoạc vàng da cam. e. Tíỉìlì kếĩ quả Hàm lượng đường trong nguyên liệu được xác định theo công thức: a.n trong đó: 0,0988: lượng đường khử dùng để khử 20ml dung dịch Pehling; a = 50.10/500 = Ig nguyên liệu khi dùng Im l dịch lọc lấy để xác định đường; n: lượng m l dung dịch mẫu (dịch lọc) chuấn hết. Xác địiili hàm lượng đường khử trong kẹo Cân 0,4g kẹo đã nghiền nhỏ cho vào bình tam giác V150m l. Thêm lOml Pehling ỉ và lOml Pehling II, 20ml nước, đun, lắc đều cho sôi trong 1 phút, cho thêm 3-5 giọt m etyl xanh tiếp tục đun sôi rồi chuẩn độ bằng dung dịch đường khử 1 % đến mất màu. Dung dịch đường khử 1% được chuẩn bị như sau: Cân l,9g đường saccaroza tinh khiết (sai số 0 ,0 0 Ig ), cho vào bình dịnh mức 2 0 0 ml pha loãng với nước (khoảng lOOml), thêm 7-8 giọt HCl d = l,9 , đặt nhiệt kế vào bình, đun trong nồi cách thuỷ (t‘ -67-70"C) sôi trong 5 phút, làm nguội ngay đến nhiệt độ trong phòng, trung hoà bàng NaOH loãng cho đến màu vàng da cam (thêm một vài giọt chất chỉ thị metyl da cam). Thêm 35-50g N aQ để bảo quản, thêm nước đến vạch khấc độ, lắc đểu. Làm Ihí nghiệm trắng: Dùng biiret cho 8-9ml dung dịch đường khử đã chuẩn bị ở trên vào bình tam giác V150ml, thêm lOml Pehling I, lOml Pehling II, lOml nirớc . Đun sôi 1 phút, cho sôi liên tục đồng thời cho 3-5 giọt m etyl xanh và tiếp tục chuẩn dộ bằng dung dịch đường khử đến khi mất màu xanh, thêm vài giọt metyl xanh nếu màu dung dịch không đổi là phản ứng kết thúc. Tính kết quả Lượng đường khử có trong lOOg kẹo (%) tính theo công thức; 131 RS% = 0.01(V -V |).I00 m trong đó: m : khối lượng kẹo (g); V : lượng ml đường khử tiêu tốn trong thí nghiệm trắng; V,; lượng ml đường khử tiêu tốn trong thí nghiệm có kẹo ; 0 ,0 1 : lượng đường khử chứa trong Im l dung dịch đường khử. Xiic địiìlì liàììi liíợng đường khử trong nước mía (phương pháp Iiliaiili) Dùng pipet lấy chính xác 5ml dung dịch Pehling 1, 5ml dung dịch Pehling II cho vào bình tam giác V250ml. Thêm 10 hoặc 20ml nước cất, lắc đều. Thêm 8 -lO m l dung dịch mầu (nước mía) đã được rót vào buret vào bình tam giác chứa Pehling 1 và Pehling II (lượng nước mía này phải làm thử vì chúng rất khác nhau). Để dung dịch sôi đều có thể thêm vào bình ít miếng vụn thuỷ tinh hoặc dầu khoáng. Đặt bình lên bếp và đun nhanh đến sôi. Tiếp tục đun sôi trong 2 phút (chính xác). Thêm 7-8 giọt metyl xanh, dung dịch phải có màu xanh, nếu không chứng tỏ lượng đường trong mẫu quá lớn cần bớt lượng mẫu. Để buret có đầu cong cao hơn bình 2-3cm. Tiếp tục định phân giữ bình sôi mạnh và không nâng bình lên khỏi bếp cho đến khi mất màu xanh hoàn toàn. Lắc đều mỗi khi cho nước mía vào (chú ý không làm gián đoạn sự sỏi). Quá trình định phân sau khi cho m etyl xanh vào kéo dài 1 phút. Dùng lượng dung dịch định phân lần này để làm số liệu sơ bộ cho lần sau. Ghi tổng số lượng mẫu tiêu hao (trước và sau khi đun sôi). Lần thí nghiệm sau cho gần hết lượng mầu tiêu tốn ở trên vào bình trước khi đun sôi chỉ chừa lại l - 2 ml để định phân kết thúc trên bếp, đảm bảo thời gian định phân nhanh. Tíiih kết quả Hàm lượng RS trong nước mía có thể tra bảng hoặc tính như sau: Ví dir. Nước mía có nồng độ chất khô 13,8Bx, d= 1,056. Tổng số lượng mẫu chuẩn hết 1 0 ,6 ml 132 RS%= —----- — x i o o 1 0 0 x 1 0 ,6 x 1 .0 5 6 F - hệ số Pehling: là lượng dường khử có nồng độ 0,5% dùng dể chuẩn 5ml Pehling ỉ và 5ml Pehliĩig II. F tiến hành song song với thí nghiệm nước mía. V í dụ F=10ml Bài 8. Xác định đường khử bằng phương ph á p ịpericyanua) (phương pháp Graxinop) a. N giívêiì tắc Dựa vào phản ứng sau: 2K,Fe(CN)fi + 2 K 0 H ^ 2K4Fe(CN), + H ô + o Tiếp theo oxy sẽ oxy lioá đường để tạo thành axit đường C H 20H (C H 0H )4C H 0 + O ^ CO O H(CHO H),CO O II Phản lìng tổng quát là 6 K,Fe(CN)ft + 6 K 0 H + CH 2 0 H (C H 0 H ) 4CH 0 ÓK^PeíCN)^ + C 0 0 H (CH 0 H ) 4C 0 0 H + 4H2O b. Hoá chát - Dung dịch íericyanua kali 1% - KOH 2,5N - M etyl xanh 0,5% Dụng cụ: bình tam giác, bình định mức, biiret, pipet, cốc đim g, bếp, đồng hồ bấm giây. c. Tiểii hành Dùng pipet lấy 20ml dung dịch íericyanua cho vào bình tam giác 250ml, thêm 5ml dung dịch K O H và 3-4 giọt metyl xanh (nếu dung dịch đường có nồng độ < 0,25 thì lấy lOm l fericyanua và 2,5ml KOH) Lắc đểu, đặt trên bếp điện rồi đun sao cho sau 1-2 phút thì sôi. 133 Chuẩn độ bằng dung dịch mẫu thí nghiệm đà pha loãng đến mất màu của metyl xanh: màu của dung dịch sẽ thay đổi từ xanh sang tím hồng và cuối cùng đến vàng da cam ihì kết thúc. Nếu để nguội màu dung dịch sẽ irở lại tím hồng. Làm dung dịch chuẩn tiến hành như sau: cân 0,5g đường glucoza hoặc frucloza tinh khiết, sau đó pha trong bình định mức lOOml (dung dịch có nồng độ 0,5%). Dùng dung dịch để chuẩn độ íericyanua như ở phần trên. d. Tiìih kết quả Hàm lượng đường khử trong dung dịch pha loãng R S (g /1 0 0 m l)= — 100 m trong đó: a: số g đường glucoza có trong dung dịch đường glucoza 0,5% chuẩn độ hết 2 0 ml íericyanua; m ; số m l dung dịch mẫu thí nghiệm chuẩn độ hết 2 0 m l íericyanua. Ví dụ: khi phân tích để khử 20ml dung dịch íericyanua hết 4,5ml dung dịch đường khử 0,5%. Như vậy lượng đường glucoza có trong đó là 4,5 X 5 = 22,5mg = 0,0225g ( Im l dung dịch 0,5% chứa 5mg). K h i định phân bằng dung dịch thí nghiệm thấy tốn hết 5ml. Như vậy hàm lượng đường trong dung dịch thí nghiêm là: 0 0225 =0,45g/100m l Nếu tính theo % ta chia kết qủa cho trọng lượng riêng của dung dịch (tra bảng theo nồng độ chất khô) Nhận xét Phương pháp này được áp dụng để phân tích hàm lượng đường khử trong .dung dịch đưcmg hoá và phân tích hàm lượng đường sót trong dung dịch lên men thay cho phương pháp Lane-Eynon do sự nhận biết màu dễ hơn. 134 Bài 9. Xác định tinh bột bằng phương pháp Merke (phương pháp enzimaxit) a. Ngu véII tắc Thuỷ phân tinh bộl theo phương pháp merke gồm hai giai đoạn: Giai đoạn đầu: đường hoá tinh bột đã hồ hoá bằng enzim amilaza để tránh sự thiiỷ phân của hemicelIiiloza bàng axit làm tăng kết quả phân tích. Sau khi kết thúc đường hoá (thử âm tính với iod), sản phẩm thiiỷ phân bằng enzim amilaza (mantoza và dextrin) được đem lọc để tách các phần tử không tan, tạo điều kiện thuỷ phân sâu xa đến glucoza sau này. G iai đoạn 2; Thuỷ phân dịch lọc bằng cách đun với axit. Định lượng glucoza bằng một trong những phưcíng pháp ở trên. b. Dụng cụ và lioớ chất - Nồi cách thiiỷ - NaOH 10% - Ống sinh hàn khí - Dung dịch Pehling - Bình định mức 200, 250, 500ml - Dung dịch phèn amoniac - Các cốc đựiig bằng thuỷ tinh và cốc sứ - K M nƠ 4 4,98g/l - Phễu lọc, giấy lọc - Dung dịch m etyl da cam 0,1% - Dịch amilaza từ thóc mầm - Dung dịch iod 0,5% -H C l d = l,1 2 5 c. Tiến hành Cân 3g bột nghiền m ịn, chuyển định lượng vào bình đáy bằng V200ml. Đầu tiên trộn bột bằng một lượng nước nhỏ để không vón cục, sau đó đưa thể tích lên đến lOOml. Để hồ hoá tinh bột đặt bình vào bình cách thuỷ đã đun sôi trong 45 phút. Trong 3-5 phút đầu lắc đều bình. Sau 45 phút làm nguội đến 2-3ml dung dịch mầm chiết và đường hoá trong 2 giờ ở 65"c, thêm 65"c. Sau đó lại cho bình vào nồi cách thuỷ đã đun sôi trong 30 phút, thêm 2-3m l dịch chiết mầm và lại đường hoá trong 30 phút ở 65"c. Quá trình đường hoá kết thúc được đánh giá bằng phản i'mg tạo màu giữa tinh bột và iod. Làm nguội một giọt thuỷ ngân cho vào cốc sứ, nhỏ vào một giọt dung dịch iod, khuấy đều, nếu iod không đổi màu là quá trình 135 đường hoá đã kết thúc. Để tránh sai số, giọt thiiỷ phân đó sẽ được cho lại vào mẫu. Sau đó diệt men đường hoá bằng cách đun sôi, làm nguội và chuyển vào bình định mức 250ml. Tráng bình thuỷ tinh nhiều lần bằng nước cất và rót vào binh định mức. Đira dung dịch đến khấc, trộn đều và lọc vào bình định mức 200ml. Chuyển 200ml dịch lọc vào bình định mức 500ml, thêm 15ml HCl d=l,125, đậy bình bằng ống sinh hàn khí, đun sôi trong bình cách thuỷ trong 2 giờ. Trong thời gian sôi, mức nước trong bình cách thuỷ phải cao hơn mức dung dịch trong bình thí nghiệm. V ì vậy phải thường xuyên bổ sung nước vào bình. Sau 2 giờ, làm nguội dung dịch, thèm 1-2 giọt metyl da cam và trung hoà bàng NaOH 10% đến trung tính hoặc axit yếu. Lượng kiềm (khoảng 42m l) thêm vào từ từ và thận trọng để không phân huỷ glucoza. Không nên thêm kiềm vào dung dịch đang nóng vì cũng có thể làm glucoza bị phân huỷ. Sau khi trung hoà thêm nước, đưa dung tích đến khấc, khuấy đều, dùng pipet hút 2 0 m l để xác định glucoza theo phưcmg pháp Bectran. cỉ. Tính kết quả Lượng glucoza có trong 20ml dung dịch được tra bảng Bectran. Hệ số chuyển sang tinh bột được tính theo phưcíng trình thuỷ phân: ( Q H ,„ 0 ,) „ + nH Ô ^ 162,1 18,02 n Q H i^ O , 180,12 Như vậy một phần trọng lượng glucoza tương ứng với 162,1/180,12 = 0,9 phần trọng lượng tinh bột ^ glucoza (a) X hàm lượng tinh bột trong 2 0 m l mẫu bằng lượng 0,9 Trong 20ml dung dịch chứa i|5 ^ = 0 .0 9 6 g b ọ , 250.500 Do đó hàm lượng tinh bột trong mẫu sẽ là 0 ,9 x a x l0 0 0,096 136 5.4. ĐịNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG GLUXIT BẰNG p h ư ơ n g p h á p SẮC kỷ Sắc ký và điện di là phương pháp vi lượiig được ứng dụng có hiệu quả để xác định các monosaccarit và các oligosaccarit. Nguyên lý cơ bản là tách một hỗn hợp chứa nhiều cấu tử nhờ các dung mõi cho chảy qua các chất mang khác nhau, sau đó hiện hình bằng một loạt dung môi khác. Trước khi định lượng bằng sắc ký các monosaccarit và các oligosaccarit phải được tách bầng cách kết tủa với etanol hoặc axetol nồng độ 80-90%. Một số muối vô cơ có trong nguyên liệu có thể cản trở sự tách các g lu xit nên ta phải loại bỏ chúng bằng cách cho dung dịch qua trao đổi cation hoặc anion. Trong trường hợp xác định các oza có chứa các oligosaccarit tự do hoặc liên kết thì mẫu phân tích phải được thiiỷ phân sơ bộ với các điều kiện hết sức nghiêm ngặt. 5.4.1. SẮC KÝ TRÉN GIẤY Sắc ký giấy thuộc loại sắc ký phân bố. Chất hấp phụ là giấy xenluloza. Chấm dung dịch phân tích lên các điểm cách bìa tờ giấy sắc ký 1 khoảng. Sau khi cho bay hơi (sấy bằng máy sấy tay, đặt giấy vào máng đimg dung dịch gọi là pha di động. Các cấu tử trong hỗn hợp sẽ chuyển động theo những tốc độ khác nhau và được tách riêng ra. K h i hiện hình và sấy sẽ xuất hiện thành các vết. Đặc irimg cho vùng di động là hằng sớ R| là tỉ lệ khoảng cách giữa điểm chấm và khoảng chảy của dung môi. Nếu cố dịnh các diều kiện thí nghiệm thì R đặc trưng cho cấu tạo phân tử của các chất cần xác định. Có thể tiến hành sắc ký xuôi chiều, ngược chiều hoặc sắc ký từ tâm ra. Cũng có thể chia sắc ký một chiều và hai chiều. Cần lựa chọn phương án chạy dung môi thích hợp. Thông thường chạy xuôi chiều. Hệ thống dung m ôi dùng để tách gluxit: N ,: Butanol-axit acetic-nước (4:1:5), dùng cho giấy sắc ký N,, chạy 2 lần (2 ngày) 137 N,: Pyridin-acetat etyl-nirớc (1:2:2, dùng cho giấy sắc ký N |, chạy 18 giờ đối với m o n o s a c c a rit, hoặc giấy N , (ch ạy 2-6 Iigày tiiỳ th e o m ứ c đ ộ po lim e hoá c ủ a các oligosaccarit) N,: Pyridin-acetat etyl- axit axetic-nirớc (5:5:1:3, dùng cho giấy sắc ký N| hoặc N,. Các dung môi này tách tốt các monosaccarit và oligosaccarit. Các hoá chất không đặc hiệu N,: hoá chất nitrat bạc: sử dụng hai dung dịch liên tiếp: - Dung dịch A: Im l dung dịch bão hoà nitrat bạc/200ml axetol. Hoà tan kết tủa bằng cách nhỏ từng giọt nước cất - Dung dịch B: nhỏ 5m l NaOH (40g/100ml) trong 2 0 0 m l etanol 95". Sắc ký được nhúng vào dung dịch A, giữ trong bóng tối 10-15 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau đó cho qua dung dịch B. Sự chuyển dịch các g lu xit được khảo sát bằng cách vết đen bằng cách nhúng các sắc ký vào dung dịch amoniac 2N. N 2: hoá chất oxalat anilin-axit oxalic theo tỉ lệ 2 thể tích dung địch anilin 2m l/100 etanol và 3 thể tích axit oxalic 2,5g/100ml. Sau khi để trong tủ sấy ở nhiệt độ 105"c trong 10-15phút, các aIdohexoza cho màu hơi xanh lá cây. Các xetoza cho màu rất nhạt hoặc không màu. Các oligosaccarit tác dụng chậm do đó phải đun nóng. Quan sát các vết dirới ánh đèn (W OOD) N ,: hỗn hợp difenilam in anilin-axit octophosphoric (DAP) theo tỉ lệ 5 thể tích dung dịch difenilam in 4% trong etanol 96" + 5 thể tích anilin nguyên chất 3% + 1 thể tích axit ocotophosphoric nguyên chất. Lắc đểu đến mất màu. Sây sắc ký ờ 80-100"C trong 3-5phiít. DAP là chất hiện hình lổng hợp có khả năng tạo màu với cả andoza và hexoza. Các vết của đirờng có liên kết glocozit 1-4 cho màu xanh đến xanh đậm. Nếu không có liên kết thì cho màu xanh nhạt hoặc vàng đậm phụ thuộc vào nồng độ các gluxit. Thực tế chúng tôi thấy để tách hỗn hợp các g lu x it sử dụng dung môi N|Và hổn hợp hiện hình N , cho kết quả tốt. Các hoá chất đặc biệt cho các xetoza 138 - Ureclohidric: dung dịch này cho màu xanh da trời hoặc xanh lá cây với các xetoza tự do và các xetoza liên kết. Có thể dùng các axit khác nhưng HCl nhạy hcm cả. - 96ml etanol 80" và 4m l HCl đậm đặc - Orcinol: hoà tan 0,5g orcinol và 15g axit tricloroaxetic trong lOOml bão hoà /ỉ-biitanol. Sau kh i phun chất hiện hình, giữ các giấy sắc ký (sắc ký đồ) ở 105"c trong 15-20 phút. Các xetohexoza cho màu vàng; xetopentoza cho màu hơi tím, xetopeptoza cho màu xanh da trời hoặc xanh lá mạ. Còn các axit sialic cho màu nâu vàng. Tiên hành thí nghiệm Việc định lượng g lu xit có thể tiến hành ngay sau khi chạy xong dung m ôi bằng phương pháp so màu hoặc tiến hành đo mật độ quang của các vết sau khi đã hiện hình Xcíc định gliixit trên sắc ký đỗ d ã hiện hình theo hai phương pháp Phương pháp mật độ quang: độ đậm đặc của các vết được đo bằng quang sắc kế tự ghi. Sau đó sử dụng đường chuẩn hoặc các mẫu đối chứng của các loại g luxit tinh khiết cho biết nồng độ trước Phương pháp có tách vết: hoà tan các vết bằng dung m ôi, sau đó xác định khả năng hấp thụ của các dung dịch có màu. Phương pháp này phù hợp với lượng lớn nhất cho m ỗi g lu x it là 50g và sử dụng dung môi chuẩn biết trước lượng g luxit tương ứng. Sau khi chạy dung m ôi, sấy sắc ký đồ (giấy sắc ký) trong không khí và hiện hình bằng cách nhúng đều trong hoá chất xitrat anilin 1 , 1 M trong cồn tuyệt đối và dung dịch axit citric IM . Sau đó giữ các sắc ký đồ trong 10-15 phút ở 100-105"c trong tù sấy. Cắt những miếng giấy vuông bao quanh vết, trích li trong 3 giờ bằng dung môi etanol 20% axit H C l 0,5N. xác định khả nãng hấp thụ màu dung dịch ở 400nm. Xác định gliixit trên sắc ký đồ không liiệii hình Đánh dấu sự địch chuyển các gluxit trên sắc ký đồ, sau đó tách các đường ra và định lượng chúng bằng phưcmg pháp sắc ký (cho tất cả các vết) 139 Sau đây xin giới thiệu một thao tác cụ thể tiếii hành xác định hỗn hợp đường trên sắc ký giấy Định tính Cắt giấy sắc ký thành từng dải kích thước 17x52cm, đường chấm (A ) cách biên 7cm, gập giấy sắc ký cách biên 2,5cm. Các điểm chấm cách nhau 2,5cm (xem hình 5.4.1) Í ! ' 5 cm 52 cm 7 cm 2,5 cm 17 cm Hình 5.4.1. Giấy sắc ký Dùng micropipet chấm những chấm dung dịch lên giấy (vừa chấm vừa sấy khô m ới tiếp tục giọt khác). Vết chấm càng nhỏ càng tốt. Trên đường chấm, ký hiệu rõ mẫu chuẩn (gồm các gluxit tinh khiết) và các mẫu dung dịch thí nghiệm. Chấm xong cho vào máng sắc ký đặt trong hộp sắc ký giấy, m ỗi máng gập 2 lờ hoặc nhiều lờ nếu có thanh đỡ. Rót dung dịch vào m ỗi máng (xem phần dung m ôi). Đậy máng và cho chạy. Theo dõi để đường chạy dung m ôi thảng. K h i dung môi đã chạy qua giấy, lấy ra phơi ở nhiệt độ trong phòng thí nghiêm đến khô, cho chạy lần 2 như trên. Sau khi chạy xong lần 2, sấy khô ở nhiệt độ trong phòng rồi hiện hình bằng hoá chất, hiện hình bằng cách đổ ra khay, tráng giấy sắc ký qua hoặc phun vào giấy sắc ký. Phơi ráo nước rồi cho vào tủ sấy 3-5 phút ở 80-120"C. K h i các vết đã hiện rõ, lấy ra khoanh bút chì vào để đánh dấu. Thường chấm dung dịch chuẩn 2 bên sắc ký đồ để so sánh được chính xác. 140 5.4.2. SẮC KÝ LỚP MỎNG Hexoza được tách tốt khi dùng silicagen 60 và hệ thống dung môi: isopropanol/axetat etyl/nước (4:3:1 hoặc 5:4:!). Hiện hình bằng các hoá chất giốiig sắc ký giấy. Cũng có thể sử dụng dung dịch axit siiníuric 5%, sấy 100-105"c trong 2 0 phút sấy 150"c trong 1 0 phút. 5.4.3. SẮC KÝ CỘT Có nhiều phương pháp định lượng g liix ii bằng sắc ký cột dựa trên cơ sở khác nhau về cách dùng các chất mang khác nhau như: sắc ký hấp phụ trên cacbon, sắc ký tách sơ bộ trên xenliiloza, sắc ký lọc gen trên sepliadex hoạc trên các gen khác nhau (sắc ký trên cột trao đổi io n ...). Ngày nay, phần lớn các phương pháp tách và định lượng g liix it bằng phương pháp sắc ký cột đã được đơn giản hoá nhờ quá trình tự động hoá các bước thao tác, nên được sử dụng khá rộng rãi nhất là sắc ký lỏng áp suất cao. Mặt khác, phương pháp này không đòi hỏi xử lý sơ bộ các gluxit. Các monosaccarit thường được tách bằng hai phương pháp: Sắc ký cột trao đổi ion: Thường được dùng cột dowex 1x8 (dạng bisiinfit) cùng với etanol loãng. Chất lượng của quá trình tách gluxit phụ thuộc vào nồng độ etanol, kích thước hạt chất trao đổi ion (rezin), tốc độ chảy của dung dịch và nhiệt độ. Các chất trao đổi ion dang xốp (nhiéu lỗ hổng). V í dụ amberlyst, XN-1001, dowex 2xk, dowex 1x8 có khả năng tách ghixit tốt hơn. M ặt khác phương pháp này còn tách tốt các polyol, các loại đường đã metyl hoá 1 phần và các gluxit không chứa các ion. Sác ký trao đổi ion dưới dạng borai hoá: nguyên tắc là monosaccarit tác dụng với borat cho 1 phức axit có thể tách dược bằng cột rezin kiềm mạnh. Sự tạo phức được thực hiện bằng dung dịch borat loãng. Khả năng gắn của phức borat trên rezin phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, số gốc hyđroxyl và sự liên kết không gian của phân tử. Phưcmg pháp này rất nhạy với hàm lượng monosaccarit trong khoảng từ 0,7-4 g. Hiện nay hệ thống phân tích tự động đường "Jeol" cùng với 1 cột rezin amoniom dưới dạng borat hoá được ứng dụng rộng rãi để phân tích các loại đường: 141 hỗn hợp, saccaroza, xenlobioza, matoza, lactozíi, glucoza và fructoza. Sau khi tách bằng sắc ký cột, các monosaccarit được xác định bằng phương pháp sắc kế. Các oligosaccarit thường được tách bằng sắc ký cột cacbon-selit nhờ gradien nồng độ của etanol nhờ lọc gen. Hệ thống này gồm nhiều cột sephadex hoác biogel. Có thể tách được các oligom của fructoza, glucoza, xyloza. Ngoài ra các oligosaccarit cũng có thể tách được bằng các cột trao đổi ion như Dowex. DEAExenliiloza, DEAE-sephadex. Nói chung nếu chỉ sử dụng riêng biệt một phương pháp thì khó tách, vì vậy dùng phối hợp. 5.4.4. SẮC KÝ CHẤT LỎNG ÁP Lực CAO (HPLC) Ngày nay HPLC được sử dụng tương đối rộng rãi như là phương pháp chính để phân tích g luxit vì chúng là hợp chất khó bay hơi, ngoài ra chúng là các hợp chất có độ phân cực cao, phương pháp này nhanh và nhạy. HPLC dưới pha liên kết: các cột dưới dạng ankyl-am in và hệ dung môi axetonintrit (MeCN)/nước có thể tách tốt các mono và oligosaccarit. V í dụ với hệ thống MeCN/nước (72:25) sau 12 phút có thể tách fructoza, glucoza, saccaroza metibioza, rafinoza, mantoza, mantobioza, mantotetraoza. Phương pháp này thường dùng để tách đường có nguồn gốc lương thực, thực phẩm. Tách g lu x it ở pH G - 6 -P + ADP ADP-adenosin-5-diphosphat Sau đó với sự có mặt của enzim glucoza-6 -pho.sphat dehydrogennaza (G 6 PDH) glucoza-6 -phosphat bị oxi hoá bởi nicotinam id adenin-dinucleotit-phosphat (NADP) thành gluconat- 6 -phosphat và tạo thành nicolinam id adenin dinucleotit phosphat (N AD PH ) G - 6 -P-DH G - 6 -P + N AD P -> gluconat- 6 -phosphat + NADPH + Hàm lượng N AD PH tạo thành trong phản ứng ti lệ thuận với hàm lượng glucoza. Đo mật độ quang ở 334nm, 340nm hoặc 365nm. 144 b. Hoá chất - 3 bình (1) gồm khoảng 7,2g hỗn hợp ở dạng đông khô bao gồm; dung dịch đệm trietanolam in pH 7,6; llO m g NADP; 260m g+ A T P , suníat m agie; chất ổn định; - 3 bình (2 ) gôm l , l m l dịch enzim dạng huyền phù g ồ m hexotánaza « 7 2 0 glucoza-6-p hosphat dehydrogenaza 160đv; - dung dịch glucoza. c. Tiến hành Hoà tan lượng chất trong bình (1) với 45ml nước cất 2 lần, còn bình (2) sử dụng trực tiếp k h ôn g cần pha loãng. Có thể bảo quản bình sô' 1 trong 4 tuần ở và 2 tháng ở 2‘'c. D un g dịch trong bình (2) bền trong 1 năm nếu bảo qtiản ở +4‘’c +4"c. Đ o mật độ quang ở 34 0 n m , 365nm hoặc 334nm , cuvet Icm , nhiệt đ ộ 2 0 -2 5 " c . Thể tích m ẫu 3 ,0 2 m l, dung dịch thí nghiệm chứa 3-lOOịu.g g lu c o z a /l cuvet (trong 0,1- 2 ml m ẫu thí ngh iêm ). Thứ tự tiến hành như sau: Pha mẫu trong cuvet Dung dịch 1 Kiểm chứng Mầu thí nghiệm 1,0ml 1.0ml Mẫu Nước cất 2 lần 0,1 ml 2,0ml 1,9ml Trộn đều khoảng 3 phút, sau đ ó đo mật độ quang các dung dịch (được í ^ đ o A i) Thực hiện phản ứng bằng cách thêm Dung dịch 2 Kiểm chứng Thí nghỉệtn 0,02ml 0,02ml T fộn đ ều , c h ò phản ứng kết thúc (khoảng 10-15 phút) đ ọ c mật độ quang (A 2). N ếu sau 15 phút phản ứng chưa kết thúc, cứ 5 phút sau tiếp tục đo mật độ quang 1 lần đến khi kết quả giữa 2 lần đo không đổi. 145 cl. Tinh kết qitả (A 2- A 1) của mầu kiểm chứng và mẫu thí nghiệm. Suy ra sự khác nhau giữa mật độ quang của mẫu kiểm chứng và mẫu thí nghiệm. Ta được A A (glucoza). Nồng độ gliicoza được tính như sau: v.p,M AA (g//) E.d.v. 1 0 0 0 trong đó: V : thể tích mẫu (m l); V : thể tích mẫu thử (m l); Pm : trọng lượng phân tử cùa chất thí nghiệm; d ; chiều dày ciivet; e : hệ số hấp phụ NADPHỞ 340nm:6,3 (/ m m or'.cm ' ); ở 365nm:3,5 (/ m m or'cm '); ở 334nm:6,18 (/ mmol 'cm '). Đối với glucoza 3,02.180,18 ^ = 5 ,4 4 1 ^ e Nếu pha loãng dung dịch khi chuẩn bị mẫu thì kết quả được nhân với hệ số pha loãng nhir bảng 3.3.1. Bảng 5.5.1. Hệ số pha loãng dung dịch glucoia Lượng glucoza (g//) đo ở 146 Pha vói nưốc cất Hệ sô' pha loãng 340 hoặc 334nm 365nm 100 1+999 1000 1 Bài I I . Xác định gliicoKi bằng phương p h á p /ericyanua và eniiììi gliicooxydaia a. Hoá clỉẩỉ - Dung dịch (1) K 4Fe(CN)f, 0,6%. - Dung dịch (2) lOmg glucooxydaza và 6 8 ml dung dịch đệm axelat-natri pH=5,0 đưa đến khấc bình định mức lOOml bằng dung dịch ferocyanua-kali 0,6%. b. 'Xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị các dung dịch glucoza có nồng độ khác nhau từ 50 - 750|j.g trong Im l nước cất. Dùng pipet lấy 0,2ml từ mổi dung dịch, thêm 3ml dung dịch (2), giữ ờ nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 65 phút. Tiến hành với mẫu kiểm chứng (0,2ml nước và 3ml dung dịch (2). Đo mật độ quang D với chiều dài bước sóng ^=400nm (so sánh với nước cất) Hình 5.5.76. Đường chuẩn xác định glucoza bằng phương pháp gỉucooxydaza Tiến liàỉìli thí ngììiệm và đo kếĩ quả Chuẩn bị dung dịch mẫu thí nghiêm để hàm lượng glucoza nằm irong khoảng 50-750mg/ml. Lấy 0,2ml mẫu tiến hành giống như khi xây dựng đường chuẩn. Đo mật độ quang D. Dùng giá trị của D để tra ra hàm lượng của glucoza có trong dung dịch theo đường chuẩn. Từ lượng glucoza đó lính ra hàm lượng glucoza trong mẫu thí nghiệm m g/m l hoặc % khối lượng. 147 Bài 12. Xác định tinh bột bằng phương pháp am iloglucosidaia a. Nguyên tắc Tinh bột là hợp chất của các D glucoza được nối với nhau bằng liên kết glucozit a-1,4 (w95%) và a-1,6 i~5%). Trước khi xác định tinh bột cần tách hết glucoza vàịcác oligosaccarit bằng cồn 80“. ở trạng thái s ô i (5 -1 0 thể^lícíl cồn) sau đó định lưc|Bg glucoza bằng phương pháp enzim. Hoà ịtan tinh bột (dịch hoá) bằng nhiệt hoặc hoà tan bằng dim etyỊ-sulíoric (DMSO) híiặc hoà tan trong kiểm (NaOH, KOH), trong m uối (CaCl2 , N a sO b ,.. ỉ Thu}^ phân tinh bột bằng các enzim n h ư : + a-ặaBilaza và p-amilaza (EC 3.2.1.2) của thóc mầm và đại mạch. + AÈOÌIoglucosidaza (EC3.2.1.3) thu nhận từ Aspergillus (oryzad, niger), Rhizopus vặ Endomyces. Rhizopus Deleman dùng thuỷ phân có ưu điểm llơn cả so với các loại khác vì không chứa enzim transglucosidaza. Lượitg enzim phải được tính toán để thuỷ phân hoàn toàn lượng ịtinh bột trong thời îan xảy ra phản ứng. í Trong bài thí nghiệm, tinh bột được thuỷ phân thành glucoza bfelỊg enzim amiloglucoịaidaza, sau đó glucoza được định lượng bằng glucooxydaza (COD) và peroxydaza(POD). Sơ đồ thí nghiêm (sử dụng cho các sản phẩm chứa tinh bột): í ■ Ngâm bằng etanol 80% (rửa) Phân giải (hổ hoá + đun1hỏ135°C) Thuỷ phân bằng enzim (pH 4,8; 5 5 OC, 50% E/cơ chất) Lọc Định lượng glucoza (GOD, POD) Hình 5.5.1 c. Sơ đồ thủy phân tinh bột bằng enzim 148 ' Chương 6 LIPIT 6.1. GIÓI THIỆU • i L ip it hay còn gọi là chất béo là một trong nhưng thành phần thức ận chủ yếu của con người. Chất béo, protein và gluxit là ba chất cơ bản không thể ihiếu được trong quá trình cấu thành tế bào và đảm bảo các hoạt động sinh lý trong bơ thể con người. Chất béo dù ở dạng nhìn thấy được như mỡ động vật, dầu thậc vật, bơ, m acgarin... hoặc ở dạng không nhìn thấy được là thành phần trong miôt sô' thực phẩm như thịt, trứng, sữa, phomat.. .đều có vai trò rất quan trọng. T rtlỗ t tiên phải nói đến giá trị dinh dưỡng cao vì nó là thức ăn giàu năng lượng, năng lỊrợng cung cấp bởi tliộ l đơn vị khối lượng chất béo lớn gần gấp 2 lần một đơn vị khối lượng tương điỊỡBg cùa g lu x it và protein. Ig dầu m ỡ cung cấp 9,1 kcal ■ 1g glu xit cung Cấp 4 ,0 kcal 1g protein cung cấp 4,0 kcal Chái béo dùng làm thực phẩm có thể là mỡ động vật hoặc dầu thục vật. Đứng về phươãg diện sinh lý và mức độ tiêu hoá thì dùng dầu thực vật có nh|ều ưu việt hơn mỡ áộng vật. Thành phần axit béo trong dẩu thực vật chủ yếu là nhlliig axit béo không no như axĩt oleic (C 1 8 :l); axit linoleic (C18:2) và axit linolenic (C18:3), trong đó axit linoleic và axit linolenic là những axit béo không thay thế rất cần thiết cho cơ thể con người. Từ axit linoleic cơ thể con người có thể chuyển hoá thành axit 149 a-linolenic và axit arachidonic (C20:4) là axit có chức năng của vitam in F. Nếu trong thức ăn hàng ngày mà thiếu chất béo lâu dài sẽ dẫn đến những rối loạii về hoạt động sinh lý cũng như sự mất càn bằng vậi chất gây nên suy nhược cơ thể và íìhiều hiện tượng bệnh lý. Nói chung nhữiig axit béo không no có hoạt động sinh học cao, ví dụ như axit linoleic và axit linolenic có vai trò chuyển hoá cholesterol trong cơ cho nên ăn nhiều dầu thực vật có thể kéo dài được tuổi thọ và phòng chữa được một số bệnh về tim mạch. Ngoài ra chất béo còn có giá trị cảm quan, góp phần làm tăng giá trị về cấu trúc cũng như m ùi vị cùa các sản phẩm thực phẩm. 6.1.1. THÀNH PHẦN VÀ TÍNH CHẤT CỦA DẦU MỠ Nếu chỉ dựa trên những nét hoá học đại cương thì chất béo động vật và chất béo thực vật không có sự khác nhau lớn. Chúng đều cấu tạo chủ yếu là từ trig lyxe rit (90-95%). Về cấu tạo hoá học của chúng là este của rượu ba chức glyxerin và các axit béo có công thức: C H 2C O O R , CHCOOR2 C H 2C O O R 3 Do các axit béo tham gia tạo thành glyxerit trong dầu m ỡ khác nhau về loại, vể số lirợng nên giá trị sinh lý, giá trị thực phẩm của dầu mỡ khác nhau. V í dụ ở động vật thì axit béo tham gia tạo thành glyxerit chủ yếu là các axit béo no như axit panmitic, axit stearic..... Còn trong dầu mỡ thực vật thì chủ yếu là axit béo không no như axit oleic, axit linoleic. Thành phần hoá học các axit béo của trig lyxe rit của mỡ động vật hoặc dầu thực vật thay đổi tùy theo giống, địa điểm trồng trọt hoặc chăn nuôi, tuổi hoặc mùa thu hoạch. M ỗi loại chất béo khác nhau được đặc trưng bởi thành phần các axit béo khác nhau. 150 Thành phần các axit béo của trilyxe ril thực vật, trừ trường hợp đặc biệt đều là axit béo một chức, mạch thẳng và có số nguyên tử cacbon chẩn, thường hay gặp là các axit béo có 18 nguyên tử cacbon. Tính chất vật lý và hoá học của axit béo do số nối đôi và số nguyên tử cacbon tạo ra. Các axit béo no bền đối với các tác dụng khác nhau. Các axit béo không no dễ bị oxy hoá bởi oxy không khí làm cho dầu bị hắc đắng (ôi) bị polime hoá tạo thành màng, bị khử ở vị trí nối đôi (bị hydrogen hoá) chuyển thành axit béo no. Khả năng phản ứng của các axit béo không no tăng cìing với sự tăng nối đôi và nếu vị trí các nối đôi trong phân tử axit béo không phải là cách 3 nguyên tử c như thông thường mà cách 2 (nối đôi liên hợp liền) thì phản ímg oxy hoá và polime hoá sẽ xảy ra nhanh hơn. Tính chất của dầu và mỡ do thành phần các axit béo và vị trí của chúng trong phàn tử trig ly xe rit quyết định. T rig ly xe rit dạng hoá học tinh khiết không có màu, không mùi, không vị. Màu sắc, mùi vị khác nhau của dầu là do sự có mặt cùa các chất kèm theo. T rig lyxe rit do khối lượng phân lử tương đối cao, nên không bay hơi ngay cả trong điều kiện chân không cao. ở nhiệt độ trên 240"C-250"C trig lyxe rit sẽ bị phân hiiỷ thành các sản phẩm bay hơi. Dưới tác dụng của enzim lipaza, khi có nước và nhiệt, trig lyxe rit sẽ bị th iiỷ phân thành các axit béo tự do, do đó trong dầu mỡ bao giờ cũng có mật một sổ các axit béo tự do. Thành phần glyxerit của dầu và mỡ rất phức tạp. Sô' loại g lyxe rit trong thành phần dầu, mỡ có từ hàng chục đến hàng trăm. Trong dầu thô (dầu chưa tinh chê') còn có chất photpholipit, là một loại lipit phức tạp trong thành phần cấu tạo có photpho và nitơ. Về cấu tạo hoá học, photpholipit là dẫn xuất của glyxerit là dẫn xuất của triglyxerit. Đó là những trig lyxe rit mà một trong ba gốc axit béo dược thay thế bằng một gốc axit photphoric với nhóm thế. C HpCO Ri CHOCOR Trong đó X là nhóm thế (X có thể là hydro, rượu ỵO H amin cholin, etanolamin, xerin, ion zit...) c —o - P ^ O ^2 ox 15 Các photpholipit hoà tan tốt trong dầu và trong đa sô' các dung môi hữu cơ. Chúng có khả năng phản ứng hoá học dể hơn trig lyxe rit và rất dễ bị oxi hoá. Người ta có thể tách photpholipit ra khỏi dầu bằng cách thuỷ hoá dầu. Sau khi thuỷ hoá, photpholipit kết hợp với nước, mất khả năng hoà tan trong dầu và kết tủa cặn. Trong dầu thực vât còn có sáp^ là một loại lip it đơn giản, về cấu tạo hoá học, sáp là este của các axỊt béo mạch cacbon dài (có 24-26 nguyên tử cacbon) với rượu một hoặc hai chức. Ị C ô n Ị thức hoá học: R 1CH 2OCOR 2 trong đó: ! R| - gốc rượu; R 2 - |ố c axit béo. ( Sáp feũng như các este khác, dễ bị thủy phân nhưng so vớ i g lyxerit thì phản ứng xẩy ra iehậm và ở điều kiện mạnh hơn. I T r o i^ đầu mỡ còn có^một luợng nhỏ các hợp chất không béo, không xà phòng hoá j đó là nhóm các hợp chất hữu cơ có cấu tạo hoá học đặc trưng khác nhau và nó chínắ là những chất gây ra cho dầu có màu sắc và m ùi vị riêng biệt. Những chất gầy m |u trong dầu thường là sắc tô' hoà tan trong chất béo và những lip it mang màu, chẳnậ hạn trong dầu thường gập là nhóm carotenoit có màu vàng tươi đến đỏ sẫm, trong |đó quan trọng nhất là caroten có 3 dạng đồng phân a , p, y, chúng ! mang tính! chất provitamin A. Trong số các sắc tố hoà tan trong dầu còn có clorophin 1 ^ 1 cho dầu có màu phớt xanh. i Nhữág chất gây m ùi và vị của dầu là các tecpen, các hydrcx:acbiia mạch thẳng khác nhau và các sản phẩm phân huỷ chúng. Các ^lợp chất không béo, không xà phòng hoá trong dầu m ỡ còn ỉà những rượu đa vòỊig như các sterol, tcx:oferol mang tính chất của vitam in E, có hoạt tính chống oxy ôá mạnh, những dẫn xuất của naphtoquinol có tính chất của vitamin K. 152 6.1.2. CÒNG NGHỆ SẢN XUẤT DẦU THựC VẬT Hiện nay trong công nghiệp sản xuất dầu áp dụng rộng rãi hai phương pháp ép bằng những máy ép có cơ cấu khác nhau và phương pháp trích ly bằng các dung môi hữu cơ. Trong công nghiệp sản xuất dầu thực vật, ứng với các nguyên liệu khác nhau, có nhiều sơ đồ công nghệ chế biến khác nhau và ứng với m ỗi sơ đổ công nghệ có chế độ kỹ thuật nhất định. Nhưiig nói chung với đa số các nguyên liệu hạt dầu khi chế biến thành dầu đều qua các công đoạn kỹ thuật sau: Làm sạch: làm sạch hạt trước khi đưa vào bảo quản và chế biến có ý nghĩa quan trọng làm giảm độ ẩm cho khối hạt, giảm nhiệt độ cho khối hạt, giảm và tiêu diệt vi sinh vật, làm tăng thể tích hữu ích của kho và năng suất hữu ích của thiết bị, năng cao chất lượng của dầu sản phẩm và khô đầu. Sâỳ hạt: nhằm hạn chế hoặc giảm cường độ phá huỷ hạt do các enzim và vi sinh vật gây nên và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình bóc tách vỏ và nghiền nhân hạt n tó m nâng cao được hiệu suất tách dầu. Bảo quản: nhằm bào tồn các giá trị dinh dưỡng của hạt khỏi bị hư hỏng, làm tãng cường các đặc tính của hạt thuận lợ i cho quá trình chê' biến sau nhằm mục đích đạt hiệu suất tách dầu cao nhất và chất lượng sản phẩm thu được tốt nhất. Bóc tách vỏ: tạo điều kiện cho việc nghiền nhân được dễ dàng đạt đến độ nhỏ mong mu|ỉn, làm giảm tổn thất dầu trong quá trình sản xuất, nâng cao năng suất thiết bị và nhất là để nâng cao chất lượng của dầu và khô dầu. Đ ối với m ột số loại hạt dầu, do kích thước hạt rất bé vỏ dính chặt vào nhân rất khó khăn cho việc bóc tách thì thường nghiền và ép cả vỏ, nhimg nói chung ép cả vỏ đều ảnh hiỂíng không tốt cho quy trình sản xuất và chất lượiig của dầu và giá trị sử dụng của khồ dầu. Nghiền nhản: nhằm phá vỡ cấu trúc tế bào nguyên liệu chứa dầu, nhằm giải phóng dầu ở dạng tự do, kh i ép hoặc trích ly dầu dễ thoát ra. Bột càng mỏng, càng nhỏ các tế bào chứa dầu càng được giải phóng và do đó hiệu suất tách dầu sẽ cao. Chưng sấy: để tạo điều kiện cho bột nghiền có sự biến đối vể tính chất lý học, tức là làm thay đổi tính chất vật lý của phần háo nước và phần béo, làm cho 153 bột có tính đàn hồi, làin điìt hoặc làm yếu mối liên kết phân lử bền vững giữa dầu với các thành phần háo nước, khi ép dầu dể dàng thoái ra. Chưng sấy làm cho độ nhớt của dầu giảm, dầu linh động nên dễ dàng thoát ra khi ép. Chưiig sấy còn làm bay hơi bớt một phẩn chất gây mùi dưới ảnh hưởng của hơi nước và nhiệt độ cao, irong một vài trường hợp chưng sấy tạo cho một số thành phần không có lợi như các độc tố bị biến đổi tính chất. Chế độ kỹ thuật chưng sấy ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suấl tách dầu cũng như chất lượng của dầu và khô dầu. Ép: dưới tác dụng của áp lực ép, các phần lừ bội sẽ bị biến dạng và làm thoát dầu ra khỏi các khe vách giữa các bề mặt bên trong cũng như bên ngoài của các phần tử bột. Trích ly: dùng dung môi hữu cơ để hoà tan dầu có trong nguyên liệu rắn ở điều kiện xác định và sau đó tách dung môi ra khỏi dầu. Sau đây là một sơ đồ công nghệ chế biến hạt dầu bằng phương pháp ép: Dầu sau khi ép hoặc trích ly gọi là dầu thô. Thông thường để dùng vào mục đích thực phẩm và để có thể bảo quản được lâu dài hơn, dầu thô sau khi ép hoặc trích ly được tinh luyện để tách một số tạp chất hoà lan trong dầu. 154 vỏ Hình 6.1.2. Sơ đồ công nghệ ép dáu một lần 6.1.3. KIỂM TRA CÒNG NGHỆ SẢN XUẤT DẦU THựC VẬT M ục đích kiểm tra công nghệ sản xiiấl dầu thực vật là nhằm xem xét một cách có hệ thống phẩm chất nguyên liệu, điều kiện tiến hành là các quá trình và chất lượng của thành phẩm. Kiểm tra quá trình công nghệ trong sản xuất dầu thực vật cần phải đảm bảo theo dõi được các chế độ kỹ thuật đã để ra để thu được dầu, khô, bã và các sản phẩm chế biến từ dầu có phẩm chất cao đồng thời hạn chế mức độ thấp nhất tổn thất dầu trong sản xuất. 155 Hơi dung môi Bột chưng sấy 1_____í Chưng cất Làm nguội X Dầu Dung môi thu hồi Ị Bào quản Dung môi mới Bế chứa dung môi f Hình 6.1.3a. Sơ đồ công nghệ trích ly dầu Dầu thô Hình 6.1.3b. Sơ đ6 quá trình tinh luyện dầu Trong sản xuất dầu thực vật, kiểm tra sản xuất là kiểm tra thực tế quá trình côn g nghệ k ể c ả ỉả ểm tra thu nhận ngu yên vật liệu và k iểm tra thành phần. Kiểm tra phẩm chất hạt nhập vào cần đảm bảo sao cho ở nhà máy sản xuất dầu có được nguyên liệu đáp ứng đúng yêu cầu tiêu chuẩn do nhà nước đã ban hành. Trên cơ sở những số liệu về phẩm chất của hạt mà sắp xếp theo từng loại vào 156 các kho, bởi vì đối với mỗi loại nguyên liệu có phẩm chất khác nhau thì yêu cầu điều kiện bảo quản cũng khác nhau. Kiểm tra tình trạng nguyên liộu khi bảo quản, nhờ đó có thế tạo ra khả năng sao cho tổn thất nguyên liệu hạn chế được ở mức thấp nhất, đảm bảo cho dầu, khô hoặc bã dầu thu đuợc có phẩm chất cao. V ì vậy cần phảir^ặe biệt tìieo dõi, quan sát một cách có hệ thống nhiệt độ và độ ẩm của hạt trong bảo quản và xác định được chỉ sô' axit của dầu trong hạt. Kiểlíit tra hoạt động của các Ihiết bị như kiểm tra hoạt động của ịmáy làm sạch đượcitiến hành bằng cách xác định hàm lượng tạp chất trong hạt IB^C và sau khi làm sạch nhằm mục đích sao cho nguyên liệu sau khi đã làm sạch có lÈ m lượng tạp chất cờn lại thấp nhất, không để ảnh hưởng tới phẩm chất và cũng khâ^g làm hư hỏng hoặơ để các thiết bị bị ăn mòn. Kiểm tra máy bóc tách vỏ cần đảm bảo theo dõi chế độ xay xát và tách vỏ tốt. ' Kiểna tra sản xuất trong trích ly dầu cần đảm bảo ch o dầu và bã thu xdược phù hợp với tiêu chuẩn nhà nước, giảm tổn thất dung môi, an toàn ở chỗ làm Ýiệc trong phân xưởng trích ly. K iể tti tra sản xuất trong tinh luyện dầu cần xác định được lư ợ n í nước và nhiệt độ t iu ỷ hoá, lượng xút và nồng độ xút cũng như chế độ gia nhiệt; để trung hoà, rửa nhằm đảm bảo cho hiệu suất thu hồi dầu cao nhất và chất lư ợ i^ dầu tinh tốt nhất. ; NhíÉlg kết quả kiểm tra hoá học và cô n g nghệ sản xuất ch o thấy m pc độ của cô n g nghệ sản xuất, phát hiện được những thiếu sót của quá trình cô n g nghệ, tạo ra được những biện pháp nhanh chóng hợp lý hoá và tối ưu hoá liên tục côngỊ nghệ sản xuất. T ổ ehức lấy m ẫu kiểm tra nguyên liệu, sản phẩm tru ng gian ỳà th à n h phẩm Côitg đọạntìiii • n h ậ ỊÌỊ làm sạch, sấy đ ể đưa vào bảo ệuản '\ Hạt nhập về nhà máy lấy mẫu từ các phưcmg tiện vận chuyển 157 -> các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, hàm lượng tạp chất, hàm lượng dấu, chi số axit của dầu trong hạt, hình thái tự nhiên 1 0 0 0 hạt, nhiễm bẩn có hại • Hạt đem đi làm sạch và sấy lấy mẫu từ các bàng tải đưa hạt đi làm sạch —)• các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, hàm lượng tạp chất, hàm lượng dầu • Hạt sau khi làm sạch, sấy -> lấy mẫu từ các bãng tải đưa hạt vào kho hay vào sản xuất các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, hàm lượng tạp chất, hàm lượng dầu • Hạt bảo quản ở kho lấy mẫu từ kho bảo quản -> các chỉ tiêu cần xác định: nhiệt độ, độ ẩm, chỉ số axit của dầu trong hạt Công đoạn clìiiđii bị trước khi ép • Hạt đưa vào bóc và tách vỏ -> lấy mẫu từ băng tải chuyển hạt đi bóc vỏ các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, tỉ lệ vỏ và nhân, hàm lượng dầu của vỏ và của nhân, độ ẩm của nhân, hàm lượng tạp chất. • Nhân -> lấy mẫu từ cửa ra của máy bóc tách hoặc vít tải chuyển nhân vào máy nghiền các chỉ tiêu cần xác định: tỉ lệ hạt chưa bóc vỏ, tỉ lệ vỏ lẫn vào nhân, độ ẩm, hàm lượng dầu • Vỏ lấy mẫu từ ống đẩy vỏ ra khỏi nơi sản xuất các chỉ tiêu cần xác định: tỉ lệ nhân lẫn vào vỏ, độ ẩm, hàm lượng dầu • Bột nghiền —> lấy mẫu từ cửa ra của máy nghiền 158 - » các c h ỉ tiêu c ẩ n xác định: độ ẩm , mức độ nhỏ c ủ a hạt nghiền Công đoạn chưng, sấy, ép • Bột chimg -> lấy mẫu từ cửa vào tầng sấy ->■ các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, nhiệt độ • Bột ép lấy mẫu từ chỗ thoát ra ở tầng sấy hoặc trục tiếp liệu của máy ép -> các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, nhiệt độ • Dầu thô -> lấy mẫu từ sau máy ép và bể chứa sau khi lọc các chỉ tiêu cần xác định: độ trong suốt, hàm lượng cặn, độ ẩm, chỉ số axit • Khô dầu lấy mẫu từ cửa thoát ra của máy ép các chỉ tiêu cần xác định: chiều dày mảnh khô, độ ẩm, hàm lượng dầu Công đoạn tinh luyện dầu thực vật • Dầu đưa vào thuỷ hoá -> lấy mẫu từ thiết bị thuỷ hoá và từ ống hút vào thiết bị trung hoà các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, chỉ số axit, hàm lượiig photpholipit • Dầu Ihuỷ hoá lấy mẫu từ thiết bị thuỷ hoá và từ ống hút vào thiết bị trung hoà các chỉ tiêu cần xác định: nhiệt độ, độ ẩm, chỉ số axit, hàm lượng photpholipit • Dầu trung hoà -> lấy mẫu từ thiết bị trung hoà và cửa ra của thiết bị rìra sấy. 159 các chỉ tiêu cần xác định: nhiệt độ, độ ẩm, chi số axit, hàm lượng xà phòng. • Cặn xà phòng -)■ lấy mẫu từ thùng chứa cặn các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, hàm lượng dầu • Dầu tinh I -> lấy mẫu từ bể chứa dầu sau khi khử m ùi ; -» cếc chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, hàm lượng cặn, hàm lượng ph^tpholipit, chỉ sô' axit, các chỉ số cảm quan. 6.2. PHẦN THỰC HÀNH i ì Trong công nghiệp thực phẩm, việc phân tích chất béo nhằm ba mụlị đích: - X ác định hàm lượng chất béo c ó trong sản phẩm thực phẩm . - Xác định thành phần cùa chất béo. - x i c định chất lượng của chất béo. ’ Tuỳ theo sản phẩm và mục đích sử dụng mà ba mục đích phân tí(Ểh trên có tầm quan trọng khác nhau. V í dụ trong trường hợp đối với các hạt dầu thì ịviệc phân tích chủ fếu nhằm vào các mục đích xác định hàm lượng dầu và chất lượng của dầu. Đ ối Ị ú i người tiêu thụ hoặc một nhà máy chế biến dầu m ỡ thì việc xác định hàm lư ợ n i dầu lại không quan trọng bằng việc kiểm tra chất lượng và độ ịtinh khiết của dầu. I I 6.2,1. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT BÉO i BàỊ 1. Xác định hàm lượng chất béo bằng phư ơn g ph á p Soxh let PHiIb bì piláp dựạ vặo tính chất hoà tan của các chất béq vào dưng môi hữu cơ, chất béo được chiết ra khỏi mẫu phân tích bằng thiết bị chiết Soxhlet (hình 6 .2 .1) 160 a.Diuig cụ, lioú clìấĩ - 'rủ sấy; Cốc ihuỷ tinh; - Nồi cách thuỷ; Mặt kính đổiig hồ; - Bình hiìt ẩm; Ete petrol hoặc ete etylic (dung mỏi); - Cân phân tích; Bộ chiết Soxhlel. - Giấy lọc, bông; Hinh 6.2.1. Thiết bị Soxhlet; 1. túi giấy lọc; 2 . ống xiphông; 3. tháp trích ly: 4. binh cầu; 5. ống sinh hàn; 6 . nổi cách thuỷ. h. Tiếiì ììùỉììi Cân khoảng 5g mẫu phân tích dà được nghiền nhò cho vào ống giấy lọc (cần chú ý là ổng giấy lọc phải thấp hơn ống xiphông của máy chiết), gói kín ống giấy lọc và có lót bổng ở hai đầu. Sau đó cho vào tháp irích ly. Láp bình cầu đã được sấy khô và cân bằng cân phân tích để biết trọng lượng vào hộ thiết bị cùng với ống sinh hàn. Qua cổ ống sinh hàn rót dung môi vào bình cầu. Lượng dung môi rót vào chiếm khoảng 2/3 dung lích bình cầu hoặc 2 lần dung lích tháp irính ly. Cho nước chảy liên tục vào ống làm lạnh. Dùng nổi cách thuỷ đun bình cầu sao cho dung môi có nhiệt độ 40 -60"c. Để tránh tổn thất dung mồi, dung inôi trong bình cầu không 161 được sôi mạnh, đảm bảo sao cho cứ sau 1 giờ có 8-10 lần dung dịch mixen qua ống xiphông chảy xuống bình cầu. Thời gian trích ly liiỳ thuộc vào hàm lượng có trong mảu phân tích (6-10 giờ). Muốn biết quá trình chiết đã kết thúc hay chưa, lấy túi giấy lọc ra cho nhỏ vài giọt vào tấm kính đồng hồ hoặc tờ giấy lọc, khi dung m ôi bay hơi hết, trên mặt kính hoặc mặl giấy lọc không có vết chất béo thì quá trình chiếl đã kết thúc. Sau khi quá trình chiết kết thúc, bỏ túi giấy lọc ra rồi liến hành cất ete ngay trong tháp để thu hồi ete (trường hợp nếu dung dịch trong bình cầu đục, có lẫn bột nghiền thì phải lọc qua giấy lọc rồi mới cất thu hồi dung m ôi). Sau đó đem sấy khô chất béo ở nhiệt độ 100-105“c đến trọng lượng không đổi. Lần sấy đầu sau 1 giờ thì cân, các iần sau cứ sau nửa giờ. c. Tính kết quả Hàm lượng chất béo theo %, tính bằng công thức x% = ~^ 100 G trong đó: G,: trọng lượng bình cầu chứa chất béo, g; G 2; trọng lượng bình cầu không, g; G: lượng mấu phân tích, g; Sai lệch giữa 2 lần xác định song song không được quá 3%. B à i 2 . X á c đ ịn h h à m lư ợ n g c h ấ t b éo b ằ n g p h ư ơ n g p h á p F O L C H Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng chất béo của các sản phẩm rắn và lỏng. a. Dụng cụ, lioá chất - Máy ly tâm ; - Máy lấc đồng ’ 162 - Phễu chiết ; nhất h oặc máy khuấy - Bình cầu ; - Bộ cất chân không ; - Pipet : - Metlianol (CH,OH); - Bình húl ẩm ; - Dung dịch HCl 6N; - Phễu lọ c ; - Dung clỊch KC l 0,37M (27,58g//); - B()l aniiãng, cát, bông thuỷ tinh ; - Cồn tuyệt đối 99". - Cloroíooc (C H C l,) ; b. Tiến hành Cân Ig mẫu phân tích đã nghiền nhỏ (nếu mẫu phán tích là chất rắn) hoặc lấy 2,5-3ml (nếu mẫu phân tích là chất lỏng) vào cốc của máy li tâm (cốc có nút đậy). Thêm vào đó 20m l hổn hợp CHCiyCHÔH với li lệ 2:1 theo thể tích, lắc mạnh trong 1 phút (có thể lắc bằng máy khuấy từ hoặc máy đồng nhất), rồi thêm vào đó 80|.il HCl 6N đê’ yên ít nhất 2 giờ, sau đó thêm 4,2ml dung dịch KCl 0,37M, lắc mạnh rồi đưa \ ’ào máy li tâm quay khoảng 10 phút, lấy ra díing pipet loại bỏ phần trên còn phần dưới cho vào đó lOml dung dịch H 2O /CH 1O H/CHCI, (dung dịch này pha sẩn theo tỉ lệ 47/48/3 theo thể tích), lắc mạnh rồi ly tâm, loại bỏ phần trên còn phần dưới lại cho lOm l H20/CH,0H/CHC1t rồi lặp lại như trên lần 2. Sau khi loại bỏ phần Irên, phần còn lại cho vào phếu chiết, thêm vào đó một ít CHCl, và nước câ't, !ắc mạnh dể lắng rồi thu hồi lấy phần dưới vào một bình cầu đã cân sẩn để biết trọng lượng. Lại cho thêm C H C l, và nước vào phần còn lại ở phếu chiết, lắc để thu hồi hết chất béo còn lại ở phần trên. Phẩn dưới lại thu hồi vào bình cầu trên, sau đó lắp bình cầu vào một bộ cấl chân không để cất đuổi CHCI 3 sau đó cho ít cồn tuyệt đối vào bình cầu và cất cho đốn khô. Phần còn lại trong binh cầu chi là chất béo. Để bình cầu vào bình hút ẩm rồi cân (nếu trường hợp thấy trong bình cầu đục hoậc có cặn thì cho vào đó ít CHCl, và lọc qua lớp bột amiăng, cát, bông thuỷ tinh rồi rnới cất đổ tách hết CHCl,) c. Tính kết quả Hàm lượng chất béo theo % tính bằng công thức sau: G. -G 100 G 163 trong dó: Gj : trọng lượng bình cầu chứa chất béo, g; G 2 : trọng lượng bình không, g; G : irọỉig lượng mẫu phân tích, g. 6.2.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN CHẤT BÉO Việc xác định thành phần châì béo nhằm kiểm tra độ linh khiết của m ội loại dầu hoặc mộl loại mỡ nào đó hoặc để xác định bản chất của loại dầu mỡ có trong sản phẩm. Đế xác định thành phần chất béo, người ta dùng các phương pháp sắc ký, phương pháp lý hoá hoặc các phương pháp hoá học bằng cách xác định các chỉ số hoá học. Bài 3. Xác định thành phẩn axit béo có trong dấu m ỡ Việc phân tích thành phần axit béo của một chất béo cho chúng ta biết bản chất của chất béo đó là loại dầu gì hoặc mỡ gì bởi vì m ỗi loại chất béo khác nhau được dạc irim g bởi thành phần các axit béo khác nhau. Thành phần axil béo của dầu thực vật hoặc mờ động vậi thay đổi tuỳ theo giống, địa điểm trổng trọt hoặc chăn nuôi, luổi hoặc mùa thu hoạch. So sánh thành phần các axil béo của mẫu phân tích với các bảng thành phần axit béo của chất béo cho trong tài liệu (bảng 6 .2 .2 a và bảng 6 .2 .2 b) để nhạn biết được loại chất béo. Ví dii\ dầu dừa hoặc dầu nhân cọ chứa khoảng 50% axit lauric, dầu lạc, dầu đậu tương chứa nhiều axit oleic, đầu cùi cọ chứa nhiều a x il panmetic, Irong bơ của cacao ihì thành phần axit panmetic, axit slearic và axit oleic gẩn bằng nhau.Trong dầu thực vật thường không có các axit béo, có số phân tử cacbon lẻ. 164 B á n g 6.2.2a. Thành phấn axit béo của một số chất béo thực vật (%) Lạc Đậu Dừa Nhân tưdng Cùi cọ co Hướng Olỉu dưdng C8 3,4^15 2.4-6,2 CIO 3,2-15 2.6:7 C12 41-56 41-55 0.3-1.2 C14 13-23 14-20 0,5-5.9 Bơ cacao 95%), chiết được những chất bay hơi có trong dung dịch ờ nồng độ loãng và tốn ít dung môi. Dung dịch chiết được nhiều khi không cần cô đặc. Hình 7.2.4. Thiết bị chiết Likens- Nickerson (loại dung môi nhẹ hơn nước): 1. bình cầu đựng dung dịch phân tích; 2. bình đựng dung môi; 3. buồng hỗn hợp hơi dung môi và hơi nước kéo chất thơm; 4. ống sinh hàn; 5. ống xi phông. 7.2.5. CÔ ĐĂC Sau khi chiết các chất thcrm bằng phương pháp chưng cất hoặc trích ly bằng các đung môi hữu cơ, dung dịch thu được cần được cô đặc trước khi đưa vào phân tích bằng máy sắc ký khí. Thường đối với phương pháp chưng cất theo hơi nước, dung dịch nirớc có chứa chất thcfm thường có nồng độ loãng, để cô đặc trước hết là tiến hành chiết lấy 196 những chất thơm trong dung dịch nước bằng dung m ôi hữu cơ, sau đó cấl cho bay hơi dung m ôi bằng cột Vigreux. Dung dịch sau khi trích ly được đựng trong bình cầu 2. Sau đó lắp thiết bị như hình vẽ 7.2.5. Bình 2 được đun nóng đến nhiệt độ sôi, hơi dung môi sẽ qua cột Vigreux rồi qua ống sinh hàn và được ngưng tụ rồi rơ i xuống bình thu hồi dung môi 4. Đun như vậy cho đến khi ở bình cầu 1 còn lại thể tích khoảng 2ml. Hình 7.2.5. Hệ thống cô đặc dung mòi sau khi trích ly: 1. cột Vigreux; 2. bình cầu; 3. dung dịch để cô đặc; 4. binh thu hổi dung môi; 5. đường nước vào. 7.2.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN ĐOẠN VÀ NHẬN BIẾT Dung dịch chiết được là hỗn hợp các cấu tử chất thcrn. Để tách được các cấu tử chất thơm, người ta dùng phương pháp chưng cất phân đoạn, các phương pháp sắc ký. Hiện nay để phân tách từng cấu tử chất thcfiĩi, phương pháp hay dùng nhất là phương pháp sắc ký khí (hình 7.2.6a). 197 C ó iiạ Ix n ii IU .H I Hình 7.2.6a. Nguyên lý phương pháp sắc ký khí Hỗn hợp chất thơm sau khi chiết được bằng các phương pháp trên được cô đặc và được đưa vào máy sắc ký khí để tách tìmg cấu tử chất thơm. T iiỳ từng loại hợp chất bay hơi mà người ta sử dụng các máy sắc ký có cột và detectơ khác nhau, thông dụng nhất là loại detectơ ngọn lửa ion hoá. Căn cír vào phổ sắc ký người ta định lượng được các hợp chất bay hơi có trong dung dịch mẫu phân tích. Thành phần của hỗn hợp chất thơm được thể hiện dưới dạng tín hiệu cùa detectơ hay còn gọi peak trên sắc ký đồ. Để xác định tên gọi của từng peak, cần dựa vào thời gian luxi của chất chuẩn đã được phân tích trên cùng chương trình phân tích. Định lượng thành phần trong hỗn hợp, có thể dựa vào tỷ lệ phần trăm diện tích peak hoặc bằng phương pháp xây dimg đường chuẩn, kết hợp với detectơ khối phổ (hình 7.2.6b). 198 Hinh 7.2.6b Nguyên iý hoạt động của detectơ khối phổ 7.3. PHẦN THỰC HÀNH Hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu là chỉ số đặc trưng về chất lượng của nguyên liệu đó. Để xác định hàm lượng tinh dầu có thể dùng phưcfng pháp chưng cất với các loại thiết bị khác nhau. Bài I. C h im g cất tỉnh dầu theo phương pháp Clevende a. Dụng cụ, lioá chất - Thiết bị Clevende - Bếp điện - Nước cất b. Cách tiến liànlì Mẫu nguyên liệu (hoa hồi đã được nghiền nhỏ hoặc lá hương nhu...đã được thái nhỏ) được cân khoảng 25-50g (tuỳ thuộc vào lượng tinh dầu trong nguyên liệu nhiều hay ít) cho vào bình cầu 1. Lắp thiết bị như hình vẽ 7.3a. Đặt bình cầu lên bếp điện. Qua ống sinh hàn 3 rót vào bình cầu 150-200ml nước cất rồi đun. Nước trong bình sôi. Hỗn hợp hơi nước và tinh dầu sẽ theo ống dẫn hơi lên ống sinh hàn và ngưng tụ lại chảy xuống ống thu tinh dầu, ở đây do tinh dầu không hoà tan trong 199 nirớc và tùy theo khối lượng riêng của nó lớn hơn hoặc nhỏ hơn khối lượng riêng của nước mà chìm xuống dưới (hình 7.3a A ) hoặc nổi lên trên (hình 7.3a B), hoặc, còn nước chưng theo ống xiphóng b hồi lini vào bình cầu 1. Thời gian chưng cất kéo dài cho tới khi thấy lượng trong ống ihu c không đổi thì ngừng cất (khoảng 2-3 giờ tuỳ thuộc vào loại nguyên liệu). Sau khi chimg cất kết thúc, để nguội, đọc lirợiig tinh dầu trong ống thu. a. Tính kết quả: Hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu, tính theo % khối lượng nguyên liệu được xác định bằng công thức sau: E% = a.7 .100 m trong đó: a: thể lích tinh dầu có trong ống thu; ỵ: khối lượng riêng của rinh dầu; m: khối lượng pơuyên liệu nghiên cứu. Nếu tính hàm lượng tinh dầu theo khối lượng chất khô tuyệt đối thì: 200 Et% = a.y.ioo m 100 (lOO- w) trong đó: W - hàm ẩm của nguyên liệu; Các ký hiệu khác như trẽn. Bài 2. Chưng cất tính dăii theo phương pháp Ghinbe Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu hoặc trong nước chưng, loại nhẹ hơn nước. a. Dụng cụ, hoá clìấí Bình cầu 500ml; Bếp điện; Ống sinh hàn; Nước cất. Ống Ghinbe; b. Cách ĩiển lìàỉìlì Cân 30-40g nguyên liệu đã nghiền nhỏ hoặc 250-300ml nước chưng cho vào bình cầu 1. Lắp thiết bị như hình vẽ 7.3b: Hinh 7.3b. Thiết bị Ghinbe: 1. bình cầu; 2. ống Ghinbe; ống Ghinbe 3. ống sinh hàn; 4. bếp điện. 201 Nếu xác định hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu, qua ống sinh hàn rót vào bình cầu 250-300ml nước cất. Đun sôi bình cầu trên bếp điện. Hỗn hợp hơi nước và tinh dầu bay lên ống sinh hàn 3 ngưng tụ lại chảy vào ống Ghinbe. Tinh dầu nằm ở trên còn nước chưng theo ống xiphông chảy về binh cầu. Thời gian chimg cất kéo dài khoảng 2-3 giờ. K h i thấy nước tinh dầu trong ống Ghinbe không thay đổi thì ngừng cất, để nguội. Lấy ống Ghinbe ra đọc lượng tinh dầu. d. Tíitli kết quả Cách tính kết quả như bài 1. Bài 3. Phân tích thành phần tỉnh dầu bằng phư ơng p h á p sắc ký khí 1. Nguyên tắc K h i bơm mẫu vào buồng bơm mẫu, dưới tác dụng cùa nhiệt độ làm bay hơi các cấu tử của dung m ôi và của các cấu tử cần phân lích. Dòng khí mang sẽ dẫn các cấu tử bay hơi vào cột tách sắc ký, tại đày diễn ra sự tương tác giữa các chất hấp phụ được phủ bên trong cột và các cấu tử nên các cấu tử bị giữ lại trên cột. Tuỳ theo tính chất của các cấu tử mà tương tác với chất hấp phụ khác nhau nên thời gian lim của các cấu tử cũng khác nhau. Dòng khi mang vẫn được đưa liên tục vào cột tách và nó sẽ mang những cấu tử đã tách ra khỏi cột tách qua ngọn lửa hyđro do đó làm thay đổi độ dẫn điện của ngọn lửa. Dctector sẽ ghi lại sự thay đổi này và đưa ra sắc ký đồ của cấu tử cần phân tích 2. Dụng cụ, rliiết bị a. Dụng cụ Càn phân tích 10-4g; ố n g thuỷ tinh. X ylanh 1 |,il; b. Thiết bị Thiết bị ký sắc ký kh í GC 2010, Shimadzu, Nhật Bản; Điều kiện chạy máy ; K h í mang: n it ơ ; Vận tốc dòng: 1,25 m l/ p h ú t; 202 Detector: detector ion hoá ngọn lửa (FID ); Cột tách: DB W ax, 60 m X 0,25 mm X 0,25 um; Chế độ chia dòng: 1 :50; Chương trình nhiệt độ: 70 "c (2 phút), 2"c/phút, 230 "c (20 phút); Nhiệt độ injector và detector: 250 ”C; Thể tích mầu: 0,2 |.il. 3. Hóa chất, thuốc thử a. Hoá chất, thuốc thử Q íc loại dung m ôi và chất chuẩn thuộc nhóm monoterpen, sesquiterpen độ tinh khiết 99,9%; K hí nitơ 99,999%. 1. Kết quả lín hiọu săc ký Hình 7.3.3. sẳc ký đổ tinh dầu Citrus kumquat (DB Wax, 60m X 0,25 mm X 0,25 um) 203 B ả n g 7.3.3. Một số thành phần tinh dẩu mẫu Citrus kumquat 204 STT Thành phần Thời gian lưu Hàm lượng (% diên tích peak) 1 p - Pinen 7,2 0,250 2 Sabinen 8,6 0,107 3 3 - Caren 8,8 0,192 4 Mycren 9,2 1,627 5 a -Phellandren 9,7 0,055 6 Limonen 11,5 94,817 7 p - Phellandren 11,9 0,101 8 z- 13,0 0,013 |3 - Ocimen 9 Terpinolen 14,0 0,004 10 Octanal 14,5 0,172 11 Tetradecan 14,8 0,059 12 Z- Limonen oxyt 16,8 0 ,0 0 4 13 Menthon 17,6 0,010 14 Citronellal 20,0 0 ,0 3 5 15 Decanal 20,8 0 ,1 2 3 16 /7-Cubeben 23,3 0,012 17 Octanol 25,3 0,011 18 Terpinen - 4 - ol 27,4 0,029 Chương 8 VITAMIN 8.1. GIÓI THIỆU Các vitam in được chia làm hai nhóm - Nhóm hoà tan trong chất béo gồm các vitamin A, D... - Nhóm hoà tan trong nước gồm vitamin nhóm B ( B l, B2...) và vitamin c. N ói chung các loại thịt, cá, trứrig, sữa có đủ các vitam in hoà tan trong chất béo và vitam in hoà tan trong nước. Riêng gạo và trứng có chứa nhiều vitamin A, D cũng như B l, B2... Ngũ cốc chủ yếu chứa vitamin nhóm B nhưng hoàn toàn không có vitam in c . Trong ngũ cốc chỉ có ngô vàng chứa khoảng 0,4mg caroten trong lOOg. Các loại hạt họ đậu là nguồn cung cấp vitamin nhóm B rất tốt và một lượng nhỏ caroten, còn vitam in nhóm B và vitamin c ở hàm lượng rất thấp. Các loại rau quả có đầy đủ caroten, vitam in nhóm B với lượng rất ít nhưng lại chứa khá nhiều vitam in c. Ngày nay một số vitam in còn được gọi theo bản chất hoá học của chúng, ví dụ; Vitam in c là axit ascorbic, BI là thiamin, B2 là riboílavin... Trong chương này, chúng tôi chỉ trình bày một sô' phưcmg pháp xác định caroten, vitam in A , vitam in c và vitamin B l, B2. 205 8.2. CAROTEN VÀ VITAMIN A V itam in A chỉ được tổng hợp trong cơ thể người từ caroten của thực vật do thức ăn đưa vào cơ thể. Dưới tác dụng của men carotenaza, caroten tạo nên vitamin A. Trong thực vật tồn tại cả ba loại đồng phân của caroten: a, p và y-caroten, trong đó quan trọng nhất là P-caroten. Do tác dụng của vitam in A và caroten đối với cơ thể rất giống nhau nên khi phân tích cần xác định caroten riêng hoặc xác định lổng lượng caroten và vitam in A. Thông thường đối với thực phẩm nguồn gốc thực vật người ta quy hoàn loàn ra caroten, đới với thực phẩm nguồn gốc động vật thì quy hoàn toàn ra vitam in A trên cơ sờ 3 caroten bằng 1 vitam in A. Bài 1. Xác định caroten bằng phương ph áp sắc ký cột a. Nguyên tắc Tách caroten ra khỏi lương thực, thực phẩm bằng phương pháp sắc ký cột rồi đem so màu. b. Dụng cụ, lioá chất - Cân phân tích - Bình định mức V = 50ml, lOOml - Cối sứ - M áy so màu - Cột sắc ký: dài 30cm, o = Icm - Cát tinh chế: đổ cát qua rây có đường kính lỗ 4 - 5mm. Rửa cát qua rây bằng nước máy, rồi dùng HC l (tỷ lệ 1/1) cho vào cát, khuấy kỹ, ngâm 1 đêm. Rửa cát cho tới hết axit. Rửa lại bằng nước cất, sấy khô. - Benzin: nhiệt độ sôi 70 - 80"C. - Chấp hấp phụ; Nhôm oxyt (A I 2O,) loại dùng cho sắc ký, sấy ở 100"C trong 1 giờ, bảo quản trong bình làm khô có chất chống ẩm silicagen. - Natrisuníat khan (Na 2S0 4 ). 206 - Dung dịch azobenzen tiêu chuẩn: Cân chính xác 0,145g azobenzen cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm rượu etylic 96% đến vạch mức, lắc kỹ. K hi thí nghiệm, đem dung dịch này pha loãng gấp 10 lần bằng rượu etylic 96%. Dung dịch này để ở chỗ tối, màu sẽ không biến đổi. c. Cách tiến hành Cân 5 gam mẫu lương thực, thực phẩm khô cho vào cối sứ, nghiền kỹ với 5 gam cát sạch trong 30 phút. Đê làm khô kỹ, ta cho thêm vào cối sứ 10 gam Na2S0 4 khan nghiền tiếp hỗn hợp trong 30 phút nữa. Phần dưới của cột sắc ký được nhồi bông thấm nước. Sau đó cột được nhồi nhôm oxyt khoảng 2/3 cột. Dùng đũa thuỷ tinh nén nhôm oxyt cho chặt. Trên cùng lại đặt 1 lớp bông dày 1 cm. Bột khô từ cối được chuyển vào phần trên của cột sắc ký. Cho benzin vào cột đến khi thấy lớp bột không thấm benzin nữa. Sau đó dùng bơm hút nhẹ để lớp bột được rửa chầm chậm bằng benzin đến khi không còn thấy những giọt màu vàng chảy ra khỏi cột sắc ký vào bình hứng. Cần chú ý cho benzin phủ ngập lớp bột vì caroten để bị oxy hoá bởi không khí. Chuyển toàn bộ caroten từ bình hứng vào bình định mức dung tích 50ml hoặc lOOml (tuỳ thể tích nước hứng được) và thêm benzin đến vạch mức, lắc nhẹ. Dung dịch caroten này được đem so màu cùng với dung dịch azobenzen tiêu chuẩn (đã pha loãng 10 lần). Trong Im l dung dịch có mầu giống dung dịch azobenzen tiêu chuẩn chứa 0,00235 mg caroten. c. Tính kết CỊiiả Hàm lượng caroten (tính theo mg trong lOOg sản phẩm) được tính bằng công thức: x= 0,00235.lOO.V.D,, in trong đó: V - dung tích bình định mức chứa dung dịch caroten trong benzin, ml; G - lượng mẫu cân, g; 207 D,,. - mật độ quang hoặc chiều cao thước (trên máy Dubốt) của dung dịch azobenzen tiêu chuẩn, mm; D „ - mật độ quang, hoặc chiều cao thước (trên máy D iibốt) của dung dịch caroten, mm. Hình 8.2. Cột sắc ký xác định caroten B à i 2 . X á c đ ịn h v ita m ỉn A b ằ n g p h ư ơ n g p h á p s o m à u a. Nguyên tắc V itam in A là một alcohol cao cấp chưa no có công thức hoá học như hình sau và thường kết hợp với axil béo (palinitic và stearic) tạo thành este phức tạp. V ì vậy khi muốn xác định vitam in A phải xà phòng hoá các sản phẩm, rồi xác định vitam in A trong phần không xà phòng hoá. Vitam in A được tách ra khỏi dung dịch không xà phòng hoá bằng cloroform khan và nó cho phản ứng với antimon (III) clorua tạo sản phẩm màu xanh và đem so màu với dung dịch tiêu chuẩn. HsC^ ^CHa /^ \ H2C ọ ----- (CH=CH-CCH3=CH)2-CH20H H2Ò^ c— c H2 208 CH3 V it a m in A iì. Dụiiị’ cụ, lioá chất - Cân phân tích; - Bình nón dung tích 250ml; - Phều chiết; - Ông làm lạnh; - Nồi cách thiiỷ, cốc thuỷ tinh dung tích 250ml, bình định mức dung tích 25ml, 500ml; - Ong nghiệm dung tích lOml, 22 cái, giá để ống nghiệm; - Dung dịch màu tiêu chuẩn được chuẩn bị như sau: cân 75g đồng sunfat (CUSO4.5 H 2 O) và 3,5g coban nitrat Co(NO ,)2 cho vào bình định mức dung tích 500ml, thêm nước đến vạch mức, lắc kỹ cho tan hết. Từ dung dịch này tạo dãy màu tiêu chuẩn theo bảng 8.2.4. Bảng 8.2.4. Dãy dung dịch màu tiêu chuẩn sốm l SỐ ống Sô đơn Số ống Số ml Số đơn nghiệm DD gốc Nước vi màu Nghiệm DD gốc Nưóc vi màu 1 20 0.0 9.2 12 20 31,6 4.0 2 20 0.4 9.0 13 20 41.2 3.5 3 20 1.6 8.5 14 20 55.4 3.0 4 20 3.0 8.0 15 20 742 2.5 5 20 4.5 7,5 16 20 104,2 2.0 6 20 6.3 7,0 17 20 131,0 1,75 7 20 8.7 6.5 18 20 175,0 1.5 8 20 11.6 6.0 19 20 190,0 1,25 9 20 14,6 5.5 20 20 240,0 1.0 10 20 19,0 5.0 21 20 330,0 0,75 11 20 24,4 4,5 22 Nước cất - - - Giấy quì, natri suníat khan: đã sấy ở 100"C trong 1 giờ - C loroform (C H C l,): Rửa 5 lần bằng nước cất tỷ lệ 2 nước : 1 cloroíorm trong phễu chiết rồi làm khô bằng natri simfat khan sau đó chưng cất để thu dịch tinh chế. 209 Dung dịch antimon ( III) clorua (SbClO bão hoà: SbCl, được rửa bằng cách khuấy trong cloroíorm đến khi nuớc rửa không màu, SbCli đã rửa được để trong bình làm khô (có chứa axit suníuric đặc) qua 2 ngày, sau đó hoà tan SbCl, trong cloroform đến bão hoà. - Ete etylic tinh khiết - K ali hyđroxit dung dịch 20% trong rượu etylic b. Cách tiến hành Cân 10 đến 20 g mẫu cho vào bình nóng dung tích 250ml thêm 20ml dung dịch kali hyđroxit 20% trong rưcru etylic. Đậy bình bằng nút bấc có gắn ống làm lạnh và đun hồi lưu trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ 85 - 90"C trong 2 giờ để xà phòng hoá. Dung dịch đã xà phòng hoá được pha loãng bằng 20ml nước cất rồi chuyển vào phễu chiết. Thêm vào phễu chiết 50ml ete etylic và lắc kỹ (để tránh tạo huyền phù, cần chiết dịch lúc nguội và lắc mạnh) chiết phần không xà phòng hoá ra (lớp trên) vào một phễu chiết thứ hai. Lại thêm 25ml ete etylic vào phần xà phòng hoá, tiếp tục lắc và chiết lấy lớp trên vào phễu chiết thứ hai. Rửa dịch chiết bằng nước cất trong 3 - 4 lần m ỗi lần 2 0 m l nước cất cho đến khi nước rửa có phản ứng trung tính (thử bằng giấy quỳ). Làm khô nước chiết đã rửa bằng 6 gam natrisunfat khan trong 30 phút. Chuyển cả dung dịch vào cốc, sau đó đun đuổi ete trên nồi cách thuỷ. Hoà tan cặn không xà phòng hoá thu được bằng cloroform (sau khi đã đuổi hết ete) và chuyển vào bình định mức dung tích 25m l, thêm cloroíonn cho đến vạch, lắc nhẹ. Cho vào 1 ống nghiệm (khô, sạch, cùng màu, cùng kích thước như ống nghiệm chứa dung dịch tiêu chuẩn) đúng 0 ,2 m l dung dịch trong bình định mức trên, thêm vào 1 - 3 giọt anhydric axetic, 2ml dung dịch SbCl, bão hoà lắc nhanh và để không quá 1 0 giây đem đo màu với ống tiêu chuẩn trong 2 0 giây. c. Tính kết quả Hàm lượng vitam in A tính theo đơn vị màu của ống tiêu chuẩn có màu trùng với màu của ổng nghiệm chứa dung dịch mẫu. Nếu màu của ống mẫu nằm giữa màu của 2 ống tiêu chuẩn thì lấy trị số trung bình. Cuối cùng hàm lượng vitam in A (mg trong lOOg sản phẩm) tính bằng công thức: 210 X= n .v G.4 n - số đơn vị màu tìm được khi so màu; V - dung tích bình định mức chứa dung dịch không xà phòng hoá trong cloroíorm , ml; G - lượng mẫu cân, g; 4 - hệ số thực nghiệm để tính ra mg%. 8.3. NHÓM VITAMIN c, BI VÀ B2 B ài 3 . Xác định vitamin c a. Nguyên tắc V itam in c (axit ascorbic) có phổ biến trong cơ thể động và thực vật. Nó tham gia vào nhiều quá trình oxy hoá khử xảy ra trong cơ thể người. Trong phân tử ascorbic chứa nhóm dienol (-C O H =C O H -) có tính khử mạnh. V itam in c dễ bị oxy hoá thành axit dehydroascorbic, phản ứng có tính thuận nghịch. 0 = c -------- 0 = 9 -----■2H c — OH c — OH 1 ò= 0 Ó c HỌ---------- HC I. HO— ỘH HO— CH L CH2OH Axit ascorbic o CH2OH Axit dehydro ascorbic A x it dehydroascorbic cũng như axit ascorbic là chất hoạt động sinh học mạnh và chống xuất huyết. Dựa trên tính khử-m ạnh của axit ascorbic người ta đã đề ra hàng loạt phương pháp hoá học để định lượng nó. Tuy nhiên, cho kết quả chính xác nhất và hay dùng nhất là phương pháp cho axit ascorbic khử m uối natri của 2 ,6 diclophenolindophenol. Màu xanh đen của chất chỉ thị này (dạng oxy hoá) khi gặp axit ascorbic sẽ chuyển thành không màu (dạng khử). 211 Xác định vitam in c dựa trên nguyên tắc: vitam in c được chiết ra khỏi lương thực, thực phẩm bàng axit axetic hoặc axit clohydric. Các chất khử khác và chất màu khác phải được tách ra khỏi nước chiết bằng chì axetat. Sau đó chuán độ nước chiết trong m ôi trường axit (pH = 3-4) bằng 2,6 diclophenolindophenol, rồi tính ra lượng vitam in c . b. Dụng cụ lioủ chất - Cân phân tích; - Bình định mức dimg tích lOOml, lOOOml; - Cốc dung tích lOOml; - Bình nón dung tích 200ml; - Pipet các loại; - M icroburet; - Giấy lọc; - Phễu thuỷ tinh, cối chày thuỷ tinh hoặc sứ, bột thuỷ tinh hoặc cát sạch; - HC l 1% hay CH,COOH 5%, axit metaphotphoric 2% hay axit oxalic 1%; - Dung dịch oxalat amoni bão hoà, dung dịch hồ tinh bột 1%; - K I tinh thể, H2SO4 2% , axit ascobic tinh thể (tinh khiết); - Dung dịch muối natri 2,6 diclophenolindophenol 0,001 N. Cho 0,15g 2,6 diclophenolindophenol vào bình định mức dung tích 500ml, thêm 350 m l nước cất và tiếp đó dung dịch đệm photphat có pH = 6,9-^7,0 cho tới vạch mức. V ì trong dung dịch nước thuốc thử này bị phá huỷ rất nhanh nên phải pha trong dung dịch đệm. Dung dịch đệm có pH = 6,9-^7,0 được pha như sau: trộn 2 thể tích K H 2PO 4 (9,078 gam trong 1 lít) và 3 thể tích Na 2HP 0 4 (11,867 gam NÍI2HPO 4.2 H 2O trong 1 lít nước) với nhau trước khi đem dùng. Thuốc thử 2,6 diclophenolindophenol được bảo quản trong bình có màu ở nơi tối. 212 c. C á c h tiế n h à n h - Chuẩn bị mẫu thử: Tất cả các sản phẩm dạng lỏng hoặc bột đểu phải trộn đều nhưng không lắc để tránh lên bọt khí. Lượng cân sản phẩm lấv tiiỳ thuộc vào hàm lượng vitam in c của nó. K hi hàm lirợng ít thì lấy mầu nhiều hoặc ngược lại. Theo kinh nghiệm thì nên lấy lượng cân các sản phấm như sau 8.3a. Báng 8.3a. sản phẩm và lượng mẫu tương ứng Mầu Lưọng cản 10 - 50 g Thực vật tươi (rau, quả) Nước ngọt (cam, chanh... 1 - 50 g Đổ hộp Quả khô 5 - 10 g 10 g Chuẩn độ đối với xán plìẩiìi lỏng Lấy một lượng cân chất lỏng nhất định cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm vào bình 20ml dung dịch axit clohydric 1% hoặc axit axetic 5% thêm nước cất đến vạch mức lắc kỹ. Nếu thấy có cặn cần lọc lấy dịch trong. Hút lOml dịch trong và đem đi chuẩn độ bằng dung dịch 2 ,6 diclophenolindophenol. Clniẩii độ đối với sản pliẩiiì dạng kììác Cân vào cối sứ lượng mầu như đã nêu ở trên, thêm H C l 1% hoặc axit axetic 5% cho ngập mẫu. Nghiền cẩn thận mẩu, tiếp đó chuyển hoàn toàn hỗn hợp vào bình định mức dung tích lOOml. 'riiêm vào bình định mức dung dịch axit metapholphoric 2% (25m l) để loại bỏ prolein và giúp cho quá trình lọc được dể dàng, rồi thêm H C l 1% đến vạch mức. Có thể dùng axit oxalic 1% dếtráng cối và thèm đến vạch mức, axetat chì 5% (5m l) để kết tủa protein, loại trừ chất khử và K h i thí nghiệm với các phẩm vật có nguồn gốc hoặcdùng sắc tố. dộng vậtthì dùng axit tricloaxetic 20% sao cho nồng độ cùa nó đạt 5% trong dimg dịch (25 ml). Trường hợp không có axit metaphotphoric hoặc oxalic, có thể chi dùng riêng một mình H C l 1% hay axit axetic 5%. Sau khi để yên 10 phút, lắc cẩn thận và lọc. 213 Dùng pipel hút vào bình nón hoặc cốc nhỏ 5ml dịch lọc có chứa vitamin c , ihẻm 5ml dung dịch oxalat amoni bào hoà, lOml nước cất và định phân bằng dung dịch 2,6 diclophenolindophenol 0,001N từ microburei cho tới xuất hiện mầu hồng bền (không mất mầu trong 1 phút). Trường hợp dùng axit oxalic thì không cần cho thêm oxalat amoni nữa. Chú ý K hi xác định vitam in c irong một phẩm vật nào đó phải tiến hành phân tích ít nhất là 2 mẫu thí nghiệm, đối với mỗi mẫu - 2 lần xác định. Kết quả định phân không được sai lệch nhau quá 0,03ml 2,6 diclophenolindophenol 0,001 N. Phải dùng microburet để định phân. Thời gian định phân không kéo dài quá 2 phút và lượng 2,6 diclophenolindophenol dùng trong định phân nên ở trong khoảng l - 2 m l (không quá 2 ml). c. Tính kết quả Hàm lượng vitamin c (mg %) tính theo công thức: ^ _ ( a - b ) f.V .1 0 0 X —---------------------5.m trong đó; a: sô' m l 2, 6 diclophenolindophenol dùng định phân dịch chiết vitam in C; b: sô' m l 2 , 6 diclophenolindophenol dùng định phân mẫu kiểm chứng (hỗn hợp các thuốc thử đem dùng); f: số mg axit ascorbic ứng với 1 m l dung dịch 2 ,6 diclophenolindophenol; v: tổng thể tích pha loãng; m: lượng mẫu cân, g: 5: 5ml dịch lọc hút đem chuẩn độ. Để xác định hệ số f ta tiến hành như sau: Hoà tan 1 - l,5m g (lấy ước lượng không cần cân) axit ascobic tinh khiết trong 50ml H2SO4 2%. Lấy cnính xác 5ml dung dịch đó và chuẩn độ bằng dung dịch 2,6 diclophenolindophenol cho đến màu hồng bền (không mất màu sau 1 phút). 214 I.ấy vào một bình khác 5ml dung dịch axit ascorbic tinh khiết trên, thêm l vài hạt tinh thể K I (3 - 5mg) và 5 giọt 'dung dịch hồ tinh bột 1% rồi định phân bằng dung dịch K IO , chính xác 0,00 IN cho đến khi xuất hiện màu xanh. Hệ số f được tính theo công thức: ^ 0,08 8 .a b trong đó: 0,088 - số mg axit ascobic ứng với Im l dung dịch K IO , 0,001N; a - sô' m l K IO , 0,00IN dùng định phàn 5ml dung dịch axit ascobic; b - sô' m l 2,6 diclophenolindophenol dùng định phân 5ml dung dịch axit ascorbic tinh khiết trên. Bài 4. Xác định vitamỉn B ị bằng phương pháp đo màu huỳnh quang V itam in B i (thiam in) có công thức cấu tạo như sau: .N H ị CI CH3 H2 c —c — H2 H 3C — c ■ C H 2O H H2 c— c • Cl CH HC' V itam in B| ở dạng este pirophotphoric là một tiền men cacboxylaza tham gia vào sự trao đổi gluxit. Thiam in là chất kết tinh không màu. Trong môi trường trung hoà và kiểm, nó rất nhạy với nhiệt ciộ cao (dễ bị phân huỷ hoặc tự phân huỷ). Vitam in B| bền trong môi trường axit, ở pH = 3 nó không bị phân huỷ khi đun nóng tới 120"C. Thiamin dễ tan trong nirớc, trong rượu etylic loãng, trong rượu m etylic, trong axit axetic và không tan trong cloroíorm , rượu butylic, isobiitylic, isoaniylic ete petrol, ete suníuric. Thiam in rất nhạy với chất oxy hoá và chất khử. M ộ t điểm đặc biệt là khi bị oxy hoá nó biến thành thiocrom. Chất này dưới ánh sáng tử ngoại có màu huỳnh quang xanh. Đây là cơ sở của phương pháp xác định vitamin B| vì phản ứng oxi hoá thiamin thành thiocrom xảy ra theo đúng tỷ lệ đương lượng; một phân tử thiamin tạo thành một phân tử thiocrom. 215 Để phán ímg trên có thể xảy ra. trước hết phải giải phóng thiam in ra khỏi mẫu bằng ch ế phẩm men. b. Dung cụ, lioá chất - Cân phân tích; - Nồi cách thiiỷ; - Ông nghiệm; - Phều thiiỷ tinh; - Cối thuỷ tinh; - Phếu chiết, bình định mức, máy huỳnh quang. - Rượu biitylic, isob u tylic hoặc isoam ylic. Các rirợii này phải không phát h uỳ nh quang. Có thể k h ử chất ph át h u ỳ n h q u a n g b ằ n g than hoạt tính (15 g a m than cho Iml rượu): rượu trộn với than lắc 30 phút trên máy lắc, làm khan bằng CaCl2 và cất ở nhiệt độ thích hợp. - Chế phẩm men của khuẩn ti penicilliiim , khiiẩn li penicillium được sấy khô ở nhiệt độ dirới 40"C rồi chiết lấy men bằng cách nghiền khuấn ti với một ít dung dịch natri axetat. - Dung dịch vitamin B| tiêu chuẩn - Dung dịch cơ sở (a) được pha như sau: hoà tan 10 gam tiiih thế thiamin vào lOml axit clohydric ciiing dịch nồng độ O.OOIN, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức dung tích lOOml. Thêm nước cất đến vạch mức, lác kỹ, Iml dung dịch này chứa 100|.ig thiamin. Dung dịch này được đựng trong chai màu, đế' chỗ mát trong 1 tháng không bị hỏng. Lấy Iml dung dịch này cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ, Iml dung dịch này chứa 1 fig thiamin. Dãy tiêu chuẩn (b) được chuẩn bị như sau: từ dung dịch trên, lấy vào một dãy ống nghiệm lần lượi 0,5; 1; 1,5; 2m l... (chứa 0,5; 1; 1,5; 2 y... thiamin) rồi thêm vào 3, 5; 5; 2,5; 2,0m l... nước cất và Iml K,Fe(CN)fi dung dịch 1% (vừa điểu chế). Cuối cùng cho vào mỗi ống 3ml natri hydroxit dung dịch 15%, lắc nhanh. Mỗi ống lại được cho vào lOml rượu butylic, lấc kỹ. Đ ể yên 2 phút, dung dịch sẽ tách thành 2 lớp, tách bỏ lớp dưới. Cho vào đó Ig natri suníat khan. Dung dịch rượu khan chứa thiocrom được cho vào dãy ống nghiệm khác. Ta đirợc một dãy màu tiêu chuẩn bền trong 2 - 3 ngày. 216 r . C á ch liế n lià iili Cân 5 - lOg mẫu, nghiền kỹ trong cối sứ với 10 - 15ml H2 SO 4 0,1N. Chuyên cả vào bình đ ịn h mứ c, th ê m H 2S O 4 đến 75ml. ỉ)ặi bình vào nồi c á c h tliiiý sôi trong 45 pliút, lác đều. Đ ế nguội bình và cho ch ế pliárn men vào (cứ 2 gam inảii cân 0,03 g a m khuẩ n ti k h ô ) b ằ n g cách: c â n k h u á n ti penicillÌLim, tán nhỏ trong cối thiiỷ tinh với 2 - 3ml natriaxetat dung dịch 30% rồi chuyến \’ào bình định mức thêm nalri axetat đến p ll = 5. Đặt bình vào máy điều nhiệl ở 4Ơ"C trong 12 giờ. Sau đó lấy bình ra, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ, lọc. Hút lấy lOml nước lọc cho vào phều chiết, thêm \'ào 20ml rượu butylic, lắc mạnh 1 - 2 phút. Chiếl, tách lớp rượu ra. 'rhêm vào Im l K,Fe(CN)fi dung dịch 1% và 3ml natri hydroxit diing dịch 15%, lắc nhanh hỗn hợp và thêm vào lOml rượu butylic, lại iắc. Tách bỏ lớp nước, còn lớp rượu cho qua giấy lọc chứa NÍI2SO4 khan. Sau đó chuyển dung dịch vào ống nghiệm có cùng kích thước, cùng dung tích và màu thuỷ tinh giống Iihir dãy ống tiêu chuẩn. Đo cường độ huỳnh quang của mẫu thử - so với dãy tiêu chuẩn trên máy huỳnh quang. Đo cường độ huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại của đèn thạch anh ihuỷ ngân 71 K-4, dùng kính lọc màu đen. d. Tíiili kết q u ả Hàm lượng vitamin B| (mg%) tính bằng công thức a.V.IOO X - V, .0 .1 0 0 0 trong đó: a- lượng thiarnin có irong ống tiêu cliuẩn có màu huỳnh quang trùng với ống chứa mẫu thử, |.ig; V - dung tích bình định mức, ml; V| - thể tích dung dịch thử lấy để oxi hoá, ml; Ci - lượng mẫu cân, g. 217 1 0 0 0 - giá trị chuyển đổi từ ng sang mg. V’/' dụ tíiili toán Giả sử càn 10 gam gạo, sau khi nghiền và định mức trong bình địiih mức dung tích lOml đem oxi hoá. Cuối cùng đo cường độ huỳnh quang màu của ống chứa mẫu thử trùng với màu của ống chứa 1,5 |.ig dãy thiamin chuẩn. Vậy hàm lượng thiamin (mg% ) trong gạo là: X = 1 ,5 .1 0 0 .1 0 — = 0 ,1 5m g% 10 . 10.1000 G hi chú 1. Đ ây là phương pháp xác định lượng nhỏ vitamin B| nên các thao tác cần phải làm tỉ m ỉ, thận trọng, nhất là quá trình chiết. 2. K,Fe(CN)fi trong m ôi trường NaOH là chất oxi hoá thiamin thành thiocrom. B ài 5. X ác định vitam in B 2 bằng phương ph áp huỳnh quang a. Nguyên tắc Vitamin B 2 (RiboAavin) chứa nhiều trong men bia, gạo, bột m ì, khoai tây và trong các sản phẩm lương thực, Ihực phẩm khác. Công thức hoá học của ribofIavin như sau H2C---- (CHOHla-CHÔH 1 H H3 C. 1 ĩ H ^9=0 I I, ^NH II 0 R iboílavin là chất kết tinh màu vàng, vị đắng. RiboAavin liên kết với axit photphoric trong thành phần của men gọi là men ílavin thuộc vào nhóm dehydraza hiếu khí. D o vậy vitamin B2 tham gia vào quá trình oxi hoá khử. Khi bị khử dạng màu vàng của vitamin B2 chuyển thành dạng không màu. Riboflavin có màu huỳnh quang vàng xanh trong dung dịch nước trung tính. Khi bị axit hoá hoặc kiềm hoá, 218 màu huỳnh quang của riboAavin giảm dần rồi mất hẳn. RiboAavin bị phân huỷ trong môi trường kiềm , bền trong axit. Đặc tính phát huỳnh quang của riboflavin là cơ sở của phưcfng pháp định lượng vitamin B 2 . Dựa vào việc đo cường độ huỳnh quang của dung dịch vitamin B 2 ta có thể xác định được hàm lượng của chúng chứa trong thực phẩm. Nhược điểm của phương pháp này là trong nước chiết các sản phẩm thực phẩm ngoài vitamin B2 còn chứa một sổ các chất khác cũng phát huỳnh quang. Nhimg nhược điểm này có thể khắc phục được bàng cách đo huỳnh quang các chất trong mẫu thử sau khi đã khử riboAavin bằng natri dithiosunfat. b.D ụng cụ, Ììoá clìất - Pipet, buret; - Cốc thiiỷ tinh; - Cân phân tích; - Bình nón; - Cối thuỷ tinh; - Nồi cách thuỷ; - Bình định mức lOOml, - Máy huỳnh quang HcpM ; - K M 1 1 O 4 đung dịch 4%. - Phễu thuỷ tinh; - Natri axetat dung dịch 2,5M : hoà tan 340g natri axetat trong lOOOml nước cất. - Dung dịch thiếc clorua: lOg SnCl^ hoà tan trong 25m l axit clohydric đậm đặc (đ = 1,19). Dung dịch này được đựng trong bình màu nâu. Từ dung dịch này điều ch ế dung dịch mới bằng cách pha 0,2m l với nước cất thành lOOml. - Dung dịch natriciithiosiinfat: 0,25g N a 2 S2 N a 2 C 0 , dung dịch 2 0 4 .2 H 2 0 hoà tan trong lOml %. - Dung dịch K 2 HPO 4 4M: 69,6 gam K 2 HPO 4 hoà tan tỏng lOOml nước cất - Dung dịch đệm photphat (pH = 7 - 8 ) - C hế phẩm men tripsin hoặc pancreatin tinh khiết - Dung dịch riboflavin tiêu chuấn; cân 10 gam riboflavin tinh thể cho vào bình định mức dung tích 250m l thêm axit clohydric dưng dịch 0 ,0 IN đến vạch 219 mức, lắc kỹ cho tan hết riboílavin (Im l dung dịch này chứa 4ơy riboAavin). Dung dịch này giữ ở chỗ mát, tối trong 1 tháng không bị hỏng. Sau đó lấy Iml dung dịch này cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm vào đó 37,5 axit tricloaxetic dung dịch 20% và 25m l dung dịch K2HPO4 4M , thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ. c. Cáclì tiến hàn lì Cân 5 - lOg sản phẩm lưcnig thực, thực phẩm (gạo, quả...) nghiền kỹ trong cối thiiỷ tinh với 20m l dung dịch đệm photphat (pH = 7 + 8 ). Chuyển toàn bộ vào bình định mức dung tích 250m l, rồi thêm lOOml dung dịch đệm nữa. Hỗn hợp được để đúng 40 phút trong nồi cách thiiỷ đang sôi. Sau đó lá'y ra làm nguội dến 30"C rồi đo pH bằng giấy thử pH. Nếu pH < 7 thì phải đưa về pH = 7,8 ^ 8 bằng dung dịch đệm photphat. Cho vào hỗn hợp này Ig ch ế phấm men tinh khiết tripsin và để vào tủ ấm ở t" = 37"C trong 10 giờ. Men sẽ thuỷ phàn protein và phá vỡ m ối liên kết bền của riboAavin với protein. Lấy bình định mức ra, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ, lọc qua giấy lọc khô. Dùng pipet hút lấy lOml nước lọc vào bình nón, thêm vào 5ml axit tricloaxetic dung dịch 20% và để hỗn hợp 10 phút trong nồi cách thuỷ đang sôi để giải phóng hoàn toàn riboflavin ra khỏi hỗn hợp ở dạng lự do. Sau khi làm nguội, thêm vao dung dịch m ột lượng H 2 HPO 4 4 M để đưa pH về 6 . Tiếp đó nhỏ vào bình nón từng giọt KMnƠ 4 dung dịch 4% đến có màu hồng nhạt. Đ ể yên 10 phút, nhỏ vào bình nón vài giọt H 2 O 2 dung dịch 3% đến mất màu hồng hoàn toàn. Cuối cùng thêm vào 0,2m l dung dịch thiếc clorua và 0,1 ml dung dịch natri dithiosuphat, lắc mạnh 20 phút. Lọc lấy dung dịch qua giấy lọc khô cho vào 1 cốc khỏ sạch. Đem nước lọc đo cường độ huỳnh quang trên máy huỳnh quang HOM. Dung dịch mẫu thử và dung dịch riboflavin tiêu chuẩn được cho vào ciivet và 0 ,lg Na 2 S2 0 4 .2 H 2 0 , Ig N a 2 C0 , và lại đo cường độ huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang chính xác của riboflavin đo bằng hiệu số. 220 0 d. Tíỉììì kết quả: ỉ làm lượng viiamin B2 (mg%) tính bằng công thức: _ ( a - b ) .0 ,4 .V .1 0 0 C .V ,.G .1000 trong đó: a: trị sô' máy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch thử; b: trị số m áy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch đã khử riboílavin; c: trị số máy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch tiêu chuấn chứa 0,4 |jg riboAavin trong Iml; 0,4: lượng riboílavin của Iml dung dịch tiêu chuẩn, |ig; V: dung dịch bình định mức, ml; v,: thể tích dung dịch mẫu thử hút từ bình định mức để thí nghiệm , ml; G: lượng cân mẫu, g; 1 0 0 0 : giá trị để chuyển từ Ị,ig sang mg. 221 Chương 9 ALCALO IT V À PHENOL 9.1. CÁC CHẤT ALCALOIT 9.1.1. VAI TRÒ VÀ Ý NGHĨA Hợp chất alcaloit là một nhóm hợp chất hữu cơ, phân tử có chứa nhân dị vòng và có tính kiềm, một sô' các chất trong nhóm này là những chất lưỡng tính. Nitơ trong phần tử alcaloit tạo nên dặc tính cơ bản của loại hợp chất này. A lcaloit có chứa trong nhiều loại cây. Chính các alcaloit này tạo ra tính chất dược liệu hoặc tạo ra tính chất kích thích gây “nghiện” cho người sử dụng khi dùng các sản phẩm ch ế biến từ các loại thực vật có chứa nhóm hợp chất này. N ói chung các alcaloit có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, hoạt động của tim, hoạt động của các cơ bắp và tàng cường sự hô hấp... Trong các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật dùng để ch ế biến thực phẩm có chứa các alcaloit khác nhau có thể kể đến: chè, cà phê, cacao, thuốc lá, côca, thuốc phiện... V iệc xác định hàm lirợng alcaloit không những có ý nghĩa xác định chất lượng sản phẩm mà còn phát hiện việc làm giả và trộn lẫn hàng giả vào các sản phẩm nguyên gốc. 222 9.1.2. NGUYÊN TẮC và các phương pháp tác h CHIẾT ALC ALO IT TỪ THỰC VẬT Các alcaloit do có tính kiềm nên trong thực vật chúng thường tổn tại ở dạng muối với axit hĩai cơ. Do vậy có thể tách chúng ta ở dạng muối alcaloit hay ở dạng bazơ alcaloit, 9.1.2.1. C hiết rút các alcaloit ỏ dạng muối Chiết nguyên liệu thực vật có chứa alcaloit bằng nước hoặc rượu đã được axit hoá bằng axit tactric (muối của alcaloit với axit tactric tan khá Irong rượu và nước). Bước này tiến hành trong các dụng cụ chiết rút thông thường trên nồi đun cách thuỷ. Tiếp theo loại tạp chất và thu nhập alcaloit. Trong dung dịch chiết ở bước một, ngoài alcaloit ở dạng m uối, còn chứa một lượng khá lớn tạp chất kèm theo như protein, chất nhựa, tanin... Do đó phải loại bỏ tạp chất để có alcaloit tinh khiết hcm. Cách tiến hành như sau: Kiểm hoá dung dịch đã chiết ra được sẽ làm cho các m uối alcaloit chuyển thành bazơ alcaloit và dùng dung m ôi hữu cơ thích hợp để trích ly sẽ loại bỏ được một số tạp chất nằm lại trong nước. Tuy nhiên trong dịch chiết bằng dung m ôi hữu cơ này, ngoài bazơ alcaloit vẫn còn tạp chất. Đ ể tiếp tục loại tạp chất, người ta loại axit hoá dung dịch bằng cách cho thêm dung dịch axit tactric 1 - 5%. Lúc này toàn bộ bazơ alcaloit lại chuyển thành muối alcaloit và tan vào lớp nước axit, tạp chất nằm lại trong lớp dung môi hữu cơ. Tách lấy lớp nước axit, một lần nữa lại kiềm hoá dung dịch rồi trích ly lấy bazơ alcaloit bằng dung m ôi hữu cơ. Đ ó là do các muối alcaloit dỗ tan trong nước còn bazơ alcaloit dễ tan trong dung m ôi hữu cơ. Sau bước này, các bazơ alcaloit đã tương đối tinh khiết, làm bay hơi dung m ôi hữii cơ, phần còn lại ở dạng bột hoặc tinh thể, đó chính là các bazơ alcaloit tổng số. Muốn tách riêng từng cấu tử alcaloit phải xử lý qua các cột hấp phụ và dùng các dung môi cơ thích hợp không tan lẫn nhau để tách tìmg loại alcaloit hoặc bằng các phưcmg pháp hoá học khác. 223 9.1.2.2. C h iế t r ú t các a lc a lo it ở dạng bazơ a. X i’( ỉ ý nguyên liệ ii Các chất alcaloit trong thực vật chủ yếu tồn tại ở dạng m uối. Muốn tách chúng ở dạng bazơ phải xử lý nguyên liệu thực vật bằng kiềm. Trong thực tế, thường dung các loại kiềm như: NH4OH, NaHCƠỊ,... Nếu dùng kiềm mạnh có thể phân huỷ một sô' alcaloit. Tuy nhiên có một số alcaloit là những bazơ khá mạnh, ở trường hợp này dùng kiềm yếu để tách chúng ra khỏi dạng muối là chưa đủ, có khi phải dùng tới M gO hoặc NaOH. Vì vậy việc chọn dùng loại kiềm nào, ở đây giữ vai trò quan trọng. b. C ách tiến hành Sau khi xử lý nguyên liệu thực vật bằng kiềm , dùng dung m ôi hữu cơ để chiết rút lấy bazơ alcaloit, có kèm theo các tạp chất khác. Làm sạch bazơ alcaloit và loại bỏ tạp chất bằng cách cho thêm vào đó một lượng dung dịch axit để chuyển bazơ alcaloit thành muối alcaloit tan trong nước - axit, tạp chất sẽ nằm lại trong lớp dung m ôi hữu cơ. Tách lấy lớp nước - axit, sau đó lại kiềm hoá để chuyển m uối alcaloit thành bazơ alcaloit và dùng dung môi hữu cơ để chiết rút lấy bazơ alcaloit, còn tạp chất sẽ nằm lại trong lớp nước - axit. Lặp đi lặp lại các bước trên nhiều lần cho đến khi thu được m ôi hữu cơ có chứa bazơ alcaloit tương đối tinh khiết thì làm bay hơi dung m ôi hữu cơ sẽ thu được bazơ alcaloit tổng số. M uốn tách riêng từng cấu tử alcaloit ra khỏi hỗn hợp có thể dùng phương pháp chưng cất phân đoạn hoặc các phương pháp khác. 9.1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ALC A LO IT Trước khi phân tích định lượng phải chuẩn bị dịch chiết chứa alcaloit từ nguyên liệu thực vật hoặc từ các hỗn hợp phức tạp, sau đó làm sạch, chất, cuối cùng mới chọn phương pháp thích hợp để phân tích. 224 loại bớt tạp 9.13.1. Phương pháp trọng lượng Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng cùa bazơ hay muốn alcaloit sau khi loại bỏ dung m ôi. Cáclì tiến lià iili: lọc dung dịch đã trích ly các alcaloit bằng clorofooc hoặc ete vào bình đã biết uư ớc tr ọ i^ teọmgvTtòro sấy k b ô ipỊíiần còn lại đến trọng lirợng không đổi, để nguội và cân. 9.1.3.2. P hư ơng p h á p th ể tích Trong phương pháp này, phương pháp trung hoà được dùng phổ bịến hơn cả. Cần chú ý các trường hợp sau đây: ! a. C huẩn độ các bazơ a lc a lo it I Siiu khi trích ly các bazơ alcaloit bằng dung m ôi hữu cơ, làm ba^ hơi dung m ôi, sau đó cho thêm vào m ột lượng dư dung dịch axit đã biết dung tíệh và nồng độ. Các b azơ alcaloit sẽ bị hoà tan và chuyển thành m uốn alcaloit tương ệiig. ỉ Luợag axit dư đươc chuẩn đô bằng dung dịch kiềm với chất chỉỊthị mầu là phenolphtalein (cách chuẩn độ này được gọi là chuẩn độ ngược hay chlịẩn độ gián tiếp). Ị I Người ta còn có thể tiến hành chuẩn độ trực tiếp phần alcaloit còsị lại sau khi đã làm Imy h ơ i dung m ô i bằng dung dịch a x it với chất chỉ th ị màu là im e ty l - da cam. h. C huẩn độ các m u ố i a lc a lo it C íc dung dịch nước rượu của các m uối alcaloit được tạo thành từpác alcaloit có tính bazơ yếu c ó đặc tính là không phản ứng với phenolphlalein vì có hằng số phân ly rất nhỏ. Hơn nữa, khi có mặt rượu hằng sô' phân ly này còn thấp hcm. D o đó có thể chuẩn độ chúng bằng kiềm với chỉ thị màu phenolphlein. Màu củà dung dịch sẽ xuất hiện khi tất cả các bazơ được giải phóng ra khỏi m uối alcaloit, còn axit được tạo ra từ m uối sẽ kết hợp với kiềm đã dùng để chuẩn độ, giọt kiềnị dư sẽ hiện màu với thtiốc thử. Nếu bazơ alcaloit ______1 trong dung dịch nước - rượu có phản ứng với phenolphtalein (ví dụ atropin) thì việc chuẩn độ các m uối bằng kiềm phải tiến hành với sự có mặt của clorofooc vì cloroíooc sẽ hòa tan các bazơ alcaloit được tách ra 225 khỏi dung dịch muối alcaloit và một giọt kiềm dư sẽ phản i'nig màu với phenolphtalein dấu hiệu kết thúc sự chuẩn độ. 9 .ỉ . 3.3. P h ư ơ n g p h á p k ết tủ a Dùng các chất kết tủa khác nhau (thuốc thử Maier: H gl 2 + KI hoặc dung dịch I2 trong KI) để chuẩn độ. V í dụ: Cho dung dịch I2 đã biết nồng độ vào dung dịch chứa alcaloil trong môi trường trung tính hoặc axit yếu, I2 sẽ tạo thành kết tủa với các alcaloit. Chuẩn độ lượng I2 dư bằng dung dịch Na 2 S2 Ơ, với chất chỉ thị màu là hồ tinh bột. Ngoài các phương pháp đã nêu ở trên, người ta còn định lượng alcaloit bằng phương pháp đo độ hấp phụ ánh sáng. Trong trường hợp này thường dùng các phản ứng màu được tạo thành do đặc tính của các nhóm chức khác nhau của các alcaloit. 9.1.4. PHẦN THỰC HÀNH Bài I: Xác định cafein trong chè bằng phương ph á p trọng lượng a. N gitvêii lắc Caíein có trong chè thường tồn tại ở dạng muối với các hợp chất hữu cơ. Khi xử lý nguyên liệu bằng NaOH hoặc NH 4 OH, cafein được giải phóng ra dưới dạng tự do (dạng bazơ), đồng thời cũng tác chác hợp chất khác ra dạng tựdo. Sau khi dùng KMn 0 4 để phá bỏ tạp chất, loại tanin, dựa vào tính hoà tan của caíein dùng clorofooc để chiết lấy caíein. Dùng cloroíooc có thể làm cho một sô' chất khác, như clorophin cũng bị chiết ra, cho nên phải dùng A 1 K(S 0 4 ) 2 để kết tủa và dùng vazơlin để cuộn lấy kết tủa này và khi làm lạnh dung dịch chúng sẽ bám chặt vào thành bình. Phẩn dung dịch còn lại là cafein hoà tan trong clorofooc, sau khi đuổi hêt dung môi sẽ thu được cafein ở dạng tinh thể. b. Hoá chất, dụng cụ - Cát sạch hoặc bột thuỷ tinh - Clorofooc tinh khiết - Muối K A 1 (S 0 226 4 ) 2 tinh thể - chì axetat 10% - Vazơlin - 7’han hoạt tính - H 2 SO 4 20% - KOH 25% - NH 4 OH 25% - NaOH 10% - K M n 0 4 2% - Bột chưng cất tuần hoàn và bộ thu hồi dung môi - Nồi đun cách thuỷ - Phễu chiết loại 500 ml - Bình tam giác 2 5 0 ml đã biết trọng lượng - Ống đong loại lOOml - Phễu lọc, bông hoặc giấy lọc - Các dụng cụ thòng thường khác. c.Tiến hành Cân chính xác 2 hoặc 3 gam chè đã sấy khô, nghiền nhỏ cho vào bình tam giác đã rửa sạch sấy khô. Cho thêm vào đó 4 - 5 gam cát sạch, khô hoặc bột thuỷ tinh, lắc đều để bột chè và cát trộn lẫn nhau, phân phới đều trènđáy bình. Dùng dung dịch NH4OH 25% nhỏ giọt tẩm ướt bộl chè (khoảng 5 - lOml), sau đó đặt bình đun trên nồi cách thuỷ để tăng cường quá trình giải phóng cafein ra dạng tự do và kết hợp đuổi hết N H 4 OH. Sau khi đuổi hết N H 4 OH dư, cho thêm vào bình 90m l clorofooc, tiếp tục đun trên nổi cách thuỷ có lắp ống sinh hàn trong 25 - 30 phút để cloroíooc chiết rút hết caíein trong bột chè. Sau đó dùng bông để lọc lấy dung dịch, giữ bã lại trong bình và dùng cloroíooc tráng rửa nhiều lần, dịch lọc tập trung vào bình tam giác dung tích 500 ml (bình tam giác này đã có sẩn vazơlin) và4 - 5g K A 1 (S 0 4 )2 .Sau đó bình tam giác này vào bộ chưng cất đun cách thuỷ để thu hồi lại clorofooc, lắp sau khi đuổi hết dung m ôi, cho thêm vào đó 125ml nước cất, tiếp tục đung trên nồi cách thuỷ cho vazơlin tan chảy hoàn toàn cuộn lấy tạp chất. Sau đó làm lạnh dung dịch dưới vòi nước lạnh, khi làm lạnh chú ý nghiêng xoay bình để vazơlin đã cuộn tạp chất bám chắc vào thành bình, lọc dung dịch sang phễu chiết dùng nước cất tráng rửa bình và lọc tập trung vào phễu chiết. 227 Sau khi lọc xong, cho thêm vào phễu chiết 3 - 5 ml KOH 25%, lắc đế kết tỉia các tạp chất còn lại. Tiếp tục dùng KM 1 1 O 4 25% nhỏ giọt, khử tanin cho đến khi mất màu vàng. Sau đó cho ihêm 25ml cloroíooc vào phẽu chiết, lắc dều trong 3 phút, lúc này dung dịch có thể chuyển từ màu hồng nhạt sang màu xanh lơ, để yên cho dung dịch phân lớp. Lóp dưới là lớp cloroíooc chứa cafein, gạn lớp này vào bình tam giác dung tích 2 ỈOml đã biết trước trọng lượng. Tiếp tục dùng cloroíooc để chiết 'ửa dung dịch còn lại nhiều lần và gạn lớp clorofooc tập trung vào bình tam giác. Bình tam giác đựng cloroíooc có chứa caíein được lăp vào bộ chứng cất, đun cách thuỷ thu hồi dung môi. Sau khi đuổi hết dung m ôi (dung dịch còn lạ 1 - 2 ml) thì lấy bình, ra, để yên cho cafein kết tinh, sau đó đưa đi sấy khô ở nhiệt đ< 100"C 1500"C tro ịg 2 giời. Cần và tính kết quả. cl. T í ììì kết quả trong đó: a - t^ n g lượiig cafein thu được (g); A - tịpng lượng chất khô của mău chè (g). G hi đlìú: Các phương pháp tro n g lương khác a. D m g dung dịch chì - axetat đ ể kết tủa tạp chất Cân Bhính xác 5g chè đã sấy khô nghiền nhỏ ch o vào binh tam giá( 250m l, cho thêm lOOml nước sôi và đun trên nồi cách thuỷ 4 5 phút. Sau đó lọc, phần bã còn lại cho thêm 80 ml nước cất dun sôi, đun cách thuỷ thêm 30 phút. Cho thêm vào đó 16 Ịnl dung dịch chì axetat kiềm tính 1 0 % để kết^tủa tạp chất, l l : đẻu và dùng nước cất diều chỉnh đến vạch quy định (250m l). Sau khi lọc, lấy 200 Til dung dịch cho vào bình chiết, dùng H2SO4 20% để khử lượng chì axetat dư. Sau 00 lọc và đùng nước cất rửa kết tủa nhiều lần, lọc và tập trung dung dịch lọc sang bàt sứ, cô đặc trên nồ cách thuỷ cho đến dung dịch còn lại khoảng 15 - 2 0 ml thì chuỵển sang phễu chiết (qua phễu lọc), cũng tráng rửa bẳng nước cat hoặc clorofooc chiết rút nhiều lần như bài một. Sau khi đuổi hết dung m ôi, ch o kết tinh, sấy khô và cân lượng cafein. 228 Tính kết quả. cafein(% ) = ~ . I O O V.A trong đó: a ^ trọhg íưỢng caíein thu được (g); V - tổng thể tích dung dịch chè (ml); thể tích dung dịch đem phân tích (ml); V A - trọng lượng chất khô của chè (g). b. D ù/Ig N a O H đ ể g iả i phóng cafein và khử tạp chất than hoat tín ề G í i chính xác 3g chè đã sấy khô, nghiển nhỏ, cho vào bình tam giệc có dung tích 150 m l, lắc nhẹ cho bột chè phân phối đều trên đáy bình. Dùng 5m l dung dịch NaOH 10% nhỏ giọt thấm ướt bột chè. Đ ể yên 15 phút, sau đó cho ^ ê m 60m l clorofooe, đun trên nồi cách thuỷ có ống sinh hàn trong 30 - 40 phút. Sau khi đun xong, lọc qua bông hoặc giấy lọc thuỷ tinh, dùng clcaòĩooc tráng rửa nhiểịl lần và lọc tập trung sang bình có dung tích 250 - 300 m l, lắc ^ều và cho vào đó 1 - 2 g than hoạt tính (ở dạng bột và khô), tiếp tục lắc để khử tỊ|p chất cho đến khi M i mầu clorophin. Ị Sí,u đó lọc sang bình tam giác đã biết trọng lượng, dùng clorof 0 Ot tráng rửa nhiều lu^ và lọc tập trung vào bình tam giác trên. Lắp bộ chưng cấl có thiu hồi dung m ôi đun trên nổi cách thuỷ, sau khi đuổi hết dung m ôi, để yên cho cafeịn kết tinh, sấy khô, cân và tính kết quả như bài 1 . B ằi 2. Đ ịnh lượng cafein bằng phương pháp th ể tích a. Nguyên tắc Kqì dung dịch chứa cafein, nếu có mặt HCl thì dung dịch I2 tronệ KI có thể làm cho toàn bộ cafein chuyển thành chất kết tủa ở dạng có công thú^ tổng quát CfiH|||N4 K l 4 . Sau dỗ dung natrithiosiiníat (N a 2 S2 0 ,) đã biết nồng độ chTian lượng I2 biết được lượng I2 đã tham gia phản ứ:ig, từ đó tính ra lượng caíein có mặt trong dung dịch thí nghiệm. 229 b. H oá chất, dụng cụ - Chì axetat kiềm tính d = 1,25 pha bão hoà trong nước; - Dung dịch N aiSiO , 0,1N; - Dung dịch I2 pha trong KI 0,1N; -H C l tinh khiết d = 1,18; - Dung dịch H 2 SO 4 20%; - Hồ tinh bột 0,5% ; - Nồi đun cách thuỷ ; - Bình cầu các loại 250 m ỉ, 500ml; - Bình định mức các loại: 250m l, 500 ml (5 chiếc); - Pipet các loại: 10, 25, 50 ml; - Buret và ống đo các loại 25, 10 ml; - Các dụng cụ thông thường khác. c. Tiến hành Cân chính xác 5g chè đã sấy khô, nghiền nhỏ cho vào bình cầu dung tích 250m l, cho thêm vào đó 150 - 200 ml nước cất đun sôi và tiếp tục đun cách thuỷ trong 45 phút cho đến khi bột chè lắng xuống hết đáy bình. Lọc dung dịch qua phếu lọc bông, tráng rửa bã chè nhiều lần bằng nước cất đun sôi và lọc tập trung vào bình định mức 500 m l, cất giữ làm dung dịch thí nghiệm. Lấy chính xác 200 ml dung dịch chè cho vào binh định mức tích 250 ml, cho thêm vào đó 4 - 5 ml dung dịch chì axetat kiềm tính d = 1,25 pha bão hoà trong nước, dùng nước cất điều chỉnh đến vạch quy định, lắc đều , để yên trong 5 phút, lọc. Lấy 200 ml dung dịch lọc cho vào bình định mức 2 (dung tích 250 m l), cho thêm vào đó t^mg giọt H 2 SO 4 20% (khoảng 1,2 - 1,5 m l) cho đến khi không còn tạo ra kết tủa trắng mới thôi. Tiếp tục lấy 200 ml dung dịch lọc (lần thứ 2), cho vào bình định mức thứ ba (dung tích 250 m l), cho thêm vào đó 10 ml HCl tinh khiết (d = 1,18), cho thật chính 230 xác 25 ml dung dịch I2 0,1N vào bình định mức, lại cho thêm 20 ml nước cất, lắc đều đề yên 25 phút ở nhiệt độ 15“C, sau đó lấy ra dùng nước điều chinh đến vách quy định, lắc đều và lọc. Lấy lOOml dung dịch lọc lần Ihứ ba, nhanh chóng dùng Na 2 S2 Ơ 3 chuẩn lượng I2 dư khi dung dịch chuyển sang màu vàng nhạt, cho thêm vào đó hổn tinh bột mới pha 0,5% , tiếp tục chuẩn độ bàng Na 2 S2 0 2 ml dung dịch ^0,1N đã dùng bằng B. Plìáỉì tícìì kiểm cììửng: Lấy 203m l nước cất thay cho dung dịch chè và tiến hành các bước tương lự như trên, bắl đầu từ lúc cho thêm HCl. Lượng Na 2 S2 Ơ 3 0,1N đã dùng ở thí nghiệm phân tích kiểm chứng ký hiệu là A. d. Tính kết quả. c a fe in (% )= ( A - B ) .2 ,5 K .0 .0 0 5 2 . 1 0 0 '2 5 0 '2 5 0 '2 5 0 trong đó; A - sô' ml N a 2 S2 0 , 0,1N đã dùng trong phân tích kiểm chứng; B - sô' tnl N a 2 S2 Ơ , 0 ,1 N đã dùng trong phân tích caíein; K - hệ số điều chỉnh nồng độ của N a 2 S2 K= 0 ,; Nồng độ chuẩn ---------- ^ ^ -------------------Nồng độ pha thực tế G - trọng lượng chất khô của mẫu chè; 2 , 5 - hệ số tính lượng dung dịch thí nghiệm so với lượng dung dịch chè đã pha ch ế 0 ,0052 - Sô' g caíein ứng với 1 ml N a 2 S2 Ơ, 0,1N đã dùng dể chuẩn lượng I2 tham gia kết tủa caíein. 23 9.2. HỌP CHẤT PHENOL THỰC VẬT 9.2.1. VAI TRÒ VÀ Ý NGHĨA CỦA HỢP CHẤT PHENOL THựC VẬT • • • Hợp cliấl phenol thực vật là một nhóm hợp chất tự nhiên có phổ biến trong thực vật. Cfeúng quyết định đến hương vị, làm thay đổi màu sắc tự nhiên cịủa nhiều loại sản pHẩm có nguồn gốc thực vật, ngoài ra chúng còn tham gia tạo hương thơm đặc trưng àho một số sản phẩm thực vật. Hợp chất phenol tạo vị đắng chát ở mức độ khác nhau của sản phẩm chè, bia, vang quả óác loại rau quả và cả ở một số rượu đặc sản có sử dụng nguyên liệu thực vật. Đặc biỂt hợp chất phenol thực vật, sau các phản ứng hoá học còn tạo ra màu sắc đặc tnmg cịho thực phẩm: màu đỏ tươi của chè đen, màu xanh vàng của các loại quả ép, màu \'ầaig nâu của thuốc lá, song hợp chất phenol thực vật cũng ỉàm 'thay đổi màu sức tự nhiên của sản phẩm thực phẩm do quá trình oxy hoá tạo thành màu hoặc do kết hợpỊvới các kim loại nặng. Trong quá trình ch ế biến thực phẩm có nguồn gốc thực vật, cấc hợp chất phenol thường tham gia vào quá trình tạo chất thơni với các axit amin và đường khử để tạo thành aldehyt bay hơi có mùi thơm. Do l ó việc xác định hàm lượng các hợp chất phenol thực vật trong nguyên liệu, sản pbẩm và theo dõi sự biến đổi hàm lượng của chúng qua các giai đoạn chế biến, bảo cịuản có ý nghĩa quan trọng đối với việc thiết lập các ch ế độ công nghệ và bảo quản thực phẩm cũng như đối với việc kiểm tra và đánh giá chất lượng sản phẩm. 9 .2 .Í. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT PHENOL 9.2.Ỉ.Ỉ- Phương ph áp vật lý ThirộBg sử dụng hai phương pháp phổ biến dựa trên các nguyên tắc: a) L^ng dung m ồi hữu cơ thích hợp để chiết hợp chất phenol trực tiếp tìr nguyên liệu ỔaỊC vậe hcổc chuyển hoàn toẳn các hợp chất phenol từ dung dịch chiết bàng nước sang dung môi hữu cơ sau khi đã loại bỏ hợp chất, cho dung môi bay hơi sẽ thu được hợp chất phenol ở dạng tinh khiết, sấy khô, cân sẽ thu được hàm lượng của chúng. 232 b) Dùng dung dịch các muối kim loại nặng (thường dùng chì - axetat) để kết tủa hợp chấl phenol từ dung dịch chiết bằng nước thực vật, lọc lấy kết tủa, làm sạch tạp chất sấy khô kết tủa, cân, từ đó suy ra trọng lượng hợp chất phenol và tính ra được hàm lượng của chúng. 9 .2 .2 ^ Phượng p h á p hqá học __________ a) Cfeuẩn độ trực tiếp các hợp chất phenol trong dung địch chiết fa được từ thực vật bằng dung dịch KM nƠ 4 trong môi trường axit với chất chỉ t|iị màu là indigocacỊãB. b) (phuẩn độ gián tiếp lượng iod dư sau khi tác dụng với hợp c|(ất phenol trong dun^ dịch bằng NaiSỊƠ , trong môi trường kiềm với chất chỉ thị mà |à hồ tinh bột. ' 9.212.3. Phương p h á p hoá lý ThiỆBg dùng phương pháp sắc ký trên giấy. Phương pháp này chủỊyếu dùng để tách riệng từng cấu tử trong hỗn hợp các chất phenol thực vật và xác Ịđịnh hàm lượng riên^ của từng cấu tử. Ngiịllyên tắc chung là dùng etanol tinh khiết chiết lấy hợp chất pẳienol thực vật, sau đ|s c ố định chúng trên giấy sắc ký, dùng hỗn hợp dung môi thíf h hợp để ly từng cấu tử của hợp chất phenol, sau khi tách riêng được từng cấu tiến hành tử người xác định hàm lượng của chúng bằng phương pháp so màu. i 9.2.^. PHẦN THỰC HÀNH 1 ; ị Trobg phần này giới thiệu các bài thí nghiệm xác định hàm lượnậ các hợp ị ' chất phemil, các cấu tử của hỗn hợp các hỢp chất phenol và các sản phÉii oxi hoá có màu ciịa chúng vẫn còn bản chất plieiiol, ớ d áv lấy nguyèn liêu ban đáu la cliè tlế làm v í dụ.ị Bàầ 3 . Đ ịnh lượng tanin chè bằng phương ph áp trọn g lượng Ị a. Ĩ^Miiyên tắc I I ( i Tanin chè có tính tan trong etylaxetat không tan trong cloroíorm và benzen, còn nhữiig chất khác trong chè như caíein... lại không tan trong etylaxtat hoặc chí tan rất ít. Dựa vào các tính chất này, người ta dùng etylaxetat đế’ chiết lấy tanin chè. 233 Sau đó làm sạch dung dịch chiết bàng cách cho thêm vào đó một lượng cloroíorm (cloroíorm không tan trong etylaxetat) để chuyến caíein tan trong cloroíbrm mới cho thêm. Đ ể yên cho phân lớp và tách lấy etylaxtat có chứa tanin chè, sau khi đuổi hết dung m ôi sẽ thu được tanin chè ở dạng tinh khiết. b. Dụng cụ, ìioá chất - Cối nghiền chè hoặc cối xay cà phê; - Rây số 4 (đường kính lỗ 0,25 mm); - Cân phân tích; - Bình cầu dung tích 500ml; - Bình định mức, dung tích 250 ml và 500 ml; - Phễu lọc và giấy lọc (hoặc bông trắng); - Bình tam giác các loại; - Nồi đung cách thuỷ và ống sinh hàn; - Bình gạt dung tích 1000 ml; - Bình nước đá, tủ lạnh, tủ sấy, máy cất hơi nước trong dụng cụ chưng cất, máy lọc chân không; - Etylaxetat tinh khiết; - Cloroíorm, benzen tinh khiết; - Natri sunfal tinh thể. í'. Tiến lùinlì Chuẩn b ị lioá chất và dung d ịc ìi: - Đ ể đảm bảo độ tinh khiết cao của các hoá chất đem dùng, cẩn phải đem etylaxetat và benzen đi làm khô hết nước bằng natri sunfat tinh thể. Cír 100 gam natri suníat cho vào 1 0 0 0 ml dung dịch trên, để một ngày đêm cho híu hết ẩm, sau đó gạn lọc lấy dung môi. - Pha ch ế dung dịch chè: Lấy 30 gam chè đã nghiền nhỏ và sấy khô, dùng nước số pha chè trong bình cầu, đun tiếp trên nồi cách thuỷ 45 phút, cứ 10 phút lắc 234 Iihẹ một lần cho đến khi bột chè lắng hết xuống đáy bình (lượng nước cất đun sôi ban đầu để pha ch ế khoảng 800 ml). Lọc diiỊig dịch chè qua phều lọc, tráiig bã chè nhiều lần bàng nước cất đun sôi, lập trung các dung dịch chè đã lọc pha thành 1 2 0 0 ml dung dịch, sau đó cất giữ dung dịch để tiến hành các bước sau. ĩ i ế i i hanh: Lấy chính xác 6 0 0 ml dung dịch chề đã pha ch ế ở trên cho vào bình chiết gạn có dung tích 1 0 0 0 m l, cho thêm vào đó 1 0 0 ml beiizen để loại bỏ chất béo và các chất khác có trong chè. Sau khi cho benzen, lớp dung dịch còn lại được đổ ra chén sứ đun cách thuỷ đuổi hết benzen còn sót lại sau đó đổ lại dung dịch vào bình chiết gạn, cho thêm vào đó 100 ml etylaxetat để chiết lấy tanin chè. Lắc nhẹ bình chiết gạn và đều tay trong 5 phút. Đ ể etylaxetat tiếp tục chiết lấy tanin chề còn lại trong lớp nước từ 5 đến 6 lần cho đến khi dung dịch etylaxetat gạn ra có độ trong suốt như ban đầu. Tập trung tất cả các dung dịch etylaxetat có chứa tanin chè vào bình cầu, đun cách thuỷ đuổi dung m ôi và khi thấy dung dịch chi còn lại 1/5 thể tích ban đầu thì chuyển sang bình đã chứa sẩn cloroíorm, tráng rửa bình cũ nhiều lần bằng etylaxetat. Sau đó lắc đều để cloroĩorm , chí lấy lớp etylaxetat có chứa tanin đưa đi lọc qua máy lọc chân không. Sau đó đun cách thuỷ hết dung môi sẽ thu được tanin chè. Tanin chè thu được ở dạng bột màu vàng nhạt. Sau đó đem ch ế biến đi sấy khô ở 60"C trong 30 phút, rồi nâng dần nhiệt độ lên 90 - 95‘’C cho đến khi trọng lượng không đổi. M uốn tránh cho tanin chè khổng bị oxi hoá phải sấy khô irong tủ sấy chân không. d. T íiili kết c/iiả: Hàm lượng tanin chè theo % trọng lươiig chất khô tính như sau: X = ^ .lõ o A.v trong đó: 235 a^trọng lượng lanin chè thu được trong mẫu đem phân tích (g); A - trọng lượng chất khô của mẫu đem phân tích (g); V - thể tích dung dịch chè đem phân lích (ml); V - tổng thể ích dung dịch chè pha ch ế (ml). B ^ 4 : Đ ịnh lượng tanin chè bàng phương ph á p chuẩn độ KM ìĩú^ I a. ^Nguyên tốc TsỊiÉi chè là một hỗn hợp phức tạp gồm các hợp chất phenol ỔCKIi giản phân tử thấp \% hợp chấl poliphenol phân tử lớn. Tanin chè rất dễ bị o x i hoá ^ởi KMĨ1 O 4 trong mcỊi trường H 2 SO 4 có mặt chất chí thị màu indigocam in. Sau khi o x ỵ hóa hoàn loàn, cácỊ hợp chất phenol tiếp xúc oxy hoá chất chỉ thị màu làm mất mằị\ xanh của dung áịcÍL \ ' b. B ụ n g cụ, lio á chất I - ( iđ ĩ nghiền xay chè hoặc cối xay cà phê, rây số 4 (0,25m m ); - (ịlitai phân tích, tủ sấy; - l|Ếnh cầu dung tích 500 ml; - m - t e định mức loại 250 ml và 500 ml; ; lọc và giấy lọc (hoặc bông trắng); I tam giác các loại; - ỉ^ồi đun cách thủy và ống sinh hàn; I - 1 sứ tráng m en loại 1 0 0 0 ml; - I ^ e t đựng KM nƠ 4 0 ,1 N , inđigocamin; - ĩ^ìpet 1 0 ị ỉ ml; - l ỉ U g dịch indigocam in 0,1N trong H 2 SO 4 (cứ 1000 ml dung d ịth chất chỉ thị 0 , 1 236 c. Tiến hành C litiẩ ii b ị d iiììg d ịclì chè: Mẫu chè đem phân tích được sấy ở nhiệt độ 50‘’C - 60"C cho đến khô, nghiền hoặc xay nhỏ và rãy qua rây tiêu chuấn. Tỷ lệ pha c h ế ; 2g ch è/250 ml nước cất i hoặệ : 3g ch è/500 m l nước cất i Chd 3 gam chè đã nghiền nhỏ và bình cầu dung tích 500m l, cho thê n vào đó 300 ml n ir ^ cất đun sôi, đun tiếp trên nồi cách thuỷ khoảng 45 phút, tron|> khi đun cứ 1 0 bình. phúỊ lấc bình m ột lần, đun cho đến khi toàn bộ chè lắng chìm xuống đáy I Diinịl dịch chè đang còn nón g được lọc bằng g iấ y lọc hoặc bông B ắn g sang bình định ^ ứ c 5 0 0 m l, dùng nước cất đun sôi tráng rửa bã chè nhiều lần v | lọc sang bình định taức, cuối cùng dùng nước cất điểu chinh mức dung dịch đến ịvạch quy định. Cất á ữ dung dịch chè để đưa đi phân tích. C ln Ỉấ ii độ kiểm chứng: Cho vào bát sứ to một lượng nước 750 ml và 25 m l dung dịch indiậocacm in 0,1% tro n í m ôi trường axit. Dùng dung dịch KMnƠ 4 0 ,1 N chuẩn độ ch() đến khi mất màu x Ịm Ii. G h i kết quả (k ý hiệu A m l K M n Ơ 4 0,1N ) Chaẩn độ tanin trong chè Cho vào bát sứ to; 7 5 0 ml nước, 25 ml dung dịch indigocam in 0,1 % trong môi trườriị[ axit và lOml dung dịch chè đã chuẩn bị ở trên. Dùng dung dịcn KM n 0 0 4 , 1 N chuấÌB đô chính xác đến mất màu xanh của dung dịch (lúc này dung dịch chuyển saỊig màu vàng nhạt), ghi lại kết quả (k ý hiệu B m l dung dịch K M n 0 4 0,1N ) d. T hh kết quả HàmTỮOTĨ^tãHn cHẽ tuiTi ĩĩiẽõ ^ lrộ n g lữợĩĩg chấrKHỗ x= V .K .M .(B -A ) .100 V.G 237 trong dó: V - tổng thể tích dung dịch chè đã pha ch ế (ml); V - thể tích dung dịch chè đem phân tích; K - hệ số tính tanin tương líng với 1 ml KMnƠ 4 ; K = 5,83 m g /lc c KMnO^ 0,1N hay K = 0,00583 g / / ; M = nồng độ thực / nồng độ chuẩn; G - trọng lượiig chất khô của mẫu chè đem pha ch ế dung dịch (g); (B - A) - hiệu số lượng KMnƠ 4 dùng để chuẩn độ dung dịch chè và dung dịch kiểm ch ứ n g. B à i 5 : Đ ịn h lư ợ ng calechỉn tro n g hỗn hợp ta n in chè Tanin chè là một hỗn hợp chất phenol chiếm khoảng 30% trọng lượng chất khô của chè. Tanin chè gồm các nhóm catechin, antoxantin, antoxianidin, các axit phenol cacboxylic v .v ... Trong đó nhóm chất catechin chiếm trên 90% tổng lượng các hợp chất phenol của chè. Người ta có thể tách riêng từng chất catechin bằng phương pháp sắc ký trên giấy và định lượng chúng bằng phương pháp xác định mật độ quang học của chúng. a. Nguyên tắc Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm: cân chính xác Ig chè đã sấy khô và nghiền nhỏ cho vào bình cầu có dung tích 100 m l, cho thêm 20 - 25 ml etanol 96% đun tuần hoàn trên nồi cách thuỷ trong 45 phút. Sau đó lọc qua giấy lọc, dung dịch thu được chuyến sang bình định mức có dung tích 25 m l, làm nguội, dùng etanol 96% điểu chỉnh đến vạch quy định. Lắc đều, cất giữ làm dung dịch thí nghiêm. Chuẩn b ị giấy và cììấm m ẫu: Giấy sấc ký dùng để chấm mẫu thường gồm hai loại: - Loại thứ nhất: cắt theo hình chữ nhật, dùng trong phương pháp treo đứng. Kích thước giấy có thể thay dổi phụ thuộc vào yêu cầu thí nghiệm và kích thước thùng sắc ký. Nói chung thường dùng loại kích thước 238 8 X 60 hoặc 10 X 60 cm. - Loại thứ hai: Cắt theo hình tròn trong pliirơng pháp đặt nằm ngang. Thường dùng kích thước của giấy có đường kính 20 - 25 cm. Trên mỏi loại tờ giấy sắc ký có thể chấm mẫu tại điểm đối với loại treo và 8 điểm mẫu đối với loại nằm ngang, mỗi điểm chấm 0,025 ml dung dịch thí nghiệm. Để bảo toàn phân ly và tách biệt được các cấu tử trong hỗn hợp tanin chè cần chấm mầu gọn trong phạm vi hẹp với đường kính điểm chấm 0,5 cm , cần phải tiến hành chấm nhiều lần cho một điểm mẫu, vì vậy phải dùng micropipet loại 0,005 ml và khi châìn mầu phải liên tục thổi khô mẫu chấm bằng luống không khí lạnh khô, tốt nhất là luồng khí nitơ. Chú ý: V ị trí chấm mẩu trên giấy sắc ký quy định như sau: - Loại giấy treo đứng: cách biên ngang > 10 cm và cách biên dọc > 2cm - Loại siấ y đặt nằm ngang: cách tâm > 5 cm, tại tâm của tờ giấy có rạch một vạch dài 1 - 1,5 cm để cắm bấc hút dung môi khi tiến hành phân tích. h. Tiến hành Bình sắc ký hoặc thùng sắc ký nên tạo độ chân không là 240 mm thuỷ ngân. Cho dung dịch đã bão hoà dung m ôi vào đáy bình hoặc đáy thùng sắc ký, sau đó đổ dung môi vào hộp chứa hoặc máng chứa. Hỗn hợp dung m ôi có tỷ lệ như sau: - 80 ml butylic 95%; - 2 0 ml axit axetic 1 0 0 %; - 25 ml nước cất. Sau đó đặt giấy sắc ký dạng tròn đã cắm bấc chạm hộp chứa dung môi hoặc treo giấy sắc ký dạng hình chữ nhật nhúng vào máng dung m ôi, đậy kín nắp bình hoặc thùng sắc ký, sau khi rút không khí ra và cho ngay khí nitơ vào thì quá trình phân tích được bắt đầu. T h ờ i gian phân tích được kéo dài từ 8 - 12 giờ, trước khi dung m ôi thấm đến gần mép giấy thì kết thúc và thổi khô giấy sắc khí ngay ở nhiệt độ cùa phòng. 239 XÍIC đ ịiili các cấu tử cutecliiii Sau khi phân tích xong, tuỳ theo yêu cầu của thí nghiệm mà tiến hành phân tích định tính hay định lượng catechin. Nói chung, mỗi lần thí nghiệm đều tiến hành cả định tính và định lượng catechin. V ì vậy, ngữời ta đem gỉấy sấc klíí đã ttó i vào soi duới (lén tluỳnh quang, dùng bút chì khoanh lại hình dáng của các nhóm điểm mà qua phân tích sắc ký đã phân lý địíỌC. Dựa vào hình đã khoanh được bằng bíit chì, cắt riêng từng ihành giấy chứa mẫu để dùng vào việc xác định catechin sau này. 1 Đ ịnh tính catechin Từng loại catechin sau khi đã được phân tích sắc ký trên giấy sẽ íiọp thành từng nhóm điểm riêng biệt, vị trí của từng nhóm điểm đó phục thuộc vào' giá trị R| của từng loại catechin (Rf là tỷ sô' giữa khoảng cách tính từ điểm chấm đến mép cuối của dung m ôi đã thấm ra). ban đầu - NhẸtog nhóm điểm này có thể hiện màu với dung dịch m uối sắt hệá trị cao, vanilin liQậc hỗn hợp dung dịch H N O rA g-A m oniac cho kết tủa tốt nhất. ở bặi thí nghiệm này, người ra phun hỗn hợp dung dịch H N O rA gịA m oniac lên giấy sắc ký, sau khi các nhóm điểm đã hiện màu đen xám rõ rệt, nguệi ta đem giấy sắc k ý đi sấy khô ở nhiêt đô 80"C, cuối cùng dung dịch natri thiosunịfat 1% để rửa bằng cách ngâm trong dung dịch này 2 - 3 phút, sau đó dùng nước cấtỉrửa nhiều lần. Sau Iđú sấy khô sẽ thu được ảnh của các catechin. Những nhóm điểnị màu này khi đã khộ sẽ có màu đen thẫm, có thể chụp ảnh được để làm tài liệu. Đ ối VỚI dung dịch chè, nói chung, trên m ỗi điểm mẫu chấm ban dMu, sau khi phân tích sắc ký, phân ly ra dược và hiện lên 5 nhóm điểm, lần lượt tương LÌmg với: 240 D í , - Epicatechingalat có Rr = 0,85 2) L - Epigalocatechingalat có R| = 0,73 3) L - Epicatechin + D, L - catechin có Rị = 0,61 4) D, L - galocatechin có R| = 0,51 5) L - Epigalocatechin có R| = 0,43 ị Chương 10 MỘT SỐ CHẤT VÔ C ơ G Â Y ĐỘC ■ ■ 10.1. GIÓI THIỆU Các chất độc hoá học gây độc với cơ thể con người có thể có trong lương thực, thực phẩm thường phải kể đến các kim loại nặng như: đồng, chì, kẽm, thiếc, các hợp chất chứa asen, các hợp chất chứa flo ...... Thực phẩm có thể bị nhiễm các chất độc nói trên từ nhiều nguồn khác nhau: nguồn nhiễm độc đầu tiên là do trong quá trình sản xuất hoặc bảo quản thực phẩm đã sử dụng không đúng nguyên tắc các dụng cụ chứa đựng, hoặc các thiết bị ch ế tạo từ sắt được tráng kẽm và đồng. Đặc biệt là đối với những thực phẩm chứa một lượng khá lớn axit hữa cơ như các loại rau quả muối chua, nước quả, bột quả, các đồ hộp quả, nước uống lên m en ... Các đồ sành sứ, tráng men chứa lượng chì m onooxyt cao dễ gây nhiễm độc chì cho thực phẩm nếu chúng được dùng để chứa đựng thực phẩm. Các đường ống dẫn thường được phủ một lớp chì để chống gỉ, lượng chì này có thể đi cùng với nước vào thực phẩm .... V iệc sử dụng các bình mạ thiếc trong sản xuất thực phẩm cũng dễ gây nhiễm độc thiếc cho thực phẩm, ở các xí nghiệp bánh kẹo, đồ hộp .... có những bộ phận sản xuất các sàn phẩm thực phẩm có độ axit cao do vậy bình mạ thiếc rất dể bị phá huỷ là cho thiếc lẫn vào thực phẩm. Trong nông nghiệp, việc sử dụng các thuốc trừ sâu là hợp chất chứa asen và các thuốc diệt côn trùng trong các kho thóc, gạo....cũ n g có thể là nguồn asen đưa vào lirơng thực, thực phẩm 241 Những nhà m áy sản xuất nhôm , phân lân (supepliotphat), thuốc Irừ s â u .... thường thải khí hydro tlorua (IỈ2F). Chất H ịP này dề bay hơi làm nhiễm bẩn m ôi trường nước đất, cây cối bao quanh khu vực nhà m áy. D o đó sản phẩm lương thực, thực phẩm của các vùng xung quanh các nhà m áy nói trên có thể bị nhiễm độc flo. N ói chung, các luơng thực, thực phẩm nhiễm các chất độc trên thường c ó vị tanh kim loại. N gười ăn phải các sản phấm chứa chất độc sẽ gặp những triệu chứng như: xám lợi, nôn mửa, nhức đầu, rối loạn tiêu hoá nặng. Trúng độc liều cao c ó thể gây nguy hiểm tới tính mạng. Hàm lượiig tối đa cho phép của một số kim loại nặng hoặc dư lượng thuốc trừ sâu ch o phép được nêu trong tiêu chuẩn và an toàn thực phẩm . Sau đây là đặc điểm của m ột số chất vô cơ gây độc : Đ ồn g (Cu) là một thành phần cần thiết của khẩu phần ăn với liều lượng hàng ngày 0 ,0 3 3 m g đến 0,05m g/k g thể trọng. V ới liều lượng này không thấy tích luỹ đồng trong cơ thể. Với liều lượng lớn hơn có thể gây những triệu chứng ngộ độc cấp tính nhimg không c ó dấu hiệu gì đồng gây ung thư ch o con người, ở nồng độ nào đó có thể làm ảnh hưởng tới vị và giá trị dinh dưỡng của thức ăn. Hàm lượng đồng tối đa trong thực phẩm qui định tạm thời là 0 ,0 5 m g /k g thể trọng trong một ngày. Chì (Pb): là một thành phần không cần thiết của khẩu phần ãn. Trung bình hàng ngày trong khẩu phần ăn có lẫn từ 0 ,0 0 3 - 0 ,0 0 5 m g ch ì/k g . N goài ra có thể có thêm khoảng 0 ,0 0 13m g chì/kg từ không khí bị nhiễm bẩn. T h eo nhiều tác giả luợng chì gây độc tích liiỹ từ l-2 m g . Với liều lượng cao hơii ch ì sẽ g â y n gộ độc cấp tính. V ới liều lượng thấp hơn, nhưng ăn rải ra nhiều ngày dễ bị n g ộ đ ộc hơn. Liều lượng chì tối đa có thể chấp nhận hàng ngày do thực phẩm đưa vào c ơ thể quy định tạm thời là 0,005rr.g/kg thể trọng. T hiếc (Sn): là thành phần bình thường của khẩu phần ăn, không c ó chức năng sinh lý gì, tính độc hại thấp, ở châu Âu và Bắc M ỹ người ta tính ra rằng : một người m ột ngày c ó thể ăn từ 2-4 m g thiếc. Với liều lượng này, hầu như không có sự tích luỹ thiếc trong cơ thể và không có dấu hiệu gì chứng tỏ về lâu dài thiếc gây độc hại với cơ thể con người. 242 Kẽm (Zn) là thành phần lự nhiên của thức ãn và cần thiết cho đời sống con người. Một kháu phần cung cấp hằng ngày lừ 0,17-0,25m g kẽin/kg thế trọng. Nói chung cOng chưa có số liệu cụ thể về liều lượng kẽm gây nhiễm độc cho cơ thể người. Asen fA s) còn gọi là thạch lín, có tự nhiên trong thực phẩm. Nhưng các hợp châì vô cơ cLÌa asen với liều lượng cao rất độc. Nếu ăn phải loại thực phấm nhiẻm asen hoặc do tiếp xúc với asen thì có thể bị nhiễm độc mãn tính. Do vậy nhiều nước trên thế giới đã qui định giới hạn liều lượng sen tối đa trong thực phẩm. Người ta xác định rằng nếu hằng ngày hấp thụ vào cơ thể từ 0,007-0,6 mg asen/kg thể trọng thì không bị nhiềm độc. Nếu nhiễm asen qua máu sẽ độc hơn rất nhiểu so với qua đường tiêu hoá. Liều asen gây chết người sau 24 giờ là 2m g/kg Ihể trọng. Các kim loại nạng trong lương thực thực phẩm thường đựơc xác định theo phương pháp "Ditizon". Ditizon (diphenyl thiocacbazon) có công thức: s=c H N -N --C H , H ^ ' Ditizon tan trong cacbon tetraclorua và cloroíorm tạo thành dung dịch có màu xanh lá cây, ở dạng phân tử trong môi trường axit hoặc trung tính ditizon rất khó tan trong nước. Dung dịch càng có phản ứiig kiềm thì độ tan của dilizon càng tăng do tạo thành anion Dz HDz = (dung m ôi) Dz+H^ (nước) Ditizon tạo với ion nhiều kim loại những ditizonat có màu ít tan trong nước trong cacbon tetraclorua hay cloroíorm. Các ditizonat có thể tồn tại dưới hai dạng, tiiỳ vào độ axit của môi truờng: - Trong m ôi trường axit hay trung tính chúng tồn tại dưới hai dạng xeto; - Trong môi trường kiềm chúng tồn tại dưới dạng enol. 243 H N s N N c M, N M. s N CaHs M. c N N Dạng xeto N C ^H j Dạng enol Dạng enol thường ít tan trong cacbon tetraclorua hay cloroữorm . Phản ứng cân bằng chính xảy ra khi chiết: M"* (nước) + nHDz = (dung môi) MDz + (dung m ôi) nH" (nước) Ngoài ra còn phản ứng: + (nước) Dz = HDz pK, = 8,7 (dung môi) Hiện nay phương pháp ditizon được dùng rộng rãi để xác định các độc tố kim loại trong lương thực thực phẩm; Bảng 10.1 ghi các giá trị pH chiết được hoàn toàn các ditizonat của một vài kim loại thường có thể lẫn trong thực phẩm. Bàng 10.1. Nguyên tố kim loại và pH dung dịch chiết Nguyên tố pH Điểu kiện màu của ditỉzonat Dung môi chiết chiết hoàn toàn Đổng (Cu++) Môi trường axit, đỏ, tím. 2-5 CCl, sắt (Fe++) Môi trường kiềm, đỏ, tím. 7-9 CCI, Chì (Pb++) Đỏ 7-10 CCI, Thiếc (Sn++) Đỏ 5-9 CCI4 Kẽm (Zn++) Đỏ 6-9 CCI4 244 Các giá trị pH chiết hoàn toàn ditizonat nói trên chỉ là gần đúng vì pH này phụ thuộc vào các điều kiện chiết như: tỷ số thể tích hai dung môi chiết, lượng thuốc thử dư, các anion có lẫn trong dung dịch và lực ion của dung dịch. 10.2. THỰC HÀNH B à i 1. C hẩn bị d u n g dịch đê xác đ ịn h đổng, chỉ, kẽm, thiếc Đồng, chì, kẽm, thiếc có trong thực phẩm với lượng nhỏ nên muốn xác định chúng cần phải vô cơ hoá mẫu thực phẩm. Có hai phương pháp vô cơ hoá mẳu. Phương pháp khô a. Dụng cụ, lioá chất - Capxun dung tích 250m l - Bếp cách cát - Pipet lOOml - Bếp điện - Bình định mức 250m l - Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (600-700"C) - Cân kỹ thuật - Magie dioxyt (M g 0 - Phễu - Canxi axetat CaíCH^COO) 2 - Giấy lọc - Axit nitric đậm đặc (d = 1,4) 2 ) b. Cách tiếu hành Dùng pipel lấy chính xác lOOml thực phẩm (nếu là sản phẩm lỏng), hoặc cân lấy lOOg thực phẩm (nếu là sản phẩm khô) cho vào capxun. Thêm vào capxun 0,5g M gƠ 2 và 0,5g Ca(CH.,C0 0 ) 2 để tăng tốc độ vô cơ hoá và chống việc tạo thành các hợp chất bay hơi của kim loại nặng khi vô cơ hoá mẫu. Các chất này nhất thiết không được chứa thiếc, đồng, chì. Đạt capxun lên bếp cách cát, đốt cho thực phẩm cháy thành than. Đặt capxun vào lò nung ở nhiệt độ 600 - 700"C đến kh i thực phẩm biến hoàn toàn thành tro xám (mất khoảng 3 giờ). Lấy capxun ra khởi lò nung để nguội. Cho vào capxun 20m l axit nitric đậm đặc (tuyệt đối không chứa đồng và chì) và 50ml nước cất hai lần. Đặt capxun lên bếp điện đun cho tan hết muối bám ở capxun đun sôi thêm 10 phút nữa (tiến hành trong tủ hút). Chuyển toàn bộ dung dịch từ capxun vào bình định mức dung tích 250m l. Tráng rửa capxun nhiều lần 245 bằng nước cất hai lần, nước tráng cũng chuyển vào bình định mức. 'rhêm nước cất đến vạch mức lắc kỹ. Phương pliáp ướt a. Dụng cụ: Như đã nêu ở phần trên b. Hoá chất : - Axit nitric đậm đặc (d = 1,4) - Axit suníuric đậm đặc (d = 1,84) - Am oni axetat NH^CHiCOO c. Cách tiến lìà iìli: Lấy lượng mẫu như trên cho vào capxun. Thêm vào capxun 3ml axit nitric đậm đặc và 50ml axit sunĩuric đậm đạc. Đặt capxuii lên bếp điện, đun xôi dung dịch trong capxun. Vẫn tiếp tục đun và cứ mỗi phút lại nhỏ thêm 5-20 giọt axit nitric đậm đặc. Quá trình phải làm trong tủ hút bởi khí mầu nâu sẽ thoát ra. Nếu thấy mầu dung dịch trong capxun thẫm lại thì phải tăng tốc độ nhỏ axit nitric đậm đặc. Khi dung dịch trở lên nhạt màu thì giảm tốc độ nhỏ axit nitric cho đến khi dung dịch trở thành không màu thì dừng lại. Tiếp tục đun cho khói trắng bốc đi hết rồi lại tiếp tục đun sôi thêm 10 phút nữa. Nếu sau đó dung dịch vẩn giữ không màu thì việc vô cơ hoá mẫu đã xong. Nếu dung dịch đen trở lại thì lại tiếp tục nhỏ thêm axit nitric cho đến khi dung dịch trở lại không màu. Lấy capxun ra khỏi bếp điện cho vào capxun 0,2g amon axelat, khuấy cho tan hết. Chuyển toàn bộ dung dịch từ capxun vào bình định mức dung tích 250m l thêm nước cất hai lần đến vạch mức, lắc kỹ. Nếu dung dịch trong capxun bị clục ihì phải lọc trước khi chuyển vào bình định mức. G hi chú: Phưcmg pháp đốt khô nói trên có thể xác định được đồng và chì cũng được thừa nhận đế xác định thiếc. Dùng MgƠ 2 để giải phóng ra oxi hoạt động, giúp oxi hoá nhanh các chất hữu cơ. Ca(CH,C 0 0 ) 2 đóng vai trò phá vỡ M gƠ 2 , làm tăng lượng oxi hoạt động phóng vào chất hữu cơ do đó làm tăng tốc độ đôì. Cũng có thể dùng M g(CH 3 COO)j và NaCl, M g(CH,C 0 246 0 ) 2 và Ca(CH,CO O ) 2 ; NH,C1 và NaCl; (N H 4 )2 C O ,...T u y vậy hổn hợp MgOs và Ca(CH,COO ) 2 với tỷ lệ 1:1 làm cho tốc dộ đốt chất hữu cơ nhanh nhất. Nếu đốt khô không dùng hỗn hợp MgO; và canxiaxelat, thì muối thiếc dễ bay hơi và một phần Sn nằm dưới dạng không tan là axit P-metastanic. Sự mất thiếc trong đốt khô như vậy có thè’ từ 2,7-77,6% . B à i 2. X ác d ịn h c h i bằng ph ư ơ n g pháp chiết chu ẩn độ a. Nguyên lắc Trong m ôi trường trung tính hoặc kiềm, ion chì (Pb^"^) tạo với ditizon thành chì ditizonat màu đỏ tím trong dung dịch dung môi hữu cơ Pb'" + 2 H 2 Dz = Pb(HDz ) 2 + 2 i r V ì Pb(H Dz ) 2 tan rất ít trong dung môi hữii cơ, khi đó khi dùng môi trưòng trung tính thì tốt nhất nên dùng nồng độ của ditizon trong cacbontetra clorua là SOịì.M (microphân tử gam: 12,81m g/lít). Trong clorofom, Pb(H Dz ) 2 tan gấp 17 lần trong cacbon tetraclorua. Do đó để xác định chì, người ta thường dùng cloroform để hoà tan ditizon . lon chì cũng tác dụng với ditizon trong môi trường axit yếu. ở pH>7 thì việc thu vào dạng Pb(HDz ) 2 là hoàn toàn. Dung dịch Pb(HDz ) 2 trong clorofom bị phân huỷ ở pH >9,5. Trong dung dịch, sau khi vô cơ hoá thực phẩm, có thể cũng có mật các ion Sn^'"' Cu^^, Zn^*, (KCN) nhưng ...... các ion này có thể liên kết (bị che giấu) bằng kalicyanua không bị che bởi KCN nên tách ra khỏi dung dịch trước khi xác định chì. Phương pháp tách như sau: Lấy 25m l dung dịch từ bình định mức cho vào cốc có dung tích 250m l. Cho vào cốc lOOml brom lỏng (B ĩi) và đun trên bếp diện để đuổi hết hơi SnBr4 . Tiếp tục đun, thêm nước cất vào, rồi lại tiếp tục đun cho đến khi dung dịch không còn màu đỏ của brom. Lúc này dung dịch chi chứa các ion Pb"^, Cu^^, Zn'^Fe^^... b. D ụng cụ, lio á chất - Cân phân tích; - Bình định mức lOOOml; - Cốc dung tích 250m l; 247 - Phiễu chiết dung tích lOOml; - Buret lOml; - Giấy thử pH; - Kalicyaniia tinh Ihể; - Hydroxylamin hydroclorua tinh thể (N H 2 OH.HCI). - Dung dịch chì tiêu chuấn 25 |.iM : Hoà tan 8,28m g P b(N 0,)2 tinh khiết loại I trong nước cất 2 lần thành lOOOinl (trong bình định mức lOOOml). 1 ml dung dịch này chứa 5,175 Y chì. - Dung dịch ditizon tiêu chuẩn : Ditizon trong clorofom dung dịch 50,0ụM . Cân tính xác trên cân phân tích 12,81mg ditizon tinh khiết loại I cho vào cốc. Cho 200m l cloroíom (CHCl,) vào cốc khuấy nhẹ cho tan ditizon. Chuyển dung dịch vào bình định mức dung tích lOOOml. Thêm cloroíom vào vạch mức lắc kỹ. - Am oniac dung dịch 2N; lấy 150ml amoniac dung dịch 25% cho vào bình định mức dung tích lOOOml, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ. - Axit nitric dung dịch 2N : Hoà tan 128 ml H N O ,đ ặc (d =1,4) với nước cất thành lOOOml. c. Cách tiế ii hành Dung dịch loại ở trên được chuyển vào phễu chiết. Cho vào phễu vào tinh thể NH 2 OH.HCI lắc cho tan hết. Cho vào phễu m ột lượng (bằng hạt ngô) tinh thể KCN và lắc cho tan hết. Điểu chỉnh pH > 7,5 (theo giấy đo pH) bằng NH 4 OH 2 N h o ặ c H N O , 2N. Nạp ditizon dung dịch 50 vào trong lOml. N hỏ Iml dung dịch ditizon vào phều thuỷ chứa dung dịch mẫu trên, lắc 30 giây. Nếu có thì trong phần dung môi cloroữom sẽ hiện rõ màu đỏ tím của chất chì ditizonat. Chiết bỏ phần đỏ tím đi (phải chiết thật cẩn thận để phần dung dịch màu không chảy ra). Lại cho thêm Iml dung dịch ditizon vào phễu chiết, lắc 30 giây và lại tách bỏ phần màu đỏ tím. Cứ tiếp tục như trên cho đến khi màu của phần dung môi trong phễu chiết kém đỏ, tức lượng trong dung dịch giảm đi nhiều thì phải giảm lượng dung dịch ditizon nhỏ vào phễu chiết xuống đến 0 ,2 ml, lại lắc và tách như trên đến khi nhỏ ditizon vào phểu chiết, ditizon vẫn giữ màu xanh sau khi lắc 30 giây thì thôi ghi tổng số ml dung dịch đitizon đã dùng để chiết chuẩn độ ion chì. 248 Cần phải xác định độ chuẩn chính thức của dung dịch ditizon trong clorofom 50,0 ị-iM như sau : ỉấy chính xáclO m l dung dịch chì tiêu chuẩn vào phễu chiết sạch. Nạp dung dịch diiizon 50,0|_im vào burei. Tiến hành chuẩn độ như trên. Chắng hạn hết 15ml dung dịch ditizon. Căn cứ vào độ chuấn của của dung dịch ditizon này, tính kết quả xác định chì. (I. Tính kết quả Trước hết lính xem 1 ml dung dịch ditizon ứng với bao nhiêu 1 ml dung dịch Pb(N 0 ứng với số Ị.ig 0 2 chì. Ta biết 25 )LiM chứa 5,175 I-Ig chì. Vậy 1 ml dung dịch ditizon chì: 5,175.10 — = 3,45 ịig chì Hàm lượng chì tính bằng Ị.ig có trong 1 lít hoặc 1 kg thực phẩm là: ^ 3 ,4 5 .a .V .1 0 0 0 '^1 , '^0 trong dó: 3,45: số chì ứng với 1 ml dung địch ditizon ; a : thể tích dung dịch ditizoii đã dùng để chuẩn độ; V : dung tích bình định mức, ml; V, : thể tích hút ra từ bình định mức để phân tích, ml; v„ : thể tích thực phẩm lỏng lấy dể vô cơ hoá, ml. Kết quả được tính ra |.ig /kg. Nếu hàm lượng chì lớn hơn 1000 yigjl thì kết quà được tính ra m g// ( 1 |ig = 1 0 '^ mg). V í dụ lính toán V í dụ lấy 100 ml dung địch thực phẩm đem vô cơ hoá, sau đó đem định mức trong bình dung tích 250m l. Hút 25m l dể loại rồi dung dịch (sau khi loại Sn^^) được cho vào phều chiết đủ và chuẩn độ chì hết lOml ditizon. Hàm lượng chì tính ra mg/1 là 249 3 ,4 5 .1 0 .2 5 0 .1 0 0 0 .. X= — — - — — — = 3 ,4 5 m g // 2 5 .1 0 0 .1 0 0 0 G hi chú: 1. Nếu trong dung dịch (sau khi vô cơ hoá thực phẩm) để xác định chì có chứa các cation và anion sau đây thì việc ảnh hưởng của chúng đến việc xác định chì như sau: - A g^ Zn^^ Ni"* không cản trở đến việc xác định chì vì chiliig đều bị che giấu bởi KCN; - PO 4 ' nồng độ cao có thể thu - SO 4 có thể tạo với ở dạng Pb,(P 0 j thành PbS 0 4 2 ; có thể hoà vào dung dịch bằng NH,CH,COO; - SiOs.nHiO ở dạng kẹo, gây khó khăn cho việc chuẩn độ bằng ditizon. Cần lắc mạnh phều chiết khi chuẩn độ. Tốt hơn là nên đuổi SÌO2 đi bằng cách cho HF vào để SÌO2 bốc hơi dưới dạng axit flo silix ic ... Tuy nhiên trong đa số thực phẩm, lượng các ion trên là rất nhỏ. 2. Phương pháp xác định kim loại nặng bằng ditizon là phương pháp lượng nhỏ, nê n c ác hoá chất d ù n g là hoá chất tinh kh iế t loại I; c ác d ụ n g CỊI phải đư ợ c rửa sạch, kỹ, dùng nước cất hai lần tráng lại nhiều lần và trong quá trình tiến hành luôn luôn phải dùng nước cất hai lần. 3. Dung dịch ditizon tiêu chuẩn phải pha trong clorofom . Clorofom là loại dung môi dẻ bay hơi nên nếu không có điều kiện bảo quản lạnh, dung dịch ditizon rất dễ tăng nồng độ. Vì vậy tốt nhất m ỗi lần sử dụng cần xác định độ chuẩn của nó bàng dung dịch chì tiêu chuẩn. 4. Phương pháp chuẩn độ chì (và kim loại nặng khác) bằng dilizon, nếu không được tiến hành cẩn thận, dễ mắc sai số do việc nhỏ giọt ditizon dễ bị dư ở giọt cuối cùng dùng phương pháp so màu sẽ cho kết quả chính xác hơn. 5. Xác định chì bằng phương pháp so màu xem tài liệu chuyên môn. 250 B à i 3, X á c đ ịn h đồng bằng p h ư ơ n g p h á p chiế t chu ẩn độ a. Nguyẽìì tắc Khi phản ứiig với ditizon, ion đồng thay thế một phức chất màu đò tím (phương trình I); m và thay thế hai của diiizon tạo thành của ditizon tạo thành phức chất màu vàng nâu (phương trình Ila và llb) Cu'" + 2 = C u(H D z ) 2 + 2H" (I) Cu'" + C u(H D z ) 2 = 2CuDz + 2H" (Ila) + H 2 Dz = CuDz + 2H" (Ilb) Cả hai lớp chất C u(H D z ) 2 và CiiDz đều tan trong m ôi triròng dung môi hữii cơ nhưng không tan được trong nước. V iệc tạo thành C ii(H D z ) 2 xẩy ra thuận lợi trong m ôi trường axit yếu và có dư ditizon. Trong môi trường trung tính ihấy xuất hiện đồng thời các phản ứng ( 1 , Ila, Ilb). ở nồng độ cao và pH = 2 việc tạo thành CuDz xảy ra thuận lợi Trong vùng dung m ôi hữu cơ, Cu(H Dz ) 2 dễ phân li tạo thành CuDz: C u(H D z ) 2 = CuDz + H 2 Dz Do vậy, để xác định đồng bàng ditizon người ta thườiig tiến hành phản ứng ở pH = 3 -4 . b. Dựng cụ, lio á chất + Dụng cụ: Sỉr dụng các loại như đã nêu ở mục trên + Hoá chất: - Amorãac dung dịch 2N ; - A xit í-unruric dung dịch 2N: Hoà 55ml H 2 SO 4 (d = 1,84) vào nước cất, chỉnh đến V = 1000 ml; - Dung dịch ditizon trong clorofom 50 |iM; - Dung dịch đồng tiêu chuẩn: Hoà tan 19,64 mg CUSO4.5H2O tinh khiết loại I trong nước cất đến thành lOOOml (trong bình định mức), 1 ml dung dịch này chứa 5,0 ng đồng. 251 c. Tiến hành Cũng sử dụng dịch đã loại Sii^'' (như khi xác định chì), cho vào phễu chiết. Điều chinh pH của dung dịch đến pH = 3 h-4 bằng dung dịch am oniac 2N hoặc axit suníuric dung dịch 2N với giấy thử pH. Chuẩn độ lượng đồng bằng dung dịch ditizon đã dùng. d. Tính kết quả Tương tự như tính kết quả khi xác định chì bằng phương pháp chiết chuẩn độ G hi chú: 1. Ag'" cũng tác dụng với ditizon tạo thành A gH D z do đó cản trở việc xác định đồng, Có thể che giấu Ag^ bằng KBr. 2. Zn^'^ cản trở việc xác định đồng bằng ditizon. Nhưng nếu giảm pH xuống còn pH = 1 thì 3. không cản trở. cản trở xác định đồng. Dùng amoniac tạo kết tủa Fe(O H ),. Lọc bỏ kết tủa này, nước lọc được cho vào phễu chiết để xác định đổng. 4. CO^'^ và Ni^'^ nồng độ cao, có thể phản ứng với ditizon đồng thời với Nhưng nếu giảm pH nhỏ hơn 2 thì không cản trở. 5. Các ion S2 O / , [Fe(CN)fi]'^ cản trở xác định với bất kỳ lượng nào CNS vừa phản ứng với Cu^^, vừa phản líng với ditizon, nên cản trở việc xác định 6. Xác định bằng phương pháp so màu: thu toàn bộ phần dung môi màu đỏ tím khi xác dinh đồng (bằng phương pháp chuẩn độ) vào bình định mức dung tích 25 111 I, tliêm cloroíom cỉến vạch inức, lắc kỹ. Đ o màu dung dịcli Irèn rnáy ệaK-M (tương tự như việc xác định chì). B à i 4. X ác đ ịn h kẽm bằng phương ph áp so m àu a. Nguyên tắc Trong lương thực, thực phẩm, lượng kẽm thường rất nhỏ nên có thể xác định được bằng ditizon. Trong m ôi truờng trung hoà hoặc hoặc có tính kiềm ít (thích hợp nhất là ở nồng độ pH = 8,3 và trong dung dịch có chứa chất đệm xitrat) Z v ĩ* phản ứng với ditizon tạo phức chất màu đỏ. 252 . + 2 H 2 D z = Z n(H D z ) 2 + 2H* chú ý là phải loại các ion đồng, chì có trong dung dịch trước khi xác định kẽm h. Dụng cụ, hoá chất + Dụng cụ như đã nêu ở phần trên + Hoá chất: - Dung dịch am oniac 2N - Dung dịch kali-natri tactrat (KNaC 4 H 4 0 fi.4 H 2 0 ) 20%: hoà tan 20g kali- natritactrat trong lOOml nước cất. - Dưng dịch ditizon trong cloroíom 50|iM - Dung dịch natrisunfua (N a 2 S) bão hoà - Dung dịch kẽm tiêu chuẩn: cân 43,97m g kẽm suníat (ZnSƠ 4 .7 H 2 0 ) tinh khiết loại I cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm vào lOml axit suníuric dung dịch 2N , rồi thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ. Iml dung dịch này chứa 10 |ig kẽm. c. Tiến Ììành Lấy 25m l dung dịch đã vô cơ hoá (bằng phưcmg pháp khô và ướt) cho vào phễu chiết. Trung hoà bằng dung dịch amoniac 2N đến pH=7 (thử với giấy pH), để yên cho phân lớn. Tách,bỏ lớp dưới có phức chất đồng - ditizonat màu đỏ tím. Lại thêm ditizon và tiếp tục lắc cho tới khi không còn màu đỏ tím ở phần ditizon. Trút phần dung dịch ditizon vào một cốc. Cho 3ml kali-natritactrat dung dịch 20% để chống kết tủa các hydroxit kim loại. Trung hoà bàng dung dịch amoniac 2N. Chuyển toàn bộ dung dịch từ cốc vào phễu chiết lắc kỹ. Dung dịch sẽ có lớp màu đỏ của kẽm ditizonat. Cho vào phễu chiết lOmlnatrisufua dung dịch bão hoà (để loại chì và ditizon dư), lắc kỹ. Đ ể yên phễu cho tách lớp. Tách bỏ lớp dưới. Tiếp tục rửa N hịS cho đến khi lớp dưới không màu thì thôi. 253 Chuyển dung dịch kẽm-ditizonat màu đỏ vào bình định mức dung tích 25m l, thêm clorofom tới vạch mức rồi lắc kỹ đem dung dịch này đo màu trên máy (ị)3 KM. Đ ồng thời cũng lấy lOml dung dịch kẽm tiêu chuẩn vào phễu chiết khác. Tiến hành chuẩn độ trong dung dịch này với ditizon và cũng thu phần dung môi chứa kẽm-ditizonat màu đỏ vào bình định mức dung tích 25m l. Đem đo màu trên máy ệaK-M . r. T inh kết qitả V í dụ, trị sô' mật độ quang đọc được đối với 10 ml dung dịch kẽm tiêu chuấn là: 0,752; 0,751; 0,753. Tính trung bình 0,752. Trị sô' mật độ quang đọc được đối với 25m l dung dịch là: 0,502; 0,504; 0,505. Trung bình 0,504. Được biết rằng trong 10 ml dung dịch kẽm tiêu chuẩn có chứa; 10.10 = 100 Ị.ig kẽm. Vậy lượng kẽm có trong 25m l mẫu đem phân tích là: 10 0.0,504 — — ------- = 6 6 ,9 4 |ig 0,752 Từ đó tính ra lượng kẽm có trong llít hoặc Ikg lương thực, thực phẩm. Bài 5. X ác định thiếc bằng phương ph á p iod a. Nguyên tắc Sau khi vô cơ hoá lirơng thực thực phẩm ta được dung dịch chứa thiếc ở 2 dạng là tác dụng với và Sn'*^. Dùng hydro khử toàn bộ lượng sang dạng . Từ lượng iod đã dùng suy ra, tính được lượng thiếc có trong mâu thử. b. Dụng cụ, hoá chất - Pipet 50m l và 2 5 m l ; - Bình kíp ; - Bình đốt Kendan dung tích 500ml; - Nút tinh ; - Bình nón dung tích 500 ; - Biiret ; 254 rồi cho iod - Cân kỹ thuật ; - Axit clohydric đặc (d =1,19); - Axit siinfiiric đạc (d =1,84); - N h ô m kim loại (hạt hay bột); - Axit Iiitric đặc (d =1,14); - Canxi cacbonat CaCO,; - Amon axala' NH4C2O4 tinh thể; - Natri thiosuníat N a 2 S2 0 - lot dung dịch 0.0 IN; , dung dịch 0,01 N; - Tinh bột hoà tan, dung dịch 1%: Hoà tan Ig tinh bột trong lOOml nước cất; đun nhẹ cho tan hết. h. Tiến lià iilì Dùng pipet hút 50m l lương thực, thực phẩm (nếu là sản phẩm lỏng) hoặc cân lOOg (nếu ià sản phẩm khô) cho vào suníuric đặc và lOml axit nitric bình đốt Kendan. Thêm vào bình 50ml axit đặc, lắc đều. Dung bếp điện đun cho dung dịch trong bình sôi mạnh để hơi nước và khói trắng bốc lên (tiến hành trong tủ hút). Sau đó cho axit nitric vào thêm tìmg giọt một cho đến hết một lượng khoảng 3-4ml và tiếp tục đun cho tới khi dung địch trong bình có màu vàng nhạt, lúc để nguội không màu mới thôi. Cho vào bình 5g amoni oxalat tinh thể để khử hết các tạp chất chứa nitơ. Đun tiếp trên bếp điện cho tới khi có khói trắng bốc lên. Sau kh' dể nguội chuyển toàn bộ dung dịch từ bình đốt sang bình nón dung tích 500ml Dùng nirớc cất tráng bình đốt nhiều lần, nước tráng cũng cho vào bình nón 30inl axit clohydric đặc. Đậy bình nón bằng nút caosu có hai lỗ. Một lỗ cắm ống thiiỷ tinh để dẫn khí CO 2 vào, ống này cắm sát xuống đáy bình nón (xem hình 10.2.5). Lỗ kia cắm một ống thuỷ tinh khác dài lOcm và sâu xuống quá niit 3cm. Cho nhanh 0,5g nhôm (không chứa thiếc) vào bình nón và bắt đầu dẫn khí CO 2 từ bình kíp vào (xem hình 10.2.5), CO 2 đuổi oxi của không khí khỏi bình Iión, chống sự oxit hoá Sn^^. Đun sôi dung dịch trong bình nón, nếu thấy có kết tủa Sn thì đun kỹ cho tan hết. Đ ể nguội bình xuống đến nhiệt độ 15-20"c (dùng nước đá), trong lúc này vẫn tiếp tục dẫn khí CO 2 vào bình nón. 255 Nhanh chóng tháo bình nón ra 'khỏi bình kíp, m ở nút và cho nhanh 25ml dung dịch iod 0 ,0 IN (chứa trong buret) lắc mạnh và đều. Dùng nước cất tráng tất cả chất lỏng dính ở nút, ống thuỷ tiiih và thành trong của bình nón. Cho vào bình nón Iml dung dịch tinh bột tan 1%. Chuẩn độ iod dư bằng natri thiosunfat 0,0 IN cho đến khi dung dịch mất màu xanh. Phải chuấn thật nhanh, tránh oxi không khí vào nhiều ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Hình 10.2.5. Bộ sinh khí CO2 Phải là.n một mẫu trắng: Lấy 25m l dung dịch iod 0,01N vào bình nón sạch, thêm lOOml nước cất và 1 ml dung dịch tinh bột tan 1%. Chuẩn độ iod bằng natri thiosunfat dung dịch 0,01 N đến khi dung dịch mất màu xanh. c. Tính kết quả Hàm luợng thiếc (theo m g//) tính bằng công thức: x= 0,5935 ( a - b ) . 1000 V trong đó: 0,5935 : lượng Sn, tính bằng mg ứng với 1 ml dung dịch iot 0,01 N; 256 a : thể b : thể V : thể tích NasSiO, 0,0 IN dùng chuẩn mẫu trắng, ml; tích N a 2 S2 0 , 0,0 IN dùng chuẩn mẫu thử, ml; tích mẫu lấy để phân tích, ml. G h ì chú: í - Khi đốt mẩu HNO^ và H2SO4 lác dụng với nhau tạo axit nylrozynsunfuric, chất này có tác dụng oxi hoá mạnh các chất hỮLi cơ và cả Sn^''. Chất này trong dung dịch nước dễ phàn giải thành HO. ^so 2 + HOH = 2 H 2S O 4 + N O + N O 2 ONO'^ NO và N O 2 khi đun mạnh sẽ bốc hơi, khi đun nóng với sự có của các chất hữu cơ, H N O , sẽ phân giải theo phương trình 2 H N O , = H 2O + 2 N 0 + 3 0 Oxi hoạt động này sẽ oxi hoá các chất hữu cơ thành nước và CO 2 , CO 2 sẽ bị bay hơi khi đốt mẫu. H2SO4 hút nước và phá huỷ các liên kết phức tạp của protit, lipit, gluxit. N goài ra nó cũng bị khử một phần thành SO 2 : H2SO4 = H2O + SO2 + o O xi này giúp vào việc oxi hoá các chất hữu cơ, còn SO 2 sẽ bị bốc hơi khi đun nóng. 2- Khi nhôm gặp axit clohydric sẽ có phàn ứng: AI + 3HC1 = A lC l, + 3H Hydro này sẽ chuyển thành S1 1 CI4 + 2H = SnCl2 + 2HC1 hoặc thành thiếc kim loại: SnCl2 + 2H = Sn + 2HC1 Sn kim loại này tan được trong HCl Sn + 2HC1 = SnClj + 2H 3- Khi CaCO, gặp HCl sẽ tạo ra CO 2 CaCO., + 2HC1 = CaCl2 + CO 2 + H 2 O 257 Phản ứng này được thực hiện trong bình kip 4- Sn^'" oxy hoíí bởi I2 trong môi trường axit clohydric SnCl2 + I2 + 2HC1 = SnCU + 2H1 5- Phản ứng chuẩn độ I2 bàng NaịSiO,: Ỉ2 + 2 Na 2 S, 0 , = 2NaI +Na 2 S,Ofi B à i 6. X á c đ ịn h Asen Phương pháp đo màu bàng giấy tấm thưỷ ngân (II) clorua Các hợp chất chứa asen bị khử bởi hydro tạo thành asen hydrua. Chất này phản ứng với thuỷ ngân (II) clorua (HgCl 2 ) tẩm trên giấy lọc tạo thành hợp chất màu nâu. So sánh độ đậm màu của giấy này với dãy giấy tấm HgClí tiêu chuẩn sẽ tính lượng asen có trong mẫu thử. a. D ụng cụ, lio á chất - Ống đong 25m l; - Bê'p điện ; - Pipet lOOml, 25m l, 5ml; - Bê'p cách cát ; - Lò nung điều chinh nhiệt độ 400-50ơ’C ; - Bình định mức 250m l; - Cân kỹ thuật; - Giấy lọc cắt thành dải chữ nhạt; - Cân phân tích; - Bình nón dung tích 100 ml; - Ống thuỷ tinh: dài 30cm, đường kính 0,7cm; có một lỗ đường kính 0,3m l cách đầu dưới ống 22cm , ống được cắm qua lỗ của nút caosu 3cm. Giấy lọc tẩm HgCli đựơc đặt ở trong ống ở khoảng giữa nút và lỗ. - Axit nitric đậm đặc (d =1,14); - Axit clohydric đặc (d =1,19); - Kẽm hạt không chứa asen; - Asen trioxyt, tinh khiết loại I; - M agie oxyt (M gO ) bột; - Thuỷ ngân (II) clorua, tinh khiết loại I, dung dịch 5%; - Axetat chì Pb(CH,C 0 258 0 ) 2 dung dịch 3%; - Giấy tấm thuỷ ngân (II) clorua: nhúng ngập tấm giấy lọc ( 0 ,5 x l5 c m ) và HgCls dung dịch 5%. vớt ra ép vào giữa hai tấm giấy lọc cho khô và phảng; - Giấy tám axetat chì: nhúng ngập tấm giấy lọc (lx 8 c m ) vào P b(C H ,C O O )2 dung dịch 3% vớt ra. đế khô. Cuộn tròn giấy thành ống hình trụ, ch o vào đầu trên ống thiiỷ tinh. h. Tiến liàiìli Chuẩn bị duiig dịch thứ D ùng pipet hút lấy .lOOml sản phẩm lỏng (hoặc lOOg sản phẩm khô) ch o vào capxiin dung lích 2 5 0 m l. T hêm vào capxun Ig inagie ox y t (M gO ) và lOml axit nitric đậm đặc (d = 1,4); khuấy đều. Đạt capxuii lên bếp cách cát, đung dung dịch trong capxiin ch o tới khô. Đưa capxun vào lò nung, nung ở nhiệt độ 400-500"C để các chất trong capxun hoá thành tro. Đ ể nguội, cho vào capxim lOml axit clohydric đậm đặc (d =1 , 1 9 ) và 20m l nước cất. Đặt capxiin lên bếp điện đun ch o sôi dung dịch đến khi lớp tro tan hết. Đ ể nguội, lọc lấy dung dịch từ capxiin vào bình định mức dung tích 5 0 m l, thêm nước cất đến vạch mức và lắc kỹ. Cách xác định D ùng pipet hút lấy 2 5 m l dung dịch trong bình định m ức, ch o ''ào bình nón dung tích lOOml, thêm vào đó 5m l nước cất. Cho tiếp vào bình nón lOml HCl đậm đặc và 3g kẽr.i. N hanh ch ón g đậy nút lại. Nút caosu có gắn ố n g thuỷ tinh chứa tấm g iấy tẩm ílg C li dung dịch 5% đã sấy khô và giấy tẩm axetat chì P b(C H ,C O O )2 dung dịch 3% (x e m hình 10.2.6). Đổ ch o asen phản ihig với hydro mới sinh trong đúng 30 phíil (kể từ khi đậy nút). Trong quá trình này g iấ y tẩm HgCls sẽ c ó mầu nâu nếu mẫu c ó asen. Sau dó m ờ nút ra kliòi bình nón, lấy g iấ y m àu đem so màu với g iấy tẩm H gC l2 tiêu chuẩn, nếu màu của giấy làm mẫu và của g iấ y tiêu chuẩn trùng nhau. Chuẩn oị giấ y tẩm H gC l2 tiêu chuẩn: Càn chính xác l,3 2 g trioxyt (AS2O ,) tinh khiết loại I, ch o vào bình định mức dung tích lOOOml. T hêm vào bình định mức lOml axit sunfuric đậm đặc (d = 1 ,8 4 ), thêm nước cất đến vạch mức lấc kỹ. 259 Dùng pipet hút lOml dung dịch đã pha ở trên, cho vào bình định mức dung tích lOOOml khác, thêm nước cất đến vạch mức rồi lắc kỹ. Iml dung dịch này chứa 1 0 |.ig asen. Lần lượt cho vào 10 bình nón dung tích lOOml: bình thứ nhất 4m l dung dịch trên ứng với 40 |.ig asen, bình thứ 2-6ml ímg với 60 ng asen, bình thứ 3-8m l ứng với 80 |.ig asen ....bình thứ i0-20m l líiig với 200 |,ig asen. Sau đó thêm nước cất vào tìmg bình nón cho đủ 30ml và cho vào mỗi bình lOml axit clohydric đậm đặc (d =1,19), 3g kẽm. Đ ậy nút bình, nút có gắn ống thuỷ tinh chứa tấm giấy tẩm Pb(CH,COO). , rồi làm như cách làm ở mẫu thừ. Sau đúng 30phút, các tấm giấy HgCl2 hiện màu đầy đủ. Tháo nút, lấy các tấm giấy ra, ghi lượng asen ứng với mỗi giấy lên từng giấy, được dãy màu tiêu chuẩn. Tùy lượng asen tăng dần mà các tấm giấy khi đó có cường độ màu tăng dần (từ vàng đen nâu và nâu đậm) và chiều dài đoạn màu tăng dần từ 0,5-5cm . c. Tính kết quả Giả sử tấm giấy màu thu được khi thí nghiệm với mẫu thử có màu (và chiều dài đoạn màu) trùng với màu tấm giấy ghi lượng 60 |ig asen của dãy tiêu chuẩn thì lượng asen có trong mẫu thử là 60 |ag. Nếu tấm giấy màu thu được khi thí nghiệm với mẫu thử có màu (và chiểu dài đoạn màu) nằm trung gian giữa màu (và chiều dài đoạn màu) của hai tấm giấy ghi lượng 50 và 60 |.ig của giãy giấy tiêu chuẩn thì lượng As có trong mẫu thử là 55 ng. Từ đó tính ra lượng asen có trong một lít hoặc Ikg sản phẩm lương thực thực phẩm... 260 Hình 10.2.6. Dụng cụ để xác định asen: 1 . bình nón ; 2 . nút caosu ; 3. ống thuỷ tinh ; 4. tấm giấy tẩm HgCl 2 ; 5. lỗ; 6 . tấm giấy tẩm Pb(CH,C 0 0 )2 . G hi chú - Khi đốt mẫu lương thực thực phẩm asen ở dạng kim loại hoặc oxyt đều được chuyển sang dạng ion As'*: 6 A s + lOHNO, = 3 A s A + lONO + SHÔ AS2O, + 3H2O 2 2 H ,A sơ 4 H ,A s ơ 4 + 2M gO = 2M gH AsO , + 2 H 2 O - Khi kẽm gặp dãy HCl sẽ có phản ứng Zn + 2IICl = ZnCl2 + 2H Hydro này tác dụng với các muối asẹn tao thành asen hydrua: H,AsO- + 8 H = A sH , + 4 H 2 O và A sH , phản ứng với HgCls: A sH , + HgCl^ = Hg,,As.3 HgCl2 màu nâu - Đáy ia phương pháp xác định lượng nhỏ Asen và vì A sH , là chất dễ bay hơi nên dụng cụ để xác định asen phải thật kín, nếu không sẽ làm giảm kết quả phân tích. Nút caosu không đậy kín bình nón thì phải trát một lớp parafin. 261 B à i 7. X ác đ ịn h J ĩo bằng phư ơng pháp th o rin itra t a. Nguyên lắc Dùng canxi hydroxit chuyên flo sang dạng canxi Aorua (Caĩ-^) rồi cất lấy flo dưới dạng axi> riosilisic (HịSìPs). Chuẩn độ axit này bằng thoriiiitrat (T h(N 0 ,) 4 ). b. D ụ n " cự , Itoá cliấl - Pipet, buret, capxun, bếp cách cát, lò nung; - Máy cất lôi quấn bằng hơi nước (hình 10.2.7); - Canxi hydroxyt rắn Ca(0 H) 2 : - Natri hydroxyl dung dịch 0,1N; - Axit clohydric dung dịch 0,1N; - Silic oxit bột (SÌO 2 ); - Axit photphoric đậm đặc (d =1,69); - Thori nitrat dung dịch 0,00 IM: Cân chính xác 0,13805gam T h(N 0 ,) 4 .4 H 2 0 hoà tan với nước cất tạo thành lOOml, trong bình định mức dung tích 1000 ml; - Dung dịch đệm: 200m l axit cloaxetic IM, trung hoà bằng NaOH 0,1N rồi thêm vào 225m l axit cloaxetic, thêm nước cất thành 1000 ml; - Chi thị (a): Hoà tan 0 ,1 25g natri alizarin suníonat lOOml nước câì khi dùng pha loãng 5 lán; - Chỉ thị (b): Hoà tan 0,01g metylen xanh trong lOOml nước câì, khi dùng pha loãng 5 lần. c. Cách tiến lià iilì Dung pipel híit lấy lOOml, nếu là sản phẩm lỏng (hoặc cân lOOg nếu là sản phẩm khô) cho vào capxiin dung tích 250m l. Thêm vào capxiin 2g canxi hydroxit, khuấy đều. Đặt lên bếp cách cát, đun dến khô. Đưa capxiin vào lò nung, nung ở nhiệt độ 400-500'’C để đốt hết các hợp chất hữu cơ thành thành tro trắng. Lấy capxun ra để nguội. Chuyển tất cả tro từ capxun vào bầu cất (2) của máy cất lôi quấn hơi nước (hình 10.2.7). Rửa capxun bằng 25ml nước cất nóng. Cho vào bầu 262 cất 3g silic oxyl (SÌO 2 ) và 25ml axii phoiplìoric dạm (tặc. Đun sồi irong bình ( ỉ ) rồi dun bầu cất (2) . Thu sản phẩm cất vào bình (4) có chứa sán 50m ỉ nirớc cất. Cất đến khi d u n g dịch tr o n g binh nón có thể lích được lOOnil thi ngìnig lại. Lấy bình nón ra, thêm vào bình nón Iml natrializarìn suiìíonat dung dịch 0.125 (đã pha loãng 5 lẩn). Trung hoà bằng dung dịch NaOH 0 , i N đến chuyển màu chí thị thành đỏ. Tiếp đó nhò vào bình nón Iml metylen xanh dung dịch 0,01% (đã pha loãng 5 lần) và 10 giọl dung dịch đệm. Kiểm tra pH bàng giấy thử pH. Nếu pH chưa đúng thì nhỏ Ihêm 1IC1 0, 1N hoặc NaOH 0,1N đế diéu chinh. Chuấn độ bàng thoriniirai 0,001 M đến kJii dung dịch chuyển từ màu xanh lá cây sang tím. Làm một mẫu trắng: Câì nước cất (không có mảii) tiến hành điều chinh và chuẩn độ như trên. cL T íiỉlì kểĩ quả Màm lượng flo (theo mg F/lít) tính bằng công thức 0,019.(a-b).1000 X — ---------------------------V trong đó: 0,019: lượng flo tính bằng mg, ứng với Inil thorinitrat dung dịch 0,01 N; a : thể tích Th(N 0 b : thể tích T 1 i(N 0 V : , ) 4 , ) 4 0,001 M đã dùng chuấn mầu Ihử, ml; 0 , 0 0 1 M dã dùng chuán mẫu trắng, ml ; thể tích mầu để lấy phân tích, ml. G hi chu 1. Dung dịch đệm axit cloaxetic pH = 3,5^3 , 8 tạo mòi trường i>xit thích hợp cho việc chuẩn độ hợp chất flo bằng ihorinitrat. 2. Cất lôi quấn có tác dụng tách biệt flo khỏi các chất cản trờ. Tuy vậy các BF, A sF ,, MiiF 4 cũng bay hơi khi cất. 3. Chỉ thị hổn hợp natri alizarin suníonat và metyleii xanh là nhạy nhất đối với ihorinitral. 263 H inh 10.2.7 Máỵ chưng cất lôi quấn hơi nước 10.3. XÁC ĐịNH KIM LOẠI NẶNG BẰNG p h ư ơ n g p h á p c ự c PHỔ Xác định kim loại nặng bằng phương pháp ditizon có nhược điểm là khi xác định, kim loại dễ bị cản trở bởi nhiều ion khác nên ảnh hưởng một phần đến độ chính xác của phép phân tích. Đ ối với những cơ sở có thể trang bị máy cực phổ, nên dùng phưcmg pháp cực phổ để xác định kim loại nặng. 10.3.1. KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP c ự c P H ổ Phương pháp cực phổ có thể định tính và định lượng nhiều ch ít bằng cách điện phân dung dịch phân tích trên điện cực giọt thuỷ ngân rồi sau đó vẽ đường biểu diễn dòng-thế, ghi sự biến đổi cườiig độ dòng theo sự biến dổi Ihế diện cực của sự thuỷ phân. 10.3.2. NGUYÊN TẮC - Đặt các thế khác nhau vào điện cực để khử các ion khác nhau vì mỗi ion có một thế khử tuơng ứng xác định. Do đó qua thế khử của ion có thể định tính được ion đó. 264 - Nếu tăng dần thế của điện cực nhúng vào dung dịch chất cần xác định thì cường độ dòng sẽ tăng đồng thời cho đến khi đại được ih ế khử của ion trong dung dịch. Trong các điều kiện nhất định, Cuờng độ dòng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ ion khử. Do phụ thuộc giữa cường độ dòng và nồng độ mà định lượng được ion đó. 10.3.3. CÁCH TIẾN HÀNH Dung dịch phân tích được nạp vào bình điện phân có điện cực thiiỷ ngân. Anot là lớp thuỷ ngân ở đáy bình (cOng có truờng hợp dùng anol là điện cực C a lo m el), catot là giọt thuỷ ngân rơi liên tục từ một mao quản. Đặt vào điện cực thế tăng dần sẽ tạo được dòng điện có cường độ tăng dần, cường độ này được điều chỉnh bằng một điện k ế sau đó sẽ thu được một đường phụ thuộc dòng-tliế (đường cong von-ampe). Dòng khuếch tán là dòng lạo được do sự khử của ion trên điện cực giọt thuỷ ngân. Dòng khuếch tán được tính theo công thức của Incovit: 1, = 605 . z . 0'^^. m '''. t''" . c trong đó; Ij: cường độ dòng khuếch tán; Z: hoá trị ion bị khử; D: hệ số khuếch tán, hoặc số phân tử gam ion khử, khuếch tán qua bề mặt 1 cm^ trong một đơn vị thời gian để cho gradien nồng độ bằng đơn vị; C: nồng độ ion khử, m ili-ion g//; m: khối lượng thuỷ ngân rơi khỏi mao quản, trong đơn vị thời gian, tính ra mg/giây; t: thời gian giọt thuỷ ngân rơi khỏi mao quản, giây. Trong thực tế, khó xác định được hệ số khuếch tán D, nên người ta đo song song dung dịch chất tiêu chuẩn và chất phân tích, rồi thiết lập đường cong vonampe của cả 2 dung dịch và tính nồng độ (X) chất cần phân tích theo côn g thức : 265 troim đó: a: khối lượng châì trong dung dịch tièu chuẩn ; h, và Iv-: chiều cao sóng của dung dịch phân tích và dung dịch tiêu chuẩn. Phương pháp cực phổ khòng chỉ xác định được các cation, nó có ihể xác định dược các anion và phân tử có khả năng khử trên điện cực giọi tỉuiỷ ngân. Trong phân tích thực phẩm, phương pháp cực phổ dùng dế xác định các kim loại nặng, muối ăn, đườag frucíoza, saccaroza, các viiamin c , B| xác định hoạt tính các men và các chất độc hiìii cơ khác. 10.3.4. CHUẨN BỊ DUNG DỊCH XÁC ĐỊNH Cân 10-50g sản phẩm (hoặc nguyên liệu) vào bát sứ rồi đem sấy khô (với đồ h ộ p hoặc n g u v ê n liệ u rắ n ), v ớ i đ ồ h ộ p lỏ n g hoặc rau quả n h iề u n irớ c th ì d e m cô trên n ổ i cá ch t h iiỷ đến cạn k h ô , sau đ ó cho th ê m vào b ál sứ 10-12 g iọ t a x it su n ĨL iric đậm đặc (d =1,19) và cô tiếp đến khô trên nồi cách tliuỷ. Cặn trong bát được hoà lan bàng axil clohydric loãng (1/1), đun nhẹ irong nổi cách llìuỷ, chuyến tất cả vào bình định mức dung tích 50m l (dung dịch chì chiếm nửa thể lích ciia bình). Trung hoà axit bang am oniac đạc cho đến dư am oniac, thêm nirớc cất đến \'ạch mức lác kỹ rồi lọc. Giữ lấy kết tủa của chì và ihiếc trẽn giấy lọc. Nước lọc 1 dùng để xác định đồng. Kết tủa Irên giấy lọc dược hoà lan bằng lOml axil clohydric (1/1) nóng, thêm vào 2-4g axil lactric, inộl lượng natri sunfit và đun irên nồi cách ihuỷ cho bốc hêì SO 2 đi. Sau khi làm lạnh, dimg dịch được chuyển vào bình địnlì mức dung lích 50 m l, trung hoà axil dir bàng amoniac đặm đặc dến dư, thêm nước cất đến vạch mức, lấc kỹ rồi lọc. Nước lọc II dùng để xác định chì. Kc'l tủa hycỉroxit thiếc được hoà tan trong HCl (1/1) trong bình định mức 50ml thcm 0 , l g canxi hypophotphit (CaH 2 P 0 2 ) thêm axit clohydric (1/10 đôn vạch. Lọc dung dịch này, nước lọc III dỉing xác định lliiêc. 266 G hi chú: Phưưng pháp cực phổ có ưu điếm: - Độ nhạy cao: Có thế xác định chất có nồng độ 10' - 10 '’ phân tir gam/lít - Có iliể đồng thời xác định nhiều chất mà k h ô n g phui tách biệt chúng - Nhanh, chi tốn vài phút để xác định nồng độ chát trong dung dịch Các m áy cực phó có thế dùng: LP.55A; Lí^.60; E 'L .l... B à i 8. X á c d ịìih thiế c a. D ụ iìí’ cụ, lioủ chút - Máy cực phổ - Dung dịch nền: HCl (1/1) - Dung dịch gelatin 1 % - Dung dịch thiếc tiêu chuẩn: hoà tan 25mg thiếc kim loại linh kniết trong 25 ml axit clohydric đậm đặc, đun nóng cho tan hết, cho dung dịch vào bình định mức đun tích 25m l, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ. khi dùng pha loãng 10 lần (0,1 mg / ml ) b. C úcli tiến hành Hút 20m l nước lọc 111 cho vào cốc thuỷ tinh, ihêm 5ml HCl (1/1), 10 giọt gelatin dung dịch 1%, khuấy kỹ, cho toàn bộ vào bình điện phân và làm cực phổ. Đặt độ nhạy điện kế 1/100. Sóng khử của thiếc nằm trong khoảng 0,2-0,6 V. Làm cực phổ dung dịch thiếc liêu chuấn: L ấ y 2 0 m l dung dịch tiêu chuẩn (2,0m g) 5ml HCl (1/1), 10 giọt gelatin và làm cực phổ trong điểu kiện giống như trên. c. Tính kết c/itcỉ Theo chiều cao cCia sóng vẽ trên giấy kẻ ô vuông, cạnh Irnm, thể lích các dung dịch và nồng độ dung dịch chuẩn. Tính hàm lưOTig thiếc (X), thành mg trong Ikg sản phám theo công thức: ^ C,.V,.H,.V„.1000 H. V. . G 267 trong đó: Q., : nồng độ dung dịch tiêu chuẩn lấy làm cực phổ, mg/ml; v „ .: thể tích dung dịch tiêu chiián lấy làm cực phổ, ml; H| : chiều cao sóng cực phổ mảii thử, mm; H 2 : chiều cao sóng cực phổ dung dịch tiêu chuẩn, mm; v „ : thể tích toàn bộ nước lọc 111, m l ; V| : thể tích dung dịch thử lấy làm mẫu thử, ml; G : lượng cân mẫu thử, g. V í dụ tính toán Trong cách tiến hành trên, ta cân 50g mẫu (G), thu được 50m l dịch lọc III (V„), lấy 20m' làm cực phổ (V |), được sóng cao 9mm. Lấy 20m l dung dịch tiêu chuẩn (V |J có nồng độ 0,1 m g/m l (C|Jlàm cực phổ được sóng cao 20m m (H 2 ). 0,1 .2 0 .9 .5 0 .1 0 0 0 ,, X = .. .........= 4 5 0 0 m g / k g 2 0 .2 0 .5 0 B à i 9. X ác đ ịn h c h i a. Dụiiy, cụ lioá chất - Máy cực phổ - Dung dịch gelatin 1% - Dung dịch chì tiêu chuẩn: Hoà tan 0 ,3996g chì nitrat trong nước cất và Iml axit nitric đặc trong bình định mức dung tích 250m l. Khi dùng pha loãng 10 lần để Iml chứa o . l g chì. b. Câch tiến hành Dùng pipet hút 20m l nước lọc II, thêm 3ml nước cất, cho vào một cốc, thêm 8-10 giọt gelatin dung dịch 1%, khuấy kỹ. Chuyển toàn bộ vào bình định phân của máy cực phổ ở 2 thế 2 V và đặt độ nhạy điện k ế 1/10-1/25. 268 Sau đó lại hút 20m l nước lọc II, thêm vào Iml dung dịch chì tiêu chuẩn (0,1 mg chì trong Iml), 4m l nước cất và 8-10 giọl gelatin dung dịch 1% khuấy kỹ cho vào bình điện phân. Làm cực phổ như trên. c. Tíỉìlì kết quả Hàm luợng chì, tính thành mg trong Ikg sản phẩm được tính theo công thức C,.V,.H,.V„.1000 ( H , v , - H , v , ).V,.G trong đó; Q .,: nồng độ dung dịch tiêu chuẩn ( 0 , 1 mg/ml); v„. : thể tích dung dịch tiêu chuẩn thêm vào, ml; H, : chiều cao sóng cực phổ dung dịch mẫu thử, mm; V| : thể tích dung dịch thử lấy làm cực phổ, ml; V(,: thê tích toàn bộ nước lọc II, ml; H2 : chtóu cao sóng cực phổ dung dịch mầu và chì tiêu chuẩn, mm; V 2 : thể tích dung dịch mẫu và chì tiêu chuẩn, ml; G : lượng cân mẫu, g. G hi chú I. Phương pháp thêm dung dịch chuẩn vào dung dịch mẫu thứ để làm cực phổ ở đây gọi là "phương pháp thêm". Phương pháp này có ưu điểm là khắc phục được những knác nhau về lượng và chất lạ có trong dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn, nên độ chính xác cao hcfn. 2. Khi xác định thiếc cũng có thể dùng phương pháp thêm này tính kết quả theo công thức ở phần thêm ( 2 ) B à i 10. X ác đ ịn h đổng a. D ụng cụ ÌÌO Ú clìất - M áy cực phổ; 269 - Dung dịch n ề n : h o à lan 0 , 8 g am oni clorua v à lO m l a m o n ia c đ ậ m đ ặ c ; - Dung dịch gelatin ỉ% : - Nalri sunfit khan; - Dung dịch đồng tiêu cỉiLián: hoà tan 3,9283g dồng suníat tin h thể (Q1SO4.5H2O) trong 1 lít nước cất, Iml dung dịch này chứa Img đổng. Khi dùng pha loãng 10 lần đế c ó 0,1 m g đồng trong Iml. h. Cíicìì ĩiếìi liànlì Dùng pipet hút lấy 20ml nước lọc I, thêm vào 5ml dung dịch nén vào 1 cốc, thêm vào một liiợng nalri sufit (N a2S0 j và 10 g iọ l gelatin dung dịch 1% khuấy kỹ. C huyển loàn bộ vào bình điện phân. Làm cực phổ với thế 2 von và đặt độ nhạy điện k ế 1 /1 0 0 -1 /4 0 0 . Sau đó cũng lấy 20inl nước lọc I, thêm Im l dung dịch đ ồn g tiêu chuẩn , 4m l dung dịch nền, m ột lượng natrisunfit và 10 g iọ l g ela lin , -làm cực phổ như trên. r . Túìlỉ kết qu ả H àm lượng đ ổ n g , m g /lk g sản phẩm tính tư ơ n g tự n h ư c ô n g thức (2), 270 Chương 11 TỒN Dư VÀ NHIỄM TẠP ĐỘC TÔ ■ ■ n . l. G I Ó I THIỆU V ệ sinh an toàn thực phẩm đang tạo nhiều lo lắng ch o người dân. Thực tế, việc sử dụng những hoá chất cấm dùng trong nuôi trồng, c h ế biến nông thủy sản, thực phẩm, việc sản xuất m ột sô' sản phẩm kém chất lượng hoặc do quy trình c h ế biến hoặc do nhiễm độc từ m ôi trường, đang gây ành hirởng xấu đến xuất khẩu và tiêu dùng. Các vụ ngộ độc thực phẩm do một số bếp ãn tập thể cung cấp, nhiều thông tin liên tục về tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm ở một vài nước trên thế g iớ i, cộn g thêm dịch cúm gia cầm, bệnh lợn tai xanh càng làm bùng lên sự lo âu của m ọi người. Vấn đề then chốt là làm thế nào quản lý được lốt chất lượng nống thủy sản thực phẩm V iệt N am không nhiẻm vi sinh, không chứa hóa chất bị cấm , hóa chất ngoài danh m ục ch o phép, hay bị nhiềm hóa chất quá giới hạn ch o phép nhằm nâng cao năng lực cạnh tranh doanh nghiệp, bảo đảm an toàn ch o người tiêu dùng, đóng góp dược phần quan trọng vào phái Iriển kinh lế-xả hội của dấl nước. n .2 . Dư LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 11.2.1. GIỚI THIỆU Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) còn gọi là thuốc trừ dịch hại (thuốc trừ sâu) hoặc sản phẩm nôn g dược, bao gồm những c h ế phẩm dùng để phòng trừ các vi sinh 271 vậi gây hại tài nguyên thực vật, các ch ế phẩm có tác dụng điều hòa sinh trưởng thực vật, các c h ế phẩm có tác dụng xua đuổi hoặc ihu hút các loại sinh vật gây hại tài nguyên thực vật đến để tiêu diệl. Dựa vào đặc tính tiêu diệt dịch hại, thuốc BVTV có thể chia thành; T huốc trừ sâu: là những thuốc phòng trừ các loại côn trùng gây hại cây trồng, nông sản, gia súc, con người; Thuốc trừ bệnh: là những thuốc phòng trừ các loại vi sinh vật gây bệnh ch o cây (nấm , vi khuẩn, tuyến trùng); Thuốc trừ cỏ: là thuốc phòng trừ các loại thực vật, rong, tảo m ọc lẫn với cây trồng, cản trở sự sinh trưởng của cây trồng; Các loại thuốc diệt chuột, nhện, ốc sên ...rất độc hại đối với người; Th.uốc điểu tiết sinh trưởng cây trồng: còn gọi là thuốc kích thích sinh trưởng. Tồn dư cùa chúng có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con ngirời. 11.2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp chính thức xác định dư lượng thuốc BVTV phải đảm bảo cho phép định lượng toàn bộ dư lượng thuốc có trong dịch chiết của m ẫu. Số lần chiết thường phụ thuộc vào khả năng chiết của dung m ôi được dùng. Phần lớn thuốc BVTV đều tan trong các dung môi hữu cơ và độ hòa tan của chúng có thể khác nhau trong các trường hợp. Hơn nữa nhiều chất trong đó lại tan trong nước và không được chiết bằng dung m ôi hữu cơ. Thêm vào đó dư lượng thuốc B V T V trong mẫu lại thường rất nhỏ c ỡ ppm thậm chí ppb, đòi hỏi phương pháp xác định cần có độ chính xác cao. Đ ường hirớng chung của các phương pháp xác định gồ m hai bước: Tách chiết, tinh sạch và cô đặc dịch chiết; Tách phân đoạn và xác định các loại thuốc BVTV. 11.2.2.1. Tách chiết và làm sạch Các phương pháp được dùng không làm hư hỏng cấu trúc của chất cần phân tích và phải tránh: nhiệl độ cao quá, môi trường axit hoặc bazơ mạnh. Quá trình chiết tuân theo các nguyên tắc chung phù hợp với sản phẩm n gh èo hoặc giàu chất béo. 272 a. Chiết bằng dung m ôi liCúi c ơ - Mải' ít chất béo (rau, hoa quả...). Các dung môi thường dùng: A xeton tiếp theo là C H 2CI2; Hỗn hợp A xeton/H exan; Axetonitril tiếp theo Ete petrol; A xetonitril tiếp theo CHCl,; Izopropanol tiếp theo Ete petrol; Izopropanol tiếp ìh eo Benzen; CH 2CI2; Hỗn hợp Ete etylic/E te petrol (1 /1 V). - Mẫu nhiều chất béo. Cơ sở phương pháp dựa trên tính tan trong chất béo của các h óa chất BV TV cho phép chiết đồng thời chất béo và chất BVTV bằng dung m ôi hữii cơ. b. Cliiêì bằng chưng cất citốn theo hơi nước Thiết bi chư ng cất gồm 1 bình cầu chứa mẫu, trên đó lắp hệ thống phân tách hỗn hợp chưng cất thu được, thiết bị này hay đirợc dùng trong chưng cất tinh dầu (bộ chưng cất Dean-Stark). c. Phương p lìá p “H e a d sp a c e ” Mầu (gạo hoặc bột m ì) đirợc đặt trong thiết bị ổn nhiệt 70"C trong 30 phút. T iến hành phùn tích pha hơi thu được bằng sắc ký khí. Phircíng pháp “H eadspace” đcfn giản hơn nhiều so với phương pháp chiết, nó cho phép phát hiện chất ở nồng độ tương đối thấp, ví dụ Etylendibrom ide được phát hiện với nồng độ 0 ,001m g/k g. 1 1 .2 .2 .2 . X á c đ ị n h d ư lư ợ n g t h u ố c B V T V a. Phương p h á p h óa sinh - Phương p h á p eitzỵni C holinesteraza (ChE) là enzym thủy phân các E steaxyl của C holin, nó đóng vai trò quan trọng trong hoạt động thông tin giữa các tế bào trong cơ thể sống, đặc biệt là các tế bào của hệ thần kinh. ChE bị kìm hãm bởi các nhóm thuốc Lân hĩai cơ và Carbamat, nhờ đó người ta đã xây dựng các phương pháp xác định dư lượng thuốc BVTV trong thực phẩm với độ nhạy từ / / g-ng. Phương pháp dựa trên cơ sở ức c h ế đặc hiệu giữa nhóm Lân hữu cơ hoặc Carbamat với ChE. X ác định sự giảm hoạt độ của ChE (% ức chế) khi c ó mặt của chất độc từ đó c ó thể tính được hàm lượng chất đ ộc c ó trong mẫu. 273 - Phương p h á p G T-test K it N guyên tắc của phương pháp dựa vào đặc tính ức c h ế axetylcholinesteraza của các loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm Phospho hữu cơ và Carbamat. Phần A xetylcholinesteraza tự do (không bị ức chế) sẽ thủy phân a x ety lch o lin tạo axit A xetic và cholin. Dựa vào phản ứng tạo màu giữa A x ety ch o lin còn thừa với thuốc thử GT ta xác định lượng thuốc BV TV trong rau quả. b. Phương p h á p siitlì ỈIỌC Đ ây là các phưcfng pháp được sử dụng để kiểm tra đ ộc tô' và côn trùng. Trong phần lớn trường hợp chúng được coi như các phép thử định tính. Các phương pháp này được sử dụng khá phổ biến. c. Phương p h á p hóa lý - Phương p lìá p cực p h ổ Đ ây là phưcmg pháp c ó độ nhạy cao. - Phương p h á p quang p h ổ Các phương pháp quang phổ hấp thụ IR, U V -V IS thường được sử dựng để nghiên cứu và định lượng các chất BV TV . N guyên tắc ch u n g của các phưcmg pháp quang phổ là chúng đòi hỏi mẫu c ó độ tinh sạch thích hợp. - Phương p h á p so màu C a sở của phưcmg pháp dựa vào phản ứng tạo phức m àu đặc trưng cho các chất BVTV. - Phương p h á p sắc ký: Các phưcmg pháp hay dùng: Sãc ký giấy, sá c ký bản m ỏ n g , Sắc ký khí (G C), Sắc ký lỏng hiệu năng cao (H PLC ), đây là phương pháp định lượng m ới, nó được ứng dụng cho nhiều loại hóa chất BV TV khác nhau. T rong sô' đó được dùng phổ biến hơn cả là GC - C á c phương p h á p khác Đ ây là các phương pháp dùng xác định các chất p olych lorob ip h en yl (PCB); Sắc ký khí/khối phổ (G C /M S), C ộng hưởng từ hạt nhân, Phương pháp m iễn dịch học (ELISA) dựa trên nguyên tắc phản ứng kháng ngu yên -kh áng thể. 274 11.2.3. THỰC HÀNH B à i 1. X á c d ịn h h à m lư ợ n g h ó a c h ấ t B V T V th u ộ c n h ó m lá n h ữ u c ơ ỉ . Ngiivê/I rắc Dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong mẫu được chiết bằng axeton. Sau khi được tách chiết, hoá chất bảo vệ thực vật photplio-nitơ hữu c ơ được xác định bằng sắc ký khí (GC) trực tiếp với detector FPD. 2. H ó a chất A xeton , diclom etan , ete petrol tinh khiết phân tích Natri suníat khan tinh khiết Chất chuẩn của nhóm chất BV TV nhóm photpho hữu cơ. 3. Thiết bị, dụ n g cụ: Cân phân tích d=10'^g; M áy nghiền mẫu; Cân kỹ thuật d = 10^ g; M áy cô quay chân không; Hệ thống sắc ký khí (GC) với Phễu chiết, detector FPD; 4. C ách tiến hành 4.1 . X ây dựng đường chuẩn a. Dung dịch chuẩn gốc 100 ppm. Cân 0 ,0 1 g chất chuấn ch o vào bình định mức lOOml, thêm //-hexan đến vạch m ức. b. Dung dịch chuẩn làm việc Hút 0,5; 1,0; 2 ,0 m l chuẩn gốc ở trên cho vào bình định mức lOml và pha loãng tới vạch bằng /ỉ-hexan được các nồng độ chuẩn tircnig ứng là 5; 10 và 2 0 ppm. Bơm vào m áy, th eo hướng dần của phần m ềm để lập đường chuẩn và xác định thời gian lưu, diện tích pic. 275 4.2. T iến hành chiết mẫu Mẩu được thái nhỏ và trộn đều cẩn thận. Cân chính xác lOOg m ẩu cho vào bình nón 2 50m l, thêm 200m l aceton nghiền đồng n h ít trong 1 phút. L ọc qua thiết bị lọc hút chân không, thu dịch chiết trong bình hút 5 0 0 m l. C ho 80m l dịch lọc mẫu vào phễu chiết llít, thêm lOOml ete petrol và lOOml diclom etan , lắc m ạnh trong 1 phút. Lớp hữu cơ bên trên của phễu chiết ban đầu được iàm khô bằng cách cho chạy qua phễu lọc đường kính lOcm có chứa natri siinfat khan bên trên g iấ y lọc, thu dịch lọc vào bình c ô quay. Rửa lớp natri sunfat bằng 5 0 m l diclom etan . Cô đặc và bay hơi chậm bằng m áy cô quay chân không à 45"c. K hi c ô đặc còn khoảng 2m l, thêm lOml axeton và lại cô đến còn khoảng 2m l. Lặp lại v iệc c ô đặc hai lần với lOml axeton. K hông c ô khô để tránh phân huỷ mẫu. 4.3. PhẠn tích hỗn hợp photpho hữu cơ và nitơ hữu cơ Hoà tan cặn dịch c ô đến lOml bằng axeton Bưm 1 Ị.1 1 dung dịch này vào m áy sắc ký khí, sử dụng detector FPD với các điều kiện sau: Cột SPB-5 (30m X 0,25m m X 0 ,2 5 /^ m ). N hiệt đ ộ cột: 50"c (1 phút), 250"c. C h ế độ bơm: K hông chia dòng, tốc độ Im l/ phút. N hiệt độ buồng bơm mẫu 250"c. Á p suất k h í m an g lOOkPa. tăng 20"c/phút “^120"c, tăng 50"c/phút 5. K ế t qu ả So sánh thời gian lưu của m ỗi đỉnh so với chất chuẩn để định tính. So sánh diện tích hoặc chiều cao của m ỗi pic với pic chuẩn để dịnh lượng Hàm lượng cùa từng loại hoa chất BVTV được tính theo cô n g thức: c,.v.s, “ í trong đó: Xị! hàm lượng hóa chất BV TV “i” c ó trong Ikg m ẫu (m g/kg); s,: diện tích pic tương ứng mẫu chất “i”; s,„; diện tích pic tương ứng mẫu chuẩn có chất “i” ; Q: hàm lượng chất “i” có trong Im l dung dịch chuẩn ( / / g/m l); V: thể tích dịch chiết mẫu cuối cùng (ml); m: khối lượng mẫu lấy phân tích (g). 276 n .3 . CHẤT KÍCH THÍCH TẢNG TRƯỎNG 11.3.1. GIỚI THIỆU C lenbuterol, Salbutam ol là một loại hoocrnôn tăng trirởng tổng hợp hóa học c ó tác dụng kích thích gia súc, gia cầm tăng càn nhanh. C lenbuterol, Salbutamol cũng là chất thuộc nhóm Ị3-agonist có tác dụng giãn phế quản, giiĩn cơ trơn ở cuống phổi, điều khiển các chất dinh dưỡng hướng tới m ô cơ, tăng sinh quá trình tổng hợp protein để tích lũy nạc và giảm tích lũy m ỡ trong cơ thể. 11.3.2. PHƯƠNG PHÁP PHẢN TÍCH Phân tích định tính: các mẫu thức ăn chăn nuôi được phân tích định tính chung cho các chất thuộc nhóm p-Agonist hoặc định lính riêng cho từng chất Clenbuterol, SiUbutamol nhằm loại bỏ những mẫu âm tính. Các mẫu c ó kết quả dương tính được tiếp tục phân tích định lượng. P h àn tích đ ịn h lượng: trước hết định lượng Clenbuterol, Salbutamol theo phương pháp sử dụng KIT- ELISA. Nếu mẫu thức ăn cho kết quả âm tính thì khẳng định là mầu thức ăn đó không chứa các hoạt chất trên. Trong trường hợp mẫu thức ăn cho kết quả difcfng tính với Clenbuterol, Salbutamol thì tiếp tục phân tích các chất này theo một trong các phưcmg pháp sau; Sắc ký khí/khối phó - GC/M S (Gas Chromatography / M ass Spectrometry); sắc ký khí / khối phổ / khối phổ -GC/M S/M S (G as Chromatography / M ass Spectrometry / Mass Spectromctry); sắ c ký lỏng / khối phổ - LC/M S (Liquid Chromatography / Mass Spectrometry); sắc ký lỏng / khối phổ / khối phổ - LC /M S/M S (Liquid Chromatography / M ass Spectrometry / Mass Spectrometry). Kết quả phân tích bàng một trong các phương pháp trên sẽ kliẳng định hàm lượng Clenbuterol, Salbutamol trong mẫu thức ãii chăn nuôi. 11.3.3. THỰC HÀNH B à i 2 . X á c đ ịn h h à m lư ợ n g C le n b u te r o l 1. N guyên tắc Thủy phân mẫu bằng HCl, tiến hành chiết Clenbuterol bằng ete etylic. C lenbuterol được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng ca o (HPLC) với detector U V -V IS hoặc P D A đo ở bước sóng 2 1 0 nm và 2 4 0 nm. 277 2. H ó a chất H óa chất sử dụng c ó độ tinh khiết phân tích (TKPT); dung m ôi là dung m ôi dùng ch o sắc ký; Chất chuẩn C lenbiiterol; HiPO^, dung dịch 17m M pH4; A cetonitril dùng ch o sắc ký; H C l, dung dịch IM; Ete etylic; N aO H , dung dịch lOM. 3. Tliiêt bị, dụng cụ H ệ thống sắc ký lỏn g (HPLC) với detector U V -V IS hoặc PDA; Cân phân tích d = 1 0 g; M áy lắc V ortex ; M áy nghiền mẫu; Bê'p cách thủy; M áy c ô quay chân không; Pipet Pasteur; M áy ly tâm; Phễu chiết. 4. C áciì tiến liànlì 4 .1 . X ây dựng đường chuẩn T iến h?nh pha m ột dãy dung dịch C lenbuterol chuẩn c ó nồn g độ ppm, và cho chạy HPLC với điều kiện đã được thiết lập, dựng đường chuẩn của C lenbuterol với nồng độ jU g/m l. 4 .2 . Chuẩn bị m ẫu Cân chính xác khoảng 5-lO g mẫu vào ố n g ly tâm 50m l, thêm 15m l HCl IM , lắc trên m áy V ortex 1 phút (riêng với mẫu thịt phải nghiền kỹ trước đó bằng m áy nghiền m ẫu). T hủy phân trong bếp cách thủy ở nhiệt độ 70"C trong 30 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Ly tâm 10 phút với tốc độ 6 0 0 0 vòng/phút, gạn lấy dịch phía trên, thêm vào lOml HCl IM , khuấy kỹ và tiến hành ly tâm như trên. G ộp dịch thu được vào m ột ốn g ly tâm khác, thêm lOml ete ety lic, ly tâm 10 phút với tốc độ 6 0 0 0 vòng/phút, dùng pipet Pasteur hút bỏ lớp ete phía trên. Lặp lại quá trình chiết trên hai lần, m ỗi 'ần lOml ete. Chỉnh pH về đúng 11.6 bằng dung dịch N aO H lOM. Bổ sung 5m l ete vào ống ly tâm , ly tâm 10 phút tốc độ 6 0 0 0 vòng/phút, chuyển lớp ete vào bình cất quay. Lặp lại quá trình ch iết như trên hai lần, m ỗi lần 278 5m l ete. G ộp tất cả dịch chiết ete vào bình cất quay. Cất quay chân không ở 4 0 ‘’C đến cạn, hào cặn bằng 2m l pha độn g sắc ký và bơm vào HPLC. 4.3 . Chạy sắc ký Bơm 2 0 fẨ 1 mẫu chuẩn bị ở trên vào HPLC với điều kiện sau: Cột C 18 (1 5 0 m m X 4,6m m X 5|am ). N hiệt độ cộ t 40'’C. D etector U V -V IS hoặc PDA đo ở bước sóng 210nm và 240nm . Pha động: H3PO4 17m M pH 4/A xetonitril (9 0 /1 0 , v/v) với c h ế độ đẳng dòng. T ốc đ ộ dòng: Im l/phút. 5. K ế t qu ả Hàm lượng C lenbuterol trong mẫu (m g/lO O g) được tính như sau: ^ c„,v.k lO.m trong đó; c „ : nồn g độ C lenbuterol của dịch chiết tính theo đường chuẩn ( ụ g/m l); V; thể tích dịch chiết cu ối chạy m áy, ml; m: khối lượng mẫu phân tích, g; k: hệ s ố pha loãng (nếu có ). 11.4. CHẤT KHÁNG SINH 11.4.1. GIỚI THIỆU Chất kháng sinh là nhữiig chất c ó nguồn g ố c tự nh iên , bán tổng hợp hoặc tổng hợp c ó óặc tính kháng khuẩn. Sự c ó mặt của chúng trong thực phẩm chủ yếu do hai con đường: hoặc do quá trình điểu trị bệnh các g iố n g vật nuôi hoặc do nguồn thức ăn gia súc c ó bổ sung chất kháng sinh. Sự c ó mặt của chất kháng sinh trong thực phẩm c ó thể gây ra các tác đ ộn g không c ó lợi ch o sức khỏe con người hoặc có thể tác đ ộn g đến c h ế độ công nghệ. Ả nh hưởng đến sức kh ỏe con người: có thể gây ra các hậu quả không c ó lợi: gây dị ứng, tạo chủng vi sin h vật c ó khả năng kháng kháng sin h , tạo ra sự mất cân bằng trong quá trình tiêu hóa thức ăn (n guồn g ố c thực 279 vật). Ảnh hưởng đến côn g nghệ: sự có mặt của chất kháng sinh trong sữa và thịt có thể gây các tác động không c ó lợi cho quá trình sản xuất phom át và c h ế biến thịt. Các phương pháp xác định chất kháng sinh hay dùng c ó thể xếp thành ba nhóm: phương pháp vi sinh, phương pháp điện di, phưcrng pháp hóa-lý 11.4.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1 L 4 2 . L P h ư ơ n g p h á p vi s in h Là nhóiĩi phương pháp được dùng phổ biến nhấl d o c ó độ nhạy cao trong phát hiện chất kháng sinh. Cơ sở lý thuyết của phương pháp là dựa vào sự kìm hãm phát triển các vi khuẩn của chất kháng sinh trong m ôi trường lỏng hoặc rắn. a. C á c phương p h á p trong m ô i trường lỏng Đ ảy là kỹ thuật được sử dụng nhiều trong xác định các chất kháng sinh trong sữa. Mẫu sau khi thanh trùng sẽ được cấy các chủng vi khuẩn nhạy với chất kháng sinh (như Bacilliis, Sĩreptocociis.,.). Sau thời gian nuôi cấ y , nếu nhir có tạo ra axit lactic thì đó là bằng chứng ch o việc không có mạt chất kháng sinh hoặc c ó ở một giới hạn xác định. V iệc xác định có thể được tiến hành bằng cách đo pH hoặc đông tụ sữa. Sự lăng tế bào vi khuẩn có Ihể được xác định bằng “néph élom étrie” (đ o độ đục) b. C á c phương p h á p trong m ô i trường thạch Các chất kháng sinh ở dạng dung dịch khi tiếp xúc với m ôi trườiig thạch sẽ lan tỏa trong đó. Sự lan tỏa tuân theo hàm logarit của nồn g độ kháng sinh. Sự phát triển của vi sinh vật trong m ôi trường thạch sau thời gian nuồi cấy ch o phép xác định sự có mặt của chất kháng sinh. c. C á c phương p h á p khác - Sự thay đổi hình thái học: V i sinh vật sau khi nhuộm m àu xanh m ethylen có thể sẽ thay đổi về hình thái học khi có m ặt chất kháng sinh, điều này thấy rõ ở m ột vài chùng vi sinh vật. - Phưcmg pháp K osikow ski: các đĩa giấy lọc được tẩm các bào tử Bacillus subtilis, 280 m ôi trường dinh dưỡiig và CTT (Chlorure de iriphényltétrazoliuni) và được làm đóng khô. T iếp theo tẩm thêm 1 ml sữa. Sự thay đổi màu của đĩa giấy phụ thuộc sự táng hoặc không tăng số bào tử, điều đó ch o biết sự có mặt hay không có mật của chất kháng sinh. 1 1 .4 .2 .2 . P h ư ơ n g p h á p đ iệ n d i Mẫu được đưa vào các lỗ đục trên mặt thạch. Sau khi tiến hành điện di trẽn tấm thạch các chất kháng sinh sẽ được phân tách và nhờ đó định tính dược, ngoài ra còn loại trừ được ảnh hưởng của các chất khác. Tấm thạch thứ hai được cấy một hay nhiều chủng vi sinh vật khác nhau tùy từng loại kháng sinh. Sau khi nuôi cấy tiến hành đo đường kính kháng khuẩn từ đó có thể định lượng được loại kháng sinh có trong mẫu. Phương pháp này c ó các ưu điểm: Loại trừ được ảnh hưởng của các chất khác; X ác định đirợc các loại chất kháng sinh; Đ ịnh lượng kháng sinh. 1 1 .4 .2 .3 . P h ư ơ n g p h á p h ó a - lý - Plỉif 7iig p h á p p h ó n g xạ-enzym Dựa trên phản ứng sinh hóa giữa phân tử chất kháng sinh và m ột coĩacter có gắn đồng vị c 14. Quá trình định lượng được tiến hành trong 10-15 phút, giới hạn phát hiện đạt 0 ,0 5 U I/m l đối với penicillin (Charm test). - Phương p h á p p h ó n g xạ-miễn nhiễm N hiều cô n g ty đã sản xuất “Kit” có gắn dồng vị I 125 ch o phép xác định nhiều kháng thể và chất kháng sinh. M ặc dù độ nhạy về mặt lý thuyết cao, nhưng Ihực tế kỹ thuật này kh ông ch o phép đạt được giới hạn phát hiện thấp hơn 1 / / g/m l (đối với sữa). - Pìutơng p h á p miểiì nliiễni-eiìzỵm Cơ sở phương pháp dựa trôn việc đo sự thay đổi hoạt độ của một enzym dưới ảnh hưởng của m ột kháng thể thích hợp. Phương pháp này có thuận lợi là không phải sử dụng chất đồn g vị phóng xạ và có độ nhạy gần với các phương pháp hiện hành. Phương pháp còn có tên “E nzym e m ultiplied, im m uno assay technique” EM IT. 281 - Phương p h á p huỳnh quang Phương pháp dựa trên việc gắn chất phát quang lên phân tỉr chất kháng sinh và tiến hành đo bởi m áy huỳnh quang dùng ánh sáng phân cực hoặc k h ôn g phân cực. Phương pháp này dùng xác định tetracyclin, sau khi đun nóng trong môi trường trung tính hoặc kiềm tạo thành phức chất phát quang. G iới hạn phát hiện của phương pháp 2 ụ g/g. - Phương p h á p quang sinh học ATP tạo ra bởi vi khuẩn được chuyển thành A D P dưới tác dụng của enzym Luciferaza, kèm theo đó là quá trình phát quang và được đo bằng trắc quang kế. - Phương p h á p quang p h ổ D ùng thiết bị quang phổ U V -V is và IR cho phép xác định và định lượng penicillin (giới hạn phát hiện 1 0 / / g/g), streptom ycin, tetracyclin... - Phương p h á p sắ c ký Sắc ký lớp m ỏng; dùng xác định dư lượng kháng sinh trong sữa. Đ ịnh lirợng có thể dùng phương pháp huỳnh quang. G iới hạn phát hiện của phương pháp: T etracyclin 0 ,0 2 5 / / g/m l; Chloram phenicol 1 / / g/m l; N e o m y cin 15 //g /m l; Streptom ycin 0 ,5 / / g/m l. s ắ c ký khí: áp dụng trong sữa. G iới hạn phát hiện: Tetracyclin 0.5 - 10 / / g/m l; Chloram phenicol 0,01 / / g/m l; P en icillin 0 ,0 0 5 U l/m l. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (H PLC) đây là phương pháp hiện nay được dùng rất phổ biến để định tính và định lượng chất kháng sinh. 11.4.3. TH ựC HÀNH B à i 3 . X á c đ ịn h d ư lư ợ n g S tr e p to m y c in I. N guyên tắc Thuỷ phân streptom ycin bằng kiềm ch o m altol là m ethyl-3-h yd.'oxy-7p yron . Sự tạo thành m altol xảy ra hoàn toàn cho phép xác định được streptom ycin. M altol sinh ra được tách khỏi hỗn hợp thuỷ phân bằng cách dùng clo ro ío o c để chiết khỏi dung d ịch mẫu trong m ôi trường axit,saii đó g iả i chiết m altol bằng dung dịch kiềm trong nước. Cho maltol tác dụng với phèn sắt (III) am onium , dung 282 dịch 2% sẽ sinh ra phức màu đỏ tía dặc irưng và đo mật độ CỊuang của phức này ở sóng 525 nm để xác định streptom ycin. Nồng độ của sireptom ycin được xác định theo phương pháp đường chuẩn. 2. H ó a chất Dùng hoá chất c ó độ tinh khiết phân tích; 'rhuốc thử: phèn sắt (III) am onium , dung dịch 2% trong axit siiníuric IN; Dung dịch gốc tiêu chiiấn streptomycin siiníat nồng A xit cloh yd ric, dung dịch IM; CIorofooc; Natri hydroxyt, dung dịch IN; Nước cất 2 lần. độ 1 m g/m l; 3. D ụ n g cụ, thiết bị M áy trắc quang U V -V IS ; Bình định mức các loại; Cuvét thuỷ tinh c ó chiều dày 2 cm ; Pipet các loại; M áy xay sinh tố ; Phều chiết cỡ 2 5 0 ml; M áy ly tâm ; Một số dụng cụ khác. 4. C á ch tiến hành 4.1. Chuẩn bị mẫu phân tích Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghién mịn, trộn đều và cân m ột lượiig a = 2 0 g ch o vào m áy xay sinh tố. Thêm 10 ml nước cất và ch o m áy chạy trong 5 phút. Cho 5 ml axit clohydric IM vào và định mức đến 50 ml bằng nước cất. Đun trong bếp cách thuỷ sôi trong 10 phút. Đ ể nguội, ly tâm lắng cạn, lấy dung dịch nước trong ch o vào phễu chiết, thêm 10 ml cloroíooc, lác trong 10 phút sau đó để yên trong 15 phút ch o phân lớp hoàn toàn trong phễu chiết rồi tách lấy tướng hữu cơ ch o vào phễu chiết khác, thêm 2 ml natri hydroxyt IN và 4 ml thuốc thử phèn sắt (III) am oni 2% trong axit và nước cất đến 20 ml. Lắc mạnh trong 30 phút, sau đó để yên trong 2 0 phút rồi tách lấy phần dung dịch nước. D ung dịch này dùng để đo mất độ quang, xác định streptom ycin ở birớc sóng 525 nm. 4 .2 . Pha dãy chuẩn Dùng dung dịch g ố c chuẩn của streptomycin suníat nồng độ 1 m g/m l, tính toán lượng phù hợp để pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1 - 0,5 - 1,0 - 1,5 - 283 2,0 - 2,5 / / g/m l trong các bình định mức có thể tích 2 0 ml sau đó thuỷ phân bằng kiềm , đun cách thuỷ ch o sôi 10 phút, để nguội rồi ch o 2 ml thuốc thử phèn sắt (III) am oni 2%, định mức bầng nước cất đến 2 0 ml rồi để sau 2 0 phút m ới tiến hành đo. Mẫu trắng: mẫu trắng phải được chuẩn bị cùng một điểu kiện như mẫu phân tích nhưng thay mẫu phân tích trên bằng nước cất sao cho c ó cùng thể tích. 4.3. Tiến hành thử Đặt sóng đo và bật cho m áy chạy ổn định (5 phút). Đ o mật độ quang của mẫu chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 525 nm bằng cuvét c ó chiều dày 2 cm . D ùng mẫu trắng ở kênh so sánh làm mẫu so sánh và đo m ỏi m ẫu 3 lần. Lập đồ thị đường chuẩn theo hệ toạ độ D-C. Trong đó D là mật độ quang của dung dịch mẫu chuẩn c ó nồng độ c tương ứng. X ác định nồng độ c , của chất phân tích th eo đường chuẩn đã dựng được. 5. K ế t quả Hàm lượng của streptom ycin trong mẫu phân tích ( /V g /g ) được tính theo côn g thức sau: X trong đó: a; lượng mẫu cân (ở đây a = 2 0 g); V: thể tích pha mẫu (V = 20 ml); Q : nồng độ streptom ycin xác định đirợc theo đường chuẩn. C ách p h a d ã y cliiiổii: Sử dụng dung dịch gốc chuẩn của streptom ycin c ó nồng độ 1 m g/m l (g ọ i là dung dịch A ) + Pha dung dịch streptom ycin nồng độ 10 / / g/m l: Lấy 1 m l dung dịch A pha loãng và định mức bằng nước cất đến 100 ml (dung dịch này g ọ i là B) + Pha dãy dung dịch chuẩn : Lấy 6 bình định m ức có thể tích 2 0 ml ch o lần lượt vào các bình từ s ố 1 đến số 6 một lượng như sau: 0 ,2 - l,0 - 2 ,0 -3 ,0 -4 ,0 -5 ,0 ml dung dịch B. Thêm vào m ỗi bình 2 ml natri hydroxyt IN và lượng nước đến 10 ml. 284 Đun cách thuỷ ch o sôi để thuỷ phân trong 10 phút. Đ ể nguội ở nhiệt độ phòng,thêm 4 ml thuốc thử phèn sắt (III) amoni 2% trong axit lắc kỹ và (lịnh m ức bằng nước cất đến 2 0 ml. N hư vậy, ta đã được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ là : 0 ,1 - 0 ,5 - 1 ,0 1 ,5 -2 ,0 - 2 ,5 / í g / m l . 1 Ì.6 . CHẤT DIỆT KHUẨN 11.5.1. GIỚI THIỆU Các chất c ó đặc tính diệt khuẩn thường có với lượng rất lớn. Sự có mặt của chúng trong thực vật là do nhiều con đường khác nhau: D o yêu cầu côn g nghệ nhằm làm tăng độ bền vững của một số sản phẩm (anhydric suníuric trong rượu vang, biphenyl trong rau quả...). Trong trường hợp này thường phải đưa ra giới hạn tối đa không được phép vượt qua để đảm bảo an toàn thực phẩm. D o tiếp xúc sản phẩm với bề mặt không được rửa sạch sau khi dùng chất diệt khuẩn (N aO C l, HCHO...)- D o bổ sung chất diệt khuẩn nhằm ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật, m ặc dù điều này bị cấm bởi luật. Sự có mặt của chất diệt khuẩn trong thực phẩm cũng đặt ra các vấn đề tương tự như chất kháng sinh: ảnh hirờng đến sức khỏe của người tiêu dùng do độc tính của chất diệt khuẩn, ảnh hưởng đến ch ế độ công nghệ (như kìm hãm quá trình lên m en lactic trong sản xuất sữa). 11.5.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1 1.5.2.1. P h ư ơ n g p h á p vi sinh a. Phương p h á p biển đ ổ i s ự chuyển hóa của nấm men Phương p h á p thường dùng: test quá trình lén men Thực phẩm được đưa đi lên men có bổ sung một lượng chuẩn nấm men S a c c h a ro m yc e s c e r e v is ia e rất hoạt động. Sau khi nuôi cấy kiểm tra thể tích khí CO2 tạo thành ch o phép kết luận có hay có mặt chất diệt khuẩn. 285 h. Pììương pììáp phát triển trong mỏi trường thạch Cơ sở phương pháp là ch o mẫu vào trong m ôi trường thạch. N ếu m ẫu c ó chất diệt khuẩn sẽ ngãn cản sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt thạch, được so sánh với mẫu kiểm chứng tiến hành trong cùng điều kiện. Phương pháp hay dùng: Phương pháp D rieux và Thierry áp dụng ch o tất cả các sản phẩm , ngoại trừ bơ. Phương pháp M ossel và Eijgelaar áp dụng ch o phân tích bơ. 1 1.5.2.2. P h ư ơ n g p h á p h ó a -lý N gày càng c ó nhiều chất hóa học c ó tác dụng diệt khuẩn, đòi hỏi c ó nhiều phưcfng pháp thích hợp xác định chúng. Trong phần này chỉ giới thiệu cá c phương pháp nghiên cứu và định lượng các chất diệt khuẩn thuộc phạm vi: Chất diệt khuẩn chính được phép sử dụng rộng rãi trong thực phẩm; Các chất có tác dụng diệt khuẩn như chất tẩy rửa, chất khử trùng; M ột vài chất diệt khuẩn được dùng kh ông chính thức. a. Axit so rb ic và so rb a t Các phương pháp hay dùng: phương pháp so m àu, phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại, phương pháp sắc ký khí (G C ), phưcmg pháp sắc ký lỏ n g hiệu năng cao (HPLC). b. A kìí b en zo ic vờ ílẫn xuất Dẫn xuất của benzoic có nhiều loại: axit orth oclorob en zoic, paraclorobenzoic, sa iicy lic, parahydroxybenzoic và các ester m e ty l, propyl, butyl cùa axit parahydroxybenzoic. Phương pháp thường dùng: sắc ký g iấ y , sắc ký bản m ỏng, phương pháp HPLC. c. A nliydrìc suiìfitrơ và suiifit A nhydric sunfurơ được đưa vào thực phẩm lỏng dưới dạng k h í suníurơ, nó sẽ kết hợp với đường, etanol và các chất màu. N ó thường tồn tại m ột phần dưới dạng SO2 tự do c ó mùi đặc trưng và c ó tính diệt khuẩn. Sau khi đốt nóng mẫu và bổ sung nước, axit photphoric, c ó thể xác định anhydric sunfurơ th eo hai cách: N hận biết m ùi; C on đường h óa học: dùng bãng giấy am idon c ó tẩm kali, khi c ó mặt SO2, băng g iấ y sẽ hiện m àu xanh. Có nhiềụ phưcfng pháp kỹ thuật dùng định lượng. 286 d. Biplienvl và ortlìopheiìyỉ-pheiìoỉ Các hợp chất này được sử dụng trong xử lý bề miặt caim, quýt...C húng được xác định theo phương pháp Gunther, Blinn và Barkley: N ghiền quả, xử lý bằng hơi nước thu p h á n cHiưing bằng xyclohexan. O rthophenyl-phenol được chiết bằng dung dịch xút loàmg,, biipihenyl vẫn còn trong xyclohexan. Tiến hành so màu ở 248nm e. Dẩn xuất lialogen của axit axetic C ông thức chung C H 2X C O O H . Trong đó axit miomobromaxetic được dùng nhiều hơn cả. C ó nhiều phương pháp được dùng; PhưcíngỊ p)háp Florentin-M unch, C ristol-B enezech, ia u ln e s, V ivario. / . Axit b o ric Có nhiều phương pháp xác định axit boric trong thụrc phẩm , ta c ó thể kể tới hai phưcmg pháp chính: Phưcmg pháp chuẩn độ, Phương phiáp so màu. g. Poì m a ld eh yt và d ẫ u xuất D iem air và P ostel đưa ra phương pháp kiềm hóa fo)rmol bằng phản ứng với axit crom otropic với sự có mặt của H2SO4. Nếu có t b m o l sẽ xuất h'ên màu tím. Censi và C rem onini đưa ra phương pháp định lượng fomnO'l hằng cách dùng 2,4dinitrophenylhydrazin. /ỉ. A x itỷ o n n ic Phưcmg pháp L ecoq: Chiết bằng ete petrol, sau đó phđn chiết eie được kiểm hóa bằng dung dịch xút 0 ,1 N . Tách pha nước và tiến hành ax.it hóa bằpg H2SO4 IN , sau đó chưng cất đến khi ch ỉ còn khoảng vài ml dịch ch iếit. G ia nhiệt phần nước chưng 15 phút bằng đun cách thủy, bổ sung vài hại tinh thiể PígCla- N ếu c ó mặt axit íorm ic, sẽ tạo kết tủa trắng. G iới hạn kiểm tra của phưo^ng pháp hàm lượng axit íorm ic > 300n ig//. i. H ợ p chất f l o Phương pháp Truhaut: sau khi tro hóa, chuyển toàn bộ flo thành axit hydroA osilic bằng cách ch o tác dụng với H2SO4 với sự có nmặt của silic. Chưng cất cuốn hơi nước, thu axit Aohydric (d o thủy phân axit hyd roA osilic). Chuẩn độ flo 287 bằng dung dịch thori nitrat với chỉ thị natri alizarin-siilfonat hoặc parasulíbphenylazo-dihydroxynaphtalen-disulfonic (SP A D N 3). j. H ợp clỉất amonium Phương pháp D iem air-Postel: chiết am oni bằng hỗn hợp nước-axeton, tiếp theo bằng dicloetan, thu bằng brom ophenol. Các hợp chất am oni tạo phức màu xanh với brom ophenol và được định lượng bằng cách so m àu ở bước són g 608nm (xây dựng đường chuẩn). Phirơng pháp Miller-XVildbrett: cải tiến từ phương pháp trên, hợp chất am oni tạo phức màu với eosin và so màu ở 542n m . k. H y d ro p e ro x yt Đ ược áp dụng nhiều trong công nghiệp sữa. - Phương pháp hóa học: Phương pháp Pien, D esirant và L aíontaine; Phương pháp Rouquette; Phương pháp A m in và O lson; Phưcfng pháp Peưier; Phương pháp Gupta. - Phưcmg pháp enzym : Có độ nhạy cao hơn phương pháp hóa học /. H y p o clo rit và cloram in - Phương pháp hồ tinh bột: H ypoclorit phân giải iodua tạo iod c ó màu xanh với hồ tinh bột. - Phương pháp huỳnh quang; trộn 3m l mẫu với hỗn hợp H2SO4 (3 + 1 ) chứa 0,025% clorua thiếc, giữ ở nhiệt độ 0-5"C. L y tâm 3 phút tốc độ 2 5 0 0 vòng/phút. Thu kết tủa soi đèn tử ngoại (3 6 5 n m ), nếu thấy màu lục nhạt thì mẫu c ó hypoclorit hoặc cloram in. 11.5.3. THựC HÀNH B à i 4 . X á c đ ịn h h à m lư ợ n g a x it b e n io ic 1 . N guyên rắc Làm đồng nhất hoá sản phẩm, sau đó pha loãng và axit hóa phần mẫu thử, chiết axit benzoic bằng dietyl ete, sau đó chiết lại axit này bằng k iém và tinh c h ế 288 bàng cách o x y hoá kali dicromat đã được axit hoá. Xííc dịrih bằng cách đo quang phổ của axit b enzoic tinh khiết được hoà tan trong dictyl ete. 2. H ỏ a chất Tất cả các thuốc thử phải thuộc loại tinh khiết phân tích. Phải sử dụng nước cất hoặcrntrớc c ó đ ộ tiirir khiết taơng điiơng. A x it tactaric tinh thể N aO H IN; A xit suníric (2+ 1); Kîli dicrom at, dung dịch 33 - 34g//; Dietyl ete mới được ^ất; A ỉtit b en zo ic, dung dịch chuẩn 0 ,1 0 0 g /l trong dietyl ete. I ! 3. D ụ n g cụ, thiết bị ! B ình định mức 5 0 m l; I C ốc c ó m ỏ , 5 0 m l và lO O m l; Phễu chiết 5 0 0 m l ; I1 Pipe, 20m l; Máy làm đồng nhất ; C ân phân tích; Bếp c á c h th u ỷ ; B ìn h cầu 2 5 0 m l c ó nút m ài, được làm bằng thuỷ tinh b o ro silica t. I Ị M á y đ o q u a n g p h ổ x á c dịnh trong phạm vi tia cực tím , ph ép đ o clỊính x á c tới 0,5n m , c ó cuvet thạch anh bề dày lOmm hoặc 20m m (20m m thì tốt hơnj để tãng độ nhạy) c ó nút thuỷ tinh nhám . 4. C á cti tiên hành i \ 4 .1 . Chuẩn bị m ẫu thử 4 .1 .1 . C ác sản phẩm lỏng (dịch quả, các sản phẩm có thịt quả, lịiro) và các sản phẩm đặc: mứt cam , míri nhuyễn). L à m đ ồ n g nhất m ẫu th í nghiệm sau khi trộn. ị Ị 4 í l .2 . Sản phẩm rắn (rau, quả). c ẩ t mẫu th í nghiệm ra thành nhiều miếng nhỏ, bỏ hạt, k tio iu g cần, và ngh iền trộn đồn g nhất một cách cẩn thận khoảng 4 0 g mẫu.Đ ể l i noãn nếu sản phẩm đôn g lạnh tan giá trong m ột bình kín và cho dịch tan chảy này vào sản phẩm trước khi nghiền trộn mẫu. 289 4.2. Phần mẫu thử 4 .2.1. Các sản phấm lỏng Dùng pipet, lấy 20ml mẫu thử, không có các chất ớ dạng huyền phù, pha loãng với khoảng 50m l nước và chuyên vào một phễu chiết dung tích 500m l (phều chiết A ). Chú thích; phần mẫu thử này cũng có thể được lấy th eo khối lượng, bằng cách cân xấp xí 20g mẫu thử chính xác đến 0 ,0 Ig. 4 .2.2. Các sản phẩm lỏng chứa thịt quả Lấy 20m l mẫu thử cho vào cối và nghiền với 2 0 0 m l nước. L ọc chất lỏng sau khi gạn. Làm hai lần liên tiếp, cho bã vào 2 0 0 m l nước rồi gạn, lọc lấy chất lỏng. Thu toàn bộ dịch lọc trực tiếp vào phễu chiết dung tích 5 0 0 m l (phễu ch iết A ). Chú thích: Phần mẫu thử này cũng c ó thể được lấy th eo khối lượng, bằng cách cân xấp xỉ 20g m ẫu thử chính xác đến 0 ,0 Ig 4 .2 .3 . Các sản phẩm rắn hoặc đặc Cân khoảng lOg mẫu thử chính xác đến 0 , 0 Ig , và dùng 30 - 40m l nước, chuyển mẫu vào bình cầu 250m l. Thêm khoảng 5 0 m g Iiatrihydrocacbonat (xem chú ihích). Lắc, rồi đặt lên nồi cách thuỷ, điều chinh nhiệt độ 7 0 - 80"c, và để trong 1 5 - 3 0 phút. Lọc phần chứa trong bình cầu và tráng hai lần bàng nước, m ỗi lần díing 15 - 20m l. Tliu toàn bộ dịch lọc vào phễu ch iết du n g tích 500niJ (phều chiết A ). Đ ể ch o nguội. Chú thích: việc ch o thêm natrihydrocacbonat là đ ể trung hoà axit b en zoic, vì một phần nhỏ cìia axit này c ó thể bị mát do bay hơi. 4.3. Chiết axit benzoic Cho 1 g axit lartaric vào phễu chiết (A ) chứa phần mẫu thử đã được pha loãng (4 .2 ), thêm 60m l dietyl ete và lấc kỹ. Đ ể ch o tách lớp, rồi hứng lớp ete vào phễu chiết thứ hai dung tích 500m l (phễu chiết B). Sau đó rửa phần dịch trong phễu chiết ihứ nhất (A ) bầng 60m l dietyl ete. Đê’ tách lớp, rồi hứng ete vào phễu chiết (B) có chứa lớp ete thu được lần thứ nhất. Tiếp tục tương tự lần chiết thứ ba bằng 30m l dietyl ete và dồn lớp ete thu được vào cùng hai lần đầu trong phễu ch iết (B). Chiết 290 axit benzoic từ dung dịch ete bàng cách théin licn liếp lOml và tiếp 5m l dung dịch natri hydroxit, và sau đó hai lần, mỗi lần lOinỉ nước. Sau m ỗi lần ch o thèm lắc, rồi đế cho lách lớp và hứng lấy phần dịch. Mứng dịch vào một đĩa. Đạt ctĩa lên nồi cách ihuỷ, điều chinh nhiệt độ 70 - 80"c, và dể đó cho dến khi ihể tích dung dịch kiềm giám klioáiig một Iiửa, lấy phần dietyl cte đã hoà lan còn SÓI lại. 4.4. Tinh c h ế axit benzoic Sau khi đế n gu ội, rót dịch ở đĩa vào một bình cầu dung tích 250m l có chứa hỗn hợp 20m l dung dịch axit .sunfuric và 20m l dung dịch kali dicromat. Đ ậy Iiắp bình cầu, lắc và để đó ít nhất 1 giờ. Chú thích: 1) Các chất bảo quản khác có nguồn gốc từ axit benzoic c ó thê có mặt. Trong trường hợp này đ ể bình cầu ít nhất 3 giờ, đè’ oxy hoá hoàn toàn ba axit liydroxybenzoic và loại trừ bất cứ sự cản trở nào trong việc xác địiih. Sự kéo dài thời gian phản ứng tạo ra không ảnh hưởng gì vì axit benzoic chịu được hỗn hợp ox y hoá này. 2) Khi sản phẩm ban đầu cũng chứa axit sorbic, thì cán phải kéo dài thời gian o x y hoá 24 giờ nhàm đảm bào phân huỷ hoùa loàn axit này. 4.5. Chiết axit b enzoic tinh khiết Chiết axit b en zoic bằng cách xử lý duag dịch trên (4.4) hai lần với 2 0 - 25m l dietyl ete, thu lấy dung dịch ete. Rửa dung dịch ete hai lần bàng một vài m ililít nước. Sau khi gạn rất cẩn thiỊn, lọc qua giấy lọc khô và Ihu dịch lọc vào bình định mức dung tích 5 0 m l. Sau đó rửa giấy lọc bằng một vài m ililit diety ete, thêm ciủ dung m ôi rửa này vào (iịch lọc đê’ pha loãng tới vạch. 4.6. X ác định Dùng m áy đo quang phổ, đo độ hấp thụ của dung dịch ete (4 .3 ) liên quan đến độ hấp thụ của dietyl ete tinh khiết ở bước sóng 267,5iim đến 272nm và 2 7 6 ,5nm (x em chú thích). Đ ộ hấp thụ do axit benzoic được tính bằng côn g thức chung đo sự chênh lệch xuất hiện ở bước sóng 272nm . 291 trong đó: Aj - độ hấp thụ ở 2 6 7 ,5nm; A 2 - độ hấp thụ ở 272nm ; A , - độ hấp thụ ở 276,5nm . Chú thích: V iệc xác định quang phổ hấp thụ của dung dịch ete cịhứa axit benzoic tinh khiết ch o phép biểu thị đặc điểm của sản phẩm này bởi sự có mặt của hai đinh ở Ỉ7 2 n m và 279nm . A xit benzoic đã được ch iết bằng dietyl ete được x á c định bằng cách áo chiều cao của đìiw (p ic) ở bước són g 272nm liên quan tới đoạn thẳng nối các « é 'm trên trục hoành giữa 267,5n m và 2 7 6 ,5nm. 4.7. 9 S lầ n xác định Tiến hành hai lần xác định trên cùng m ột mẫu thử (4 .1 ). 4.8. )ự n g đường chuẩn Lấy một loạt 6 bình định mức dung tích 50m l, lần lượt ch o vào t mg bình 5 - 7,5 - i pI -- 12,5 12,5 -- 15 15 -- 20m 20mll dung dung dịch dịch chuấn chuẩn axit axit bben enzo zoic. ic. Pha Pha loãng loãng tới vạch bằng dietyl ete. Các dung dịch thu được chứa tuần tự 10 - 15 - 2 0 - 25 - 3C - 4 0 mg axit benzoiB/lit. T iến hành đo sự chênh lệch độ hấp thụ của các dung dịch này theo trình tự đ ư w m ô tả ở 4.6. V ẽ đường co n g biểu thị cá c lần đ o sự ch^.nh ệch liên quan đến sa m iligam axit benzoic/lit nêu trên. 5. K ễ t qu ả 5.1. fhần mẫu thử được lấy bằng cách dùng pipet Hàrn lượng axit benzoic sản phẩm tính bằng m ilig a m /lit theo cô n g th Jc: 50 iBaX — = 2 ,5 rĩi2 trong đó, n 2 là lượng axit benzoic đọc trên đồ thị chuẩn (4 .8 ) tính bằng m iljgam . 5.2. Phần mẫu thử được lấy bằng cấch cân Hàm lượng axit benzoic tính bằng m iligam trên k ilo g a m sản phẩm theo cô n g thức; 292 . 50 ni2 X — m, trong đó: rĩìi - khối lượng của phần mẫu thứ (4 .2 .), g; m ị - khối lượng của axit benzoic đọc trên đồ thị chuẩn (4 .8 ), m e. 11.6 . Đ Ộ C TỐ Vỉ NẤM 1 1 1 Ì6 .1 . GIỚI THIỆU ^ Đ (^ tố vi nấm (M ycotoxin ) là các độc tô' thưcmg nhiểm vào thựe phẩm và gây ra c Ị c hiện tượng nh iễm độc ở người và động vật. Đ ộ c tố vi nấm l ĩ sản phẩm của các (|uá trình trao đ ổi chất bậc hai và đây không phải là những đặc ti1ih c ố định của m ỗi Ịoài. 1 C i^ phương pháp phân tích độc tố vi nấm hay dùng: sắc ký bản m ộng, sắc ký lòng h iệil năng ca o (H PL C ) với các detector có độ nhạy c a o có thể tiến tới tự động hoá quá trình phân tích, sắc ký khí-lỏng được sử dụng trong phân tích hầu hết các độc tố. í^ây là kỹ thuật cần thiết trong phân tích các hợp chất không phát quang với ngưỡng ^hát hiện thấp như epoxytrichothecen. Trong m ột s ố trường hạp được gắn với thiết bị khối phổ. G ịhi đây cá c phương pháp m iễn dịch được ứng dụng để xác định độc tố vi nấm vớiị cá c ưu điểm nhạy, nhanh và sỉr dụng đơn giản. N guyên tắc của phương pháp ciựẰ trên sự tương tác giữa các kháng nguyên (dộc tò' vi nấm ) và c á c kháng thể đặc hiệu của đ ộn g vật. Đ ó là: m iễn nhiễm -phóng xạ, m iỗn nh iễm -enzyiĩi, sắc ký ái lực-m iễri nhiễm . í 11.6.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH i I_ _ _ 1 1 .6 .2 .1 . P h á n tíc h a fla to x in Thực phẩm c ó thể bị nhiễm nhiều loại độc tố aAatoxin như các aAatoxin B l, B2, G l, G 2. C húng c ó nguồn gốc từ nấm sợi và có trong các thực phấm bị nhiễm 293 tạp trực tiếp, nghĩa là chủ yếu c ó Irong các thực phẩm c ó nguồn g ố c thực \'ật. Trong thực phẩm c ó Iigiiốn g ốc dộng vật mà đặc biệl là các sán phấm từ sữa Iihiềrn tạp ihứ cấp do vậl chủ ãn phải thức ăn có chứa aílaloxin . cầĩi phái kể đến aílatoxin M l. T heo quy định của Pháp, hàm lượng aflato,xin BI là ihôn g số duy Iiliãt cán xem xét khi dánh giá độc tính của thực phám, trong khi đó pháp c h ế cúa M ỹ lại quy định hàm lượng aflatoxin nhiẻm tạp phải là tổng hàm lượng của a n a to x in B l, B2, GI và G 2. u. Clniđii bị m ầu D ung dịch aílatoxin loãng kém bền, nó bị phán hiiỷ dưới tác d ộn g của ánh sáng nên cần được pha mới thường xuyên. N goài ra aflatoxin còn là chất gây ung thư mạnh nên thao tác phải được tiến hành cẩn thận và tuân thủ cá c n gu yên tắc. Pha dung dịch aflatoxin trong benzen-axetonitril (9 0 + 10), đạt nồng độ 10p.g/m l. b. Phiừtng p h á p nliaiìlì sử dụng cột nlicSi â p dụng cho sân p h ẩ m run quủ C ó nhiều phương pháp định phân aílatoxin. Đáy là phương pháp với các lai điểm nhanh, đơn giản, kinh tế, c ó khả nãng áp dụng trên hầu hết các nguyên liệu và ch o phép phân tích định tính bước đầu, nliưiig không thể áp dụng trong trường hợp mẫu phân tícli c ó chứa chlorophyl. c. Phương p lú ip s ắ c ký bcỉit lìiỏiig - Plìươiìg p h á p C E E ( rcni qitả) V ới những sán phẩm “đơn giả n ” thì việc phân tích sử dụng sắc ký đơn chiều cũng đủ ch o kết quả đáng tin cậy. Song dối với m ộl số sản phẩm c ó cluíra các chất c ó khả năng làm rối loạn quá trìiih phân tích (ví dụ các dạng thực phẩm từ gia súc có chứa ch lo roỊ)hyl) ihì cần có sự can thiệp của sắc ký bản m ỏng 2 chiều. d. Phương p h á p IIP L C Mẫu phân tích được chiết, lọc, pha loãng và ch o di qua cột ái lựr m iền nhiẻm c ó chứa kháng thể dơn dòng. Kháng thể dơn dòng này đặc hiệu với các độc tô' aAatoxin B l , B2, G l , G 2. Đ ộc tố dược tách, làm sạch , làm giàu trên cột, sau đó được tách khỏi cột bàng m etanol. Đ ộc tố aflaioxin tổng sô' được x á c định bằng máy đo huỳnh quang sau khi đã clio phản ứng với dung ciịch brom (plurơng phá|) SFB). Các aílatoxin riêng biệt được xác định bằng phương pháp sắc ký lò n g hiệu năiig cao với pliủn lìnig iod sau cột (pliirưng pháp PCD). 294 I I . 6.2.2. Phán tích epoxy-tricotecen Fipoxy-tricotecen là các độc tố gây ra bởi các loài iliLiộc chi Fiisariiifìì, Síacliỵhotrvs và nhiều chủng nấm m ốc khác. C'hĩmg Ihirừng đươc tìm thấv trong ngũ cốc mà đặc biệt là trona ngô. Hiện tượng nhiễm dộc g a y ra bới các độc tố này tươnií dối ngh iêm trọng do con người rất nhạy cảm \'ới d ộc tính cùa cliiìiig: cỉộc tô' nhóm này là các tác nhân A T A (A leu cie Toxique A lim entairc), các 'ác nhân làm suy giàin khả năng m iễn dịch gây ra hiện tượng suy giám bạch cầu. Các phương pháp phân tích hiện có đều dựa trên kv thuật sác ký khí-lóng. D esoxyn ivalen ol (vom itoxin ) là độc tố duy nhất có thế xác định bằng sắc ký bán m ỏng. a. C á c test sinh học - Úc c h ế quá trình sinh trưởng của ỉym phom cytes tnuriiis in vitro: ch o biết kết quả sau 48 h và đo trực tiếp được khả năng su y giảm m iễn dịch cùa dịch ch iết phân tích. - Đ ặc tính hoại da: chất chuẩn được chọn có thế là độc tố T -2. Đ ộ n g vật sử dụng trong thí nghiệm có thể là chuột do phản ứiig của chúng với độc tố tươpg đối ổn định b. K ỹ thuật R O M E R , B O L ỈN G vù M c D O N A L D Phương pháp này sử dụng kỹ thuật sắc ký khí-lỏng, với các mầu nhiễm độc ở mức thấp m uốn xác định cần phải sử dụng thêm một detector c ộ n g kết điện tỉr. Với detector cộn g kết điện tử, c ó thể phái hiện ở mức 100 ppm với T -2 và 25 ppm với d iaxetoxyscirp en ol, c ó thể tăng độ nhạy hơn nữa trong Irường hợp cần thiết. Với detector ion hóa ngọn lửa không vượt quá Iigưững 250 ppin dối với T-2 và 150 ppm với d iaxetoxyscirp en ol. N gưỡng phát hiện này có áp dụng được trong kiểm tra thức ăn gia siic s o r g không thể áp dụng với thức ăn cho người. c. Phân tích deoxxiiÌYuleiioí ( D O N ) Phương pháp dựa trên việc xác dịnh các vết huỳnh quang trên sắc ký bản m ỏng tạo ra bởi các dẫn xuất từ phản ứng giữa DON và N H 4CI ở 120"C. G iới hạn xác định của phương pháp là 100 ng/g (hay 100 ppb). 295 11.6.2.3. Phân tích learalenon Zcaralenon là đ ộc tô' c ó hoạt tính oestrogen không m ong inuốii, nó thường nhiễm vào ngũ cố c inà đặc biệt là n gô với hàm lượng đôi khi lất lớn. Phương pháp m ô tả dưới đáy ch o phép đạl mức tối ưu giữa hai tiêu chí: "dộ cliíiih xác của phép địnli phân/ .nức dộ dan giản-jýài-4p d ụ Ạ f e ’V C Q £ ^ d Q ạ g pháp c ó thể tiến hành trên T L C hay trên HPLC. G iới hạn dirới của phương phẩp là 0,01 m g/k g hay 10 ppb khi sử dụng HPLC và 0 ,0 2 m g /k g hay 2 0 ppb với TLC. ỉ 1 .6 2 .4 . C á c p h ư ơ n g p h á p m i ễ n d ị c h h ọ c Troi g rố các phương pháp hóa-m iễn dịch, phương pháp m iễn dịch ịphóng xạ hay radio- m m u n o-assay (R IA ), phương pháp en zym h ọ c m iễn dịch h a y ien zy m elinked-im rL uno-sorbent-assay (E L ISA ) và ái lực m iễn nhiễm (im m im o affinity) đirợc sử d ụ og trong định phân độc tò' vi nấm. Hai phương pháp R IA và ELISA dưa trên sự cạnh tranh liên kết gili'a độc tố chưa biết (Ịua mảu phân tích vớ i độc tố đã biết cùa mầu chuẩn trên VỊ trí Ịđặc hiệu cùa kháng |h ể . Á i lipt m iỗn nhiễm (im m u n o-affin ity) là kỹ thuật sắc ký dựa Irực tiếp trên sự liên kết giĩỊỉt kháng n gu yên (đ ộc tố) với kháng thế dược c ố định trên cột. ■ a. Phương pháp RIA Phưciig pháp này cần c ó sự tiếp xúc đổn g thời giữ a mẫu phân tích Ịhay mẫu chuẩn với ịlàm lượng đ ộc tô' dã biết không đ ổ i và kháng thể đặc hiệu. Độcị tỏ' tự do và độc tố ìên kết với kháng thể sau đó được phân tách và tiến hành đo hoạt tính phóng xạ c ua từng phàn đoạn. N ồn g đ ộ độc tố của m ẫu phân tích được xác clịiih dựa trẽn đường chuẩn xây dựiig bởi ti lệ giữa hoạt tính phóng xạ của phân đoạlỊ liên kết và hoạt tíi ,h phóng xạ của phân đoạn tự do với logarit nồng đ ộ độr tố củ a mẫu chuẩn. h. Phương lá p E L IS A Phương pháp ELISA có hai dạng; - V ới kỹ thuật trực tiếp, kháng thể đặc hiệu với hàm lượng xác dịnli đirợc cố định irên bản sắc ký. Dung dịch mẫu phân lích và m ột Lrợng đã biết 296 không đổi của liên hợp “độc tổ -en zy m ” được ủ đồiig thời với nhau. Sau khi lửa, liên hợp độc tố-en zym giữ lại trên bản sắc ký thông qua kháng thể được tách ra bằng cách sử dụng một cơ chất tạo m àu đặc hiệu với enzym . Đ o cường độ màu bằng m áy hoặc đánh giá bàng rnắt thường. - Vótt-kỹ thuật-g iá u úép , d ệ e tế é u ợ e c ố đ ịn h irên bản sắ c ký thôt^ qua một lìén hợp đ ộc tố-polypeptit. Sau đó dung dịch m ẫu phân tích và Ểriột lượng xác định kh ôn g đổi kháng thể được ủ đổn g thời với nhau. Sau íịông đoạn lượng kháng thể gắn kết vào bản sắc ký sẽ được x ác định tằ n g cách sử dụng m ột liên hợp enzym “en zy m -im m u n o g lo b iilin (kháng thể đặc hiệu)”. Cường độ m àu tạo thành sau khi c h o c ơ chất sinh m àii đặc hiệu yới enzym được đo bằng máy hoặc đánh giá bằng mắt thường. I c. Sắc kỷ ậi lực m iễn nhiễm (iiìimiino-affiiiity)-ỈAC V i (ĩột c ó chứa silic hay sắc ký bản m ỏn g kết hợp với quan sát duì® đèn ư v , sắc ký lỏiỊg hiệu năng ca o H PLC kết hợp đo cường độ huỳnh quang, teật RIA và test ELIS/V. Với các sản phấm rau quả và ngũ c ố c thì cần phải tiến hành iẩông đoạn tách chiếti trước khi ch ạy lA C . N gư ợc lại với các chất lỏ n g sin h học tìhir huyết Ihanli, nưcisc.tiểu hay sữa thì hai công đoạn tách chiết và tinh ch ế độc tô' từ mẫu phân tích clirợc ^ến hành dồn g thời. i ' I 1 Ị . 3 .THỰ C HÀNH lỉà tị 5 . X á c đ ị n h h ù m lư ợ n g a f l a to x i n 1 l . ỉígityêii lắ c A fl4toxin được ch iết tìr mẫu thử bằng các hệ dung m ôi hữu c ơ kỊiác nhau. D ịch c h iế i được lọ c , m ột phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicage® (florisil, SPE). Làii^ bay hơi dung dịch rửa giải và hòa tan cặn với dung m ôi pha động rồi bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng ca o (H PLC). 2 . ỉĩế a ch ấ Ị,thì(ổ ờ th ở Tất cả các hoá chất đều phải là loại tinh khiết phân tích sắc ký nếu không có các chi dẫn riêng nào khác. 297 Các chiián allatoxin B I . B2, G 1, G2; A xetonitril; M etanol; T oluen; Hexan; Natri siilíat khan; C lorofooc; C elit 545; E te e ty lic ; K hí N 2 tinh khiết. S ilicagel G -6 0 (hoặc ílorisil) dùng cho sắc ký cộ t, cỡ hạt 0 ,0 6 3 -0 ,2 m m . Hoạt hóa bằng cách sấy khô ở 10íĩ"C trong một g iờ , sau đó trút vào bình tam g iác nút m ài, thêm nước với tỷ lệ Im l nước cho lOOg silic a g e l, đậy nút, lắc đến khi trộn hoàn toàn đềi', bảo quản 15 giờ trong bình kín. Chuẩn bị dung dịch aAatoxiii chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát, tránh ánh sáng): D ung dịch aflatoxin chuẩn B l, B2, G l , G 2 (dung dịch A ) lán lirợt lấy ống chuẩn Im g m ỗi loại cho vào 4 bình định mức lOOml và định mức đến vạch hỗn hợp toIi'en-axeton iư il 98:2 (v/v) (nồng độ dung dịch aA atoxin chuẩn là 10).ig/ml). D ung dịch aA atoxin chuẩn làm việc (dung dịch B): C ho vào bình định mức lOml lần lượt 0 ,5 m l aflatoxin B l, 0,5m l aflatoxin G ! , 0 ,l m l aílatoxin B2, 0 ,lm l aílatoxin G 2 (dung dịch A ở trên), định mức đến lOml bằng hỗn hợp toluenaxetonitril 98:2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0 ,5 ụ g /m l đối với B l, GI và 0 ,l|j,g /m l đổi với B2, G 2. Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflaloxin chuẩn (dim g dịch A , X ụ g/m l) bàng quang phố hấp thụ phân tử U V -V IS, bước sóng từ 35 0 n m , so với mẫu tráng (tolu en /axeton itril), tính kêì quả theo công Ihức: lOOO.m.A X (|.ig/m l) = ------ — — c trong đó : m - khối lượng phân tửaflatoxin; A - mật độ quang ớ bước sóng hấp phụ cực đại; e - độ hấp thụ phân tử của allatoxin. 298 B ả n g 11.6.3. Độ hấp thụ phân tử của aílatiOxin r...... Aílatoxin m Dung môi toluen-axetonitril )jr»ax c (v/v) (nm) (cm mol) BI 312 98 :2 350 19800 B2 314 98 :2 350 20900 GI 328 98 ;2 350 17100 G2 330 98 :2 350 18200 Bào quản: Bào quản ở 0"c, dung dịch A để được 6 tháng và đu n g dịch B đ ể được hai tuần. D ụng cụ, thiết bị HPLC với đrìii dò ƯV; lỉơm hút chân không; Càn phan tích lO^g; Pipei cá c loại; M áy nghiền; Pipet Pasteur; Cất qiir.y chân không; Giấy lọc; M áy ly tâm ; Xvlanh; Máy kliLiấy từ ; Bộ phcii hút chân không. Cột sắc ký thủy tinh, đường kính trong 22m m , dài 3C)0mm, c ó khóa nút mài thủy tinh hoặc teílo n và bình đựng dung m ỏi phía trên, dung lích 2 5 0 m l. 4. C ách tiên hành 4.1. Chuẩn bị mẫu (Đ iều kiện tiến hành: ở phòng mát, tránh ánh nắng). Chiết Xiiất: Càn 5Ca m ầu đã nghiền Iihò ch o vào bình nút mài 5 0 0 m l. C ho tiếp 25m l nước, 25g celite 54 5 , 2 50m l clo ro ío o c, đậy nút chạt. Lắc trong 30 phút bằng m áy lắc quay tròn hay m áy khuấy từ (hoặc lác kỹ bàng lay) rồi lọc qua giấy lọc gấp 299 cạnh, bỏ lOml dịch lọc dầu sau đó lấy 50inl dịch lọc tiếp theo (tương đương lOg mẫu thử), N ếu tốc độ dịch lọc xuống chậm , ch u yển sang phều Biichner c ó chứa 1 lớp celite 545 dày 5m m trên g iấy lọc và dùng hút chân không. Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký: C ltu É I b ị SẮC i£ỹ: Q i o m ộ Ị íf B ỡng vậio đ a ỹ ^ ^ sắc k ý tìíSm ỗ g l ia tr i sunfat khan. Đ d c lo r o ío o c đến 2 /3 c ộ t, sau đó ch o lOg silic a g e l dùng ch o sắc l;ý cột, vừa ch o vừa nhẹ thành cột ch o silic a g el lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khặiấy nhẹ để tránh bọỊl khí. M ở khoá ch o clo ro ío o c chảy xu ốn g từ từ. Khi tốc đ ệ lắng của silic a g el Ịchậi.i lại, rút hết clo ro ío o c ch ỉ đ ể m ột lớp 5cm phía trên Idp silica g el. Thêm từịtừ 15g natri sunfat khan, sau đó rút bớt clo ro ío o c đ ến gần sẩỊt lớp natri su n íat klian trên. C ột s ilic a g e l thu đư ợc p h ải m ịn , k h ô n g c ó b ọt k h í và c^ú ý không để cột bị khô k ể từ lớp natri sunfat khan trên. Trộn 5 0 m l dịch lọ c trênlvới 150ml /;-hexan,ịđổ cẩn thận vào cột sắc khí đã chuẩn bị như trên. L oại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tịếp 150m l ete ety lic khan, loại bỏ dung dịch ch ảy ra. Chú ý kh ôiịg đ ể cột bị khô, lưii ìượng dòng chảy khoảng 8-12m l/phút. ' R ỉ a g iai aA atoxin bằng 150m l hỗn hợp m eta n o l-clo ro fo o c (3:97Ji. Lấy toàn bộ dịch (ỉhảy ra k ể từ khi bắt đầu ch o dung dịch rửa g iả i ch o đến hết. ịLiru lượng dòn g chả^ như trên. L àm bay hơi dung dịch rửa bằng m á y cất quay chân ịkhông cho đến khi pòn khoảng 2 -3 m l ỏ nhiệt đô thấp hcm 50" c. C huyển sang ố^ g nghiệm lOml, trííịng rửa bình cầu bằng clorofocx: và làm bay hơi đến khô trên n ồ í cách thuỷ ờ nhiệt (|õ thấp hcm 50" c, tốt nhất dưới luồn g khí nitơ nhẹ. H òa tan cặiị bàng Iml dung m ô ị pha đ ộn g và bcím vào HPLC. I i I 4 . Ị Đ iể u k iệ n c h ạ y m á y Ị Cệịt C -i8 (25cm X 4,6mm X 5f.im); Tiền cột C-18 (2cm X 4,6mm X ỹỊ-im); N l|iệt độ cột 30”C; ị Phịl động: M eian ol/H sO (5 0 /5 0 ); 1 CliíHIỘ điạy fíftng, tốc độ đồng 1mVmin: D electer U V ; 365nm ; 0,02A Ư F S . 300 4.3. Tiến hành phân tích Bơm 20 ịi\ mẫu phùn tích vào m áy HPLC và chạy th eo c h ế độ ở trên. 5. K ếỉ q u ả So sánh thời gian lưu của m ỗi đinh so với đỉnh chất chuấn để định tính. S o í ánh ch iều cao (h) hoặc diện tích của m ỗi pic (S|) với pic chất chuẩn tương ứng (S,„) đ i tính định lượng. Hàrp lượng aA atoxin từng loại trong mẫu (m g /k g ) được tính th eo c ô Ig thức; X. = s,-c,.v trong đó: Si diện tích pic tương ứng của mẫu phân tích c ó chất “i” ; s,, ; diện tích pic tương ứng của m ẫu chuẩn c ó chất “ i”; Ci I nồng độ chất “i” c ó trong m ảu chuẩn, (^g/ml; V th^ tích dịch ch iết m ẫu cu ối cù n g , ml; m : khối lượng m ẫu phân tích, g. 11.7. MỘT SỐ THÀNH PHẦN KHÁC 11.7 .1. GIỚI THIỆU N g c li những đ ộ c tố thường xu y ên được kiểm soát, thì trong thời gian vừa qua nh iềa chất gây đ ộc được phát hiện trong thực phẩm . Đó là chất 3 -m o n o c h p r o p r o p a n -l,2 -d io l (3-M C P D ) trong nước tương, x ì dầu; chất m elam in trong sữa bột và sản phẩm từ sữa (nhập từ Trung Q u ốc); hàn the trong I)ánh phở, bún; dư l ư « g nitrat, nitrit trong sản phẩm thịt. Trong phảiTnaỹT cKung^tSTcHiTỹHrgĩớI thĩệu cấc~]^ữỡng phân tích m ấy nhóm chất sau: Chất tạo ra trong qui trình cô n g nghệ như 3-M C PD ; Chất bổ sung vào thực phẩm nhằm m ục đ ích tăng “hàm lượng đạm tổn g s ố ” nhưng lại gày độc 301 Iihir m elam in; N hóm ptui gia tạo màu và ốn định màu \'ượt quá giới hạn ch o phép như nitrit, nitrat trong báo quán, c h ế biến thịt; Chất tây trắng, khử trùng dùng trong công nghệ c h ế biến, Iihim g không được loại bỏ triệt dế trong sản phẩm cuối cùng như SO2. 11.7.2. CHẤT 3-MCPD VÀ MELAMIN 11.7.2.1. C h ấ t 3 - M C P D a. K hái niệm Chấl 3-M C PD thuộc nhóm hóa chất gây độc có tên g ọ i chung là chloropropanol, côn g thức phân tử C,H7C102, khối lượng phân tử 110,5. OH ,CH H^C CH, OH Cl 3-M onochIoropropan-1,2-d iol (3-M C P D ) Cliloropropanol c ó các dẫn xuất 1,3-DCP; 2-M C PD ; 2 ,3 -D C P và 3-M CPD. Trong đó, 3-M C PD có hàm lượng cao nhất và tồn tại dưới dạng hỗn hợp racem ic của 2 đồng phân (R ) và (S) (hàm lượng của 2 đồn g phân đối quang bằng nhau 50:50). C1 Cl .CH H2C '^CK CH OH .C H H^C ^C H , Cl OH Cl OH CH, H2C OH Cl .3-dichloro-2 propanol 2-monochloropropan-1,3-diol 2,3-dichloro-2-propanol (1.3-DCP) (2-MCPD) (2.3-DCP) b. Sự hình thànỉi troiig thực plìẩm Chất 3-M C PD được hình thành qua phản img giữa chất b éo với các chất có chứa Clo thường xảy ra irong quá trình thủy phân chất đạm thực vật bằng acid 302 clohidric. Phản ứng được thúc đáy nhanh h(ín khi \á y ra ò nhiệt dộ cao. D o dó thường gặp trong nước tưưng, bánh rnì, phomat, xúc xích ... nhất là troiig lurớc tương, do nhà sản xuất dùng protein thực vật thủy phàn bàng axit clolivdric dể làm tăng hưửiig vị trong quy trình sún xuấl nước tương, dây là khâu thủy phân đạm trong khô dầu đậu nành. c. T ác hại của 3 - M C P D Các nghiên cứu \ ’ề độc tính của 3-M C PD dã được tiến hành từ những nám 1994 và đến nay đã cho thấy 3-M C PD có khả Iiăng gây ung ihư nếu sứ dụng dài ngày. N guy hiểm hơn nữa, 3-N4CPD có thể chuyển hóa thành 1,3-DCP là chất gãy kliối u thận, gan, luyến giáp và biểu hiện ung thư do biến đổi g e n ... trêii chuột cống nếu sử dụng dài ngày với liều lượng 19m g/kg thể trọng/ngày. N hữiig nghiên cứu trên vi sinh vật và dòn g tế bào ch o thấy 3-M C PD có thể làm thay đổi quá trình nhân bản gen. d. G iới hạn c h o p h é p N ồng độ tối đa 3-M C P D ch o phép trong một kg nước tương của các nước Iihư sau: . Canada, Phần Lan, Á o, Các tiểu vương quốc Ảrập: im g /k g . Mỹ: 1m g /k g ch o 3-M C P D và 0,0 5 m g /k g cho 1,3-D C P . Ú c và N iiidilân; 0 ,2 m g /k g ch o 3-M C PD và 0 ,0 0 5 m g /k g ch o 1,3-D C P . Liên hiệp Châu Â u . í ỉà Lan, Hy Lạp, Bổ Đ ào Nha, M iilaysia, Thụy Điển: 0 ,0 2 m g /k g . Anh: 0 ,0 1 m g /k g • JECFA ( ủ y ban hỗn hợp chuyên ngành về Phụ gia thực phẩm): 0,4m g/k g . V iệt Nam: Im g/k g e. Phươníị p h á p Xíĩc địiili Phương pháp phân tích 3-M C PD ở tất cả các phòiig xét nghiệm được cấp g iấy phép hoạt độn g đểu kiểm nghiệm theo một phương pháp thống nhất: đó là phương pháp Sắc ký k h í/ Khối phổ (G C /M S). 303 Ỉ L 7.2 .2 , M e l a m i n a. K hái niệm M elam in là một bazơ hữu cơ ít tan trong nước c ó cô n g thức hóa học là danh pháp theo lU P A C là l,3 ,5 -tria zin '2 ,4 ,6 -tria m in , khối lượng phân tử 126. ------------------ -------- -------- ----------- '■ NH2 X Meỉamine (M = 126) N M eiam in là trime của cyanam id, g iố n g như cyanam id , phân tử < ủa chúng chứa 66% nitơ theo khối lượng. M elam in được ch u y ển hóa từ cyrom azilỊ trong cơ thể của động thực vật. M elam in kết hợp với axit cyanuric tạo thành m elam in cyanurat. b. ứ n g dụng c ủ a nielamiii và axit cyanuric M elam in được dùng rất nhiều trong cô n g nghiệp sản xuất k eo dán l^ông công nghiệp đổ g ỗ , dụng cụ đựng thức ăn, m iến g ch ố n g ch á y , thuốc trừ sâu, bhân bón. A xit cyaiỊuric là m ột chất c ó cấu trúc tương tự với m ela m in , thường c ó Ịĩiặt trong bột m elam in không tinh khiết. Chất này được Cục Q uản lý thuốc và T liực phẩm Hoa K ỳ (|FĐA) chấp nhận được thêm vào trong Ihức ăn của độn g vật n h » lại. A xit cyanuric còn có trong nước của các hồ bơi được khử IrtỊng bằng dichloroisocyanurat. c. Sựliẩp'tlụi m eìam in và axit cyaniiric ở người D o m elam in được sử dụng rộng rãi trong đời số n g nên n goài v iệc tiệ'p xúc với dư chất nielam in qua đường hô hấp do hậu quả của sự ch u y ển h óa (^flOBiazin (m ột loại thuốcí trừ sâu), con người còn c ó thể bị n gộ đ ộc d o thôi nhiễm m ellỊn in từ các dụng cụ đhứa đựng thức ăn (m à không phải là sự trộn lẫn m elam in vào tlự c phẩm) bởi các tiiực phẩm có chứa axit như nước chanh, nước cam hay sữa djỊng cục, ở nhiệt độ cao. Hàm lượng m elam in được hấp thu qua đường ãn uống từ tất cả các nguồn thôi nhiễm trên ước tính vào khoảng 0 ,0 0 7 m g /k g cân nặng/ngày (O E C D Tổ chức hợp tác và Phát triển kinh tế, 1998). 304 cl. T á c h ạ i c ủ a nìelatìiin M elam in có đ ộc tính thấp, nhim g khi chúng kết hợp với acid cyanuric sẽ gây nên sỏi thận do tạo thành hợp chất không tan m elam in cyanurat. Khi đưa m elam in vào cơ thể có thể dẫn đến tác hại về sinh sản, sỏi bàng quang hoặc suy thận và sỏi thận, c ó thể gây ung thư bàng quang. Trẻ em Trung Q uốc dùng sữa có chứa m elam in đã ch o thấy tác độn g cỉia hóa chất này đới với con người cũng giống với nhiều kết quả thử nghiệm lâm sàng trên súc vật. Một số nghiên cứu trên súc vật cho thấy m elam in c ó khả năng gây ung thư. M elam in không được chuyển hóa và nhanh chóng đirợc đào thải trong nước tiểu với thời gian bán hủv trong huyết tương là 3 giờ. M elam in có độc tính thấp, liều uống gây chết LDsii ở chuột là 3161 m g/kg thể trọng (O E C D 1998). Hiện tại chira có nhiều nghiên cứii về nhiễm độc m elam in ở con người qua đường ãn uống. Các khảo sát trên chuột, chó cho thấy tác hại chủ yếu do nhiễm m elam in qua đường ăn uống là sự hình thành sỏi bàng quang, viêm bàng quang, phì đại bàng quang. Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy m elam in trong nước tiểu của chó và ghi nhận tình trạng tiểu ra máu ở chuột. Phân tích các sỏi bàng quang cho thấy chúng được cấu tạo bởi m elam in và axit uric, hoặc bởi m elam in trong một hỗn hợp protein, axit uric và photphat (O E C D 1999). M elam in không có tác dụng gây độc cho gen ở in vitro lẫn in vivo. Theo nghiên cứu của lA R C (Chi nhánh quốc tế nghiên cứu vể U ng thư) của W HO, m elam in có khả năng sinh ung thư trên các động vật thí nghiệm nhưng chưa có chứiig cứ đầy đủ về khả năng sinh ung thư ở người (lA R C 1999). e. G iới liụii clìo p h ép N gày 1 2 /1 2 /2 0 0 8 , Bộ Y tế V iệt Nam đã ban hành quy định 3 8 /2 0 0 8 -Q Đ B Y T “Q uy định m ức giới hạn tối đa cùa m elam in nhiễm ch éo trong thực phẩm”. T h eo đó, hàm lượng m elam in trong thực phẩm không được vượt quá 2,5m g/k g thực phẩm . R iêng đối với thực phẩm dành cho trẻ em dưới 36 tháng tuổi, không được vượt quá 1,0 m g/k g thực phẩm. G iới hạn trên sẽ được thay đổi khi có cơ sở khoa học về độc tính của m elam in và các chất liên quan do W H O và FA O côn g bố. 305 /. PliươiiịỊ pháp .xác dịiili C ơ quan 1’hanh tra \'à An toàn thực phắm (Í-SIS) thuộc Ỉ3ộ N ô n g nghiệp l ỉoa Kỳ (U SD A ) dã đưa ra phương pháp phân tích xác dịuh cyrom azin và inelaniin trong tế bào động \'ật. Năm 2 0 0 7 , cơ quan PDA của M ỹ dã bắt đầu sử dụng HPLC để xác định m elam in, am inelin, am iĩielid, và axit cyan iư ic c ó trong thực phám. Một sô' phương pháp !;liác được sử dụng là phổ Raman (SER S) hoặc L C /M S /M S ... 11.7.3. NITRIT, NITRAT VÀ SO2 , Nitrit và nitrat chủ yếu dừng tạo màu và giữ ổn định màu trong sản phẩm thịt. SO2 dùng tẩy trắng nước mía trong sản xuất đường, đồn g thời là chất diệt khuẩn. 11.7.4. THỰC HÀNH B à i 6 . X á c đ ịn h 3 -M C P D 1. N guyên tắc Mầu được ch o hấp phụ qua cột extrelut, tiến hành rửa g iả i 3-M C P D bằng dietyl ete. Sau đó ch o tạo dẫn xuất với dung dịch acid to lu en -4 -su lfo n ic trong axeton thành 4 -(clo m ety l)-2 ,2 -d im ety l-l,3 -clio x o la n , phản ứiig này được thực hiện tại 40"C, trong 9 0 phút. Sau đó đo trên m áy sắc ký khí với detector khối phổ (GC/M S). 2. D ụng cụ, tliiêt hi a. Dụng cụ Cân phân tích 10"*g ; Pipet Im l, 2 m l, 3m l, 4m l, 5ml; Bình định mức các loại; ố n g n gh iệm c ó nắp 3m l, Bình cầu cất 250m l; X ylanh , đũa thủy tinh; C ốc thủy tinh 10, 50, lOOml; Phễu lọ c , g iấ y lọc. b. Thiết bị Bộ cất quay chân không ; Hệ thống m áy sắv ký khí khối phổ. 306 lOml; Y êu cầu đối với hệ thống sắc ký khí khối phố (GC7MS): Có thể sử dụng hệ thống Trace G C -Trace M S Pliis (hãng sản xuất Thermo Pinigan) hoặc các hệ thống máy sắc ký khí khối phổ tương đương với cấii hình kỹ thuật tối thiểu: Đ ầu dò khối phổ; Bộ phận tiêm mầu ch ia/ không chia dòng (Split/ Splitless Injector), chương trình nhiệt độ (PTV Injector: Programmed Temperature Vaporation Iiijector); Cột sắc ký m ao quản SPB - 1701, dài 30m , đường kính 0,25m m , lớp film 0 ,2 5 ụ in . Đ iều kiện chạy m áy Đ iều kiện sắc ký: Chương trình nhiệt độ cột: nhiệt đ ộ đầu 45"C ( l phút), sau đó tãng lên 120"C(6'’C / phút), tiếp tục tăng nhiệt độ lên 250"C (1 5 ‘’C / phút), giữ ờ nhiệt độ này 5 phút; T iêm mẫu: với c h ế độ không chia dòn g, nhiệt độ bộ phận tiêm mẫu: 250"C, thể tích mẫu tiêm: 2 |il; Tốc độ khí mang He: 1,5 ml/phút. Đ iều kiện khối phổ M S Tune file: N gu ồn ion hóa: EI; N ăng lượng ion hóa: 70eV ; N hiệt độ nguồn ion: 180‘’C; N hiệt độ Interĩace: 20Ơ ’C, Giá trị của bộ khuếch đại Miiltiplier; 3 0 0 - 5 0 0 V. M S m ethod: C h ế độ quét Piillscan: thời gian quét; 5 - 1 5 phút, khoảng khối quét: 35 - 150 amu; C h ế độ quét ion chọn lọc SIM ( Selected lon M onitoring): số khối lựa chọn dể quét: 135, thời gian quét: 6 - 1 0 phút. 3. H ó a chất, tììitốc thử a. Hoá chất, thuốc thử H óa c h ít sử dụng c ó độ tinh khiết phân tích (TKPT), dung m ôi là dung môi dùng ch o sắc ký. Chất chuẩn 3-M C PD ; Ethyl axetat dùng cho sắc ký; D ieth yĩ ete dùng ch o sắc ký; Natri clorua bão hoà; A ceton dùng ch o sắc ký; Khí nitơ 99,999% ; A cid toluen -4-su lfon ic; Khí heli 99,999% . 307 Cột Extrelut: D ùng xylanh 6 0 m l, nhồi bông thủy tinh vào đầu ố n g xylanh. Sau đó ch o tìr từ lOg hạt Extrelut vào xylanh , dùng đũa thủy tinh g õ nhẹ vào thành ống ch o hạt xu ốn g đều và chạt. b. Pha c h ế dung dịch D ung dịch acid tolu en - 4 - su lío n ic trong A x e to n (I g //): cân chính xác 0 ,1 0 0 0 g axit toluen - 4 - su lío n ic ch o vào bình định mức lOOml, định m ức đến vạch bầng axeton, lắc đểu. D ung dịch chuẩn 3-M C P D lOOppm: cân chính xác 0 ,0 1 0 0 g 3-M C P D ch o vào bình định m ức lOOml, định m ức đến vạch bằng ethyl acetat, lắc đều. D ung dịch chuẩn 3-M C P D lOppm: hút Im l dung d ịch 3-M C P D lOOppm vào bình định mức lO m l, định m ức đến vạch bằng ethyl axetat, lắc đều. D ung dịch chuẩn 3-M C P D 200ppb: hút Im l dung dịch 3-M C P D lOppm vào bình định mức 5 0 m l, định mức đến vạch bằng ethyl axetat, lắc đều. D un g dịch chuẩn 3-M C PD 20ppb: hút 2m l dung dịch 3-M C P D 200ppb vào bình định m ức 2 0 m l, định mức đến vạch bằng ethyl axetat, lắc đều. Các dung dịch chuẩn này được bảo quản trong tủ lạnh. 4. C á c h tiến hành a. Chuẩn bị mẫu Cân 4 g m ẫu, chính xác đến O.OOlg vào cố c thủy tinh 5 0 m l. T hêm vào 8g dung dịch N aC l bão hòa, khuấy đểu. Cho toàn bộ dung dịch trên vào cột extrelut. Đ ể ổn định 15 phút ch o toàn bộ nước và chất trong dung dịch phân bố đều trên bề mặt của hạt cxtrelut. Rửa giải 3-M C P D bằng 150m l d iety l ete. Thu dịch rửa giải vào bình cầu cất. Sau đó đem c ô quay chân không đến gần cạn, rồi dùng khí nitơ thổi khô. b. D ẫn xuất hóa D ùng pipet hút chính xác 2m l dung dịch axit to lu en -4 -siilfo n ic trong axeton (I g //) vào bình cầu cất, lắc đều rồi ch u yển toàn bộ dung dịch này vào ống nghiệm c ó nút. Đật ốn g n gh iệm vào bếp cách thủy ở 40"C trong 9 0 phút, lấy ra để ngu ội ở nhiệt độ phòng, sau đó ch u yển vào chai l,5 m l đ ể đo trên m áy G C /M S (dịch thử). 308 c. Chuấn bị mẫu chuẩn Các mẫu chuẩn theo từng nồng độ xác định được chuẩn bị cụ thể theo các bước trong bảng 1 1 .7 .3 .6 Bảng 11.7.3.6. Chuẩn bị dung dịch 3-MCPD Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Im l 2ml 4ml 6ml 3-MCPD chuẩn (20ppb) cho vào côt extrelut Dung dịch sau rửa giải Dung dịch axit toluen-4sulfonic/axeton (1g/Q Cô quay chân không đến gần cạn, làm khố bằng N, 2 ml Lắc đều, đặt các ống nghiệm vào bếp cách thủy ở 4 0 ° c trong 90 phút.____________________________________ Để nguội ở nhiệt độ phòng, chuyển vào lọ 1,5ml để đo trẽn máy GC/MS 10 3-MCPD chuẩn (ppb) 20 40 60 d. X ây dựng đường chuẩn K iểm tra thiết bị đã được chạy ổn định theo các điều kiện đã được m ô tả, lần lượt tiêm các mẫu chuẩn đã được chuẩn bị ở trên. Ghi lại diện tích pic tương ứng với tìmg nồng độ. Dựa vào nồng độ và diện tích pic chuẩn, thiết lập phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ chuẩn và d iện tích pic. e. T iến hành phân tích T iến hanh tiêm m ẫu phân tích vào m áy, ghi lại sắc ký đồ m ỗi lần tiêm mẫu. Ghi lại diện tích c ó thời gian lưu và phổ khối tương ứng với thời gian luii và phổ khối của chất chuẩn. Dựa vào phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồn g độ chuẩn và diện tích pic, tính nồng độ 3-M C PD c ó trong dịch thử. 5. K ế t I/U C Ỉ Hàm lượng 3-M C P D trong mẫu thử được tính theo c ô n g thức sau: c (ppm ) = C ..V .P m 309 trong đó: c ,; nồng độ 3-M C PD trong dịch thử, ppm; m: khối lượng mầu đem phâii tích, g; V: thể tích cu ối, ml; F: hệ sò pha loãng khi đo (F = l: không pha loãng). B à i 7. X á c địn h m e la m in 1 . Ngitvêii tắc M elam in trong sữa được chiết bàng dung dịch axit tricloacetic ở pH=l-ỉ-2. Dịch chiết sau đó được làm sạch qua cột chiết plia rắn trao đổi cation và phân tích bằng m áy sắc ký lỏng khối phổ (LC/M S/M S). 2. D ụiig cụ, thiết hị M áy sắc ký lỏng gh ép khối phổ LC-M S/M S; Cột sác ký C18 (150m m X 4,6m m X 5 m cm ) và tiền cột C18 (2 0 mm X 3,9 mm X 5 fim) của hãng W aters. Cột sắc ký HILIC (1 5 0 m m X 4 ,6 mm X 5 tim ) và tién cột; M áy ly tâm ; Bộ chiết SPE với hút chân không ; M áy lắc V ortex ; M áy rung siêu âm ; Cột SPE scx 500m g/3m l; Bộ lọc dung m ối sắc ký. Dụng cụ thủy tinh cần thiết; 3. H ó a ^luĩt, ditng m ôi, lliiiấc thử Chất chiiấn m elam in (Dr. Erhentoffer) ; N ội chuẩn C '’N ''-m elam in (Cambridge Isotope) ; A xit pentafloropropionic (PFPA) khi sử dụng cột C 18 ; 310 A xetonitril (M erck); A m o n i hydroxyt; M etanol (M erck); A m on i axetat; Nước cất 2 lần; A x it tricloacetic (TC A ). 4. C á c h íiếỉì lìàtili 4.1. Chuấn bị dung dịch chuấn Dung dịch chuẩn gốc m elam in 100 ịag/inl: câii chính xác: khoảng 10 m g chất c h u án m elam in, hò a lan vào nước, siêu âm cho tan hốt và dịnh r.Tiức đ ến lOOml bằng nước cất. D ung dịch chuấn trung gian m elamin 1 i-tg/ml: hút chính xác Iml dung dịch chuẩn gốc ở trên ch o vào bình định mức lOOml, cỉịiih m ức đến vạch bằng hỗn hợp nước cất. D ung dịch nội chuẩn gốc 100 i-ig/ml: mua từ nhà sản xuất, bảo quản ở 4*’c tránh ánh sáng. D ung dịch nội chuẩn 1 i-ig/ml: hút 0,25 ml dung dịch nội chuẩn gốc 100 Ịig/m l vào bình định mức 25m l, định mức đến vạch bằng nước cất. Dãy dung dịch c h i’ẩn trong bảng 11.7.3.7 phải chuẩn bị mới hàng ngày. Bảng 11.7.3.7. Dây dung dịch chuẩn chạy sắc k;ý Nống độ Dd chuẩn melamin 1ng/ml Nội chuẩn lỊng/ml Nước cất (ppb) (ml) (ml) (ml) 10 10 50 940 20 20 50 930 50 50 50 900 100 100 50 850 200 200 50 750 500 500 50 450 4.2 . Chuẩn bị mầu Cân chm h xác 3 -5 g mẫu đã đirợc đổng nhất vào ống ly tồm , thêm 200|.il dung dịch nội chuẩn l|ig /m l và 20m l dung dịch TCA 1% lác bảng siêu âm 30 phút. Tiếp lục ly tâm 5 phúl với lốc độ 5 000 vòng/phiìl. Tácli lớp irCn và lọc qua giấy lọc. C huyển toàn bộ dịch lọc vào cột SPE s c x 500 mg/3ml (cià được hoạt hóa trước bằng 6m l m etanol và 6m l TCA 1%), rửa bàng 3ml TCA 1% và 3m i Tietanol. Hút khô cột 1 phút. T iến hành rửa giải 2 lần mỗi lan 2nil hỗn Ihợp m etanol/N H 4 0 H (9 5 /5 ). 311 4.3. Đ iều kiện chạy m áy Đ iều kiện LC: Cột: C18 (1 5 0 mm X 4 ,6 mm X 5 Ịim), tiền cột C 18 (2 0 mm X 3,9m m ). - N hiệt độ cột: 30'’C. Pha động: A-dung dịch PFPA 0 ,5 m M ; B -A xetonitril. C hế độ chạy chia dòng: 0 phút: A/B (9 5 /5 ) đến 3 phút: A /B (9 5 /5 ) đến 5 phút: A /B (5 /9 5 ) đến 7 phút: A /B (5 /9 5 ) đến 9 phút; A /B (9 5 /5 ) đến 12 phút; A /B (9 5 /5 ). T ốc độ dòng 0,5 ml/phút. - Cộl: HILIC (1 0 0 m m X 4,6 mm X 5 I^m) và tiền cột. N hiệt độ cột: 30"C. Pha động: A -du ng dịch amoni axetate 2 0 nriM; B -A xetonitril. C hế độ chạy chia dòng: 0 phút: A /B (1 0 /9 0 ) đến 0,5 phút: A /B (1 0 0 /0 ) đến 6 phút: A /B (1 0 /9 0 ) đến 12 phút: A /B (10/90). Tốc độ dòn g 0 ,4 m l/phút. Đ iều kiện khối phổ: N gu ồn ion: ESI (+) 4 0 0 0 V; Cột m a o quản: 2 7 0 " c, 46V ; K hí phun (N 2): 4 0 đơn vị; K hí bổ trợ (N 2): 10 đơn vị; C h ế độ chạy: SIM 127, SRM 127 ^ 85 (CE: 4 0 V ), SRM 127 ^ 68 (CE: 46V ). 4.4. X ây dựng đường chuẩn Lập đường chuẩn dựa vào tỷ lệ diện tích hoặc chiều ca o của pic m elam in chuẩn so với ngoại chuẩn. 4.5. T iến hành phân tích Bơm 2 0 mẫu phân tích vào m áy LC và chạy theo c h ế độ ở trên. Dựa vào đường chuẩn tính nồng độ của m elam in trong dung dịch phân lích. 5. K ết q u ả Hàm luợng m elam in (|ig /k g ) trong mẫu phân tích được tính như sau: x= c V m trong đó: c ,: nồng độ melamin trong dịch phân tích, ppb; V: thể tích dịch phân tích, ml; m: khối lượng mẫu phân tích, g. 312 l ì à i 8. X á c đ ịn h h à m lượng nitrit 1. N g u yên tắc Phương pháp này dựa trẽn việc đo cường độ màu tạo ra khi nitrit tác dụng với suníatnilam it và N -1 naphtyletylendiam indihydroclorua trong dịch lọc không chứa protein. 2. H ó a chất K ali íeroxian u a, dung dịch được chuẩn bị như sau: Hòa tan 106g kali íeroxianua ng'ậm ba phân tử nước (K4[Fe(CN)is]3H20) trong nước cất, đổ nước đến dung tích 1 lít. D ung dịch được bảo quản trong bình thủy tinh sẫm màu. Thời hạn bảo quản không được quá 30 ngày. K ẽm axetat, dung dịch được chuẩn bị như sau: H oà tan 2 2 0 g kẽm axetat ngậm hai phân tử nước [Z n (C H ,C 0 0 )2 .2 H 2 0 ] và 30m l axit axetic băng, thêm nước đến dung tích 1 lít. Thời hạn bảo quản không quá 30 ngày. A xit axetic băng (CH^COOH) Natri tetraborat (borac), dung dịch bão hòa được chuẩn bị như sau: Hòa tan 50g natri tetraborat (N a 2B407.10 H2O) trong 1 lít nước cất ấm. Natri nHrit (N aN O s) A xit clnhydric (H C l) dung dịch 12,50 m ol/ lít; khối lượng riêng l,1 9 g /m l Suníatnilam it (NH2QH4SO2NH2) N - 1 naphtyletylendiam indihydroclorua (CK1H7NHCH2CH2NH2.2 H C l) D ung dịch để tiến hành phản ứng màu. D ung dịch I được chuẩn bị như sau: Hòa tan 2g suníanilam it trong 400m l dung dịch axit clohydric (1 + 1) đổ thêm cùng dung dịch axit clohydric đó đến thể tích 1 lít. D ung dịch II được chuẩn bị như sau: hoà tan Ig N-1 naphtyletylendiam in dihydroclorua trong lOOml nước và thêm nước đến thể tích llít. Cả hai dung dịch trên được để trong tủ lạnh trong bình thủy tinh sẫm màu, nút kín. ở điểu kiện trên dung dịch giữ bền trong 7 ngày. 313 H2SO4, dung dịch 2 ,0 4 m ol/lít (1+4) Kali pecm anganat (KMnO^) dung dịch 0 ,0 2 rnol/lít, (0,1 N ) 3. D ụng cụ, thiết bị Cối nghiền ,m áy trộn hay m áy xay thịt dùng trong sinh hoạt c o đường kính các lỗ dưới không lớn hơn 3 mm; Q uang phổ k ế hay m áy soi màu điện ; Bếp cách thủy ; Bình địiih mức 100, 200, 1000 inl; Bình nón 2 0 0 ml; Pipet 2, 5, 10, 2 0 và 25 ml; Buret 2 và 10 ml; Phễu thủy tinh d= 5 cm; Cân phân tích lO^^g. Ố ng đong 25 và 50 ml; 4. C á ch tiến lìànli a. Chuẩn bị thử Cân lOg lượng mẫu cân, sai số không quá 0 ,0 0 1 g cho vào bình định mức thể tích 2 0 0 m l, thêm 5 ml dung dịch borac bão hòa và 100 ml nước nón g, lắc đều khi các m iếng thịt rã ra rồi đun nóng đồng thời thỉnh thoảng lắc trên bếp cách thủy đang sôi trong 15 phút. Sau khi để nguội bình đó đến nhiệt độ phòng, lại thêm tiếp lần lượt m ỗi loại 2 m l dung dịch kaliíeroxianua và kẽm axetat để kết tủa protein. M ỗi lần cho inột loại dung dịch phải lắc đểu, giữ trong khoảng 3 0 phút ở nhiệt độ phòng, cho thêm nước đến vạch mức, khuấy và lọc qua giấy lọc gấp vào bình tam giác khô. D ịch lọc dùng để xác định hàm lượng nitrit và nitrat. Đ ể xây dựng đồ thị chuẩn, hòi\ tan l.OOOOg natri nilrit với nước trong bình định mức dung tích 100 m l, thêm nước đến vạch mức (dung dịch A ). D ung dịch này chuẩn bị sau khi đã xác định trước hàm lượng natri nitrit trong c h ế phám , phép xác định này được tiến hành như sau: cho lOml dung dịch kali pecm anganai (0 ,0 2 m ol//) đã pha loãng bằng lOml nước và axit hóa bằng 2m l dung dịch axit siinfuric ( 1+ 4 ) được đpm chuẩn độ với đung dịch natri nitrit có chứa 0 ,2 g natri nitrit trong 100 ml dung dịch. Im l dung dịch (0,02 mol/l) kali pecm anganat tương img 0 ,0 0 3 4 5 g natri nitrit. 314 Cho 5ml dung dịch A vào bình định mức dung tích llít và thêm nước đến vạch mức (dung dịch B). Từ dung dịch B chuẩii bị một loạt dung dịch natri nitrit chiiấn. Đ ể chuẩn bị các dung dịch chuẩn này, dùng pipet ch o 5, 10, 2 0 ml dung dịch B Iđn lưđt vào các bình dịnh mức dung tích 100 ml rồi ch o nước đến vạch mức, lắc đều. Các dung dịch này chứa tương ứng 2,5; 5,0 và 10,0 |0.g nitrit trong Iml dung dịch. Từ các dung dịch trên lấv mỗi loại lOml cho vào bình địi.h mức dung tích 100 ml. Dùng nước cất làm dung dịch kiểm tra. Cho vào m ỗi bình dịnh mức 10 ml dung dịch 1, lắc đều và để dung dịch vào ch ỗ tối trong 5 phút. SíUi đó cho vào m ỗi bình 2ml dung dịch II, lắc đều và lại giữ trong chỗ tối từ 3 đến 10 phút. Cho thêm nước đến dung tích 100 m l, lắc đều và đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 53-8nm, so sánh với dung dịch kiểm tra. Dựa vào các giá trị thu được xây dựng đồ thị chuẩn trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ nitrit trong dung dịch đã nhuộm màu, tính bằng ụg/m l. b. T iến hành thử D ùng pipet ch o 25m l dịch lọc chuẩn bị theo mục 4 (hoặc ít hơn nhim g dung tích đo chính xác) vào bình định mức dung tích lOOml, ch o thêm nước đến dung tích xấp xỉ 60m l và lOml dung dịch I, lắc đều, sau 5 phút ch o tiếp 2m l dung dịch II và lại lắc đều. Sau m ỗi lần cho một loại dung dịch thì đặt bình vào ch ỗ tối. Sau 3 đến 10 phút ch o thêm nước đến 100 rnl, lắc đều và đo mật độ quang như mục 4. 5. K ế t aiúi Hàm lượng nitrit (X ), biểu thị bằng sô' m iligam Iiatri nitrit trong 1 kg sản phẩm, ttược tính th eo cô n g thức sau : x =c* 20000 m *v trong đ ó ; C; nồiio độ natri nitrit, đọc được trên đồ thị chuán tương ứng với mật độ quang của dung dịch mẫu thử, ụg/m l; 315 m: khối lượng m ẫu, g; V: thể tích dịch lọ c, dùng cho phản ímg so m àu. m l. B à i 9. X á c đ ịn h h à m lư ợng n itra t 1 . Ngiiyéit tắc Phương pháp dựa trên việc khử nitrat thành nitrit bằng cột ca d im i, đo trác quang cường độ màu tạo thành khí suníanilam it và N-1 naphtyletylen díam indihydroclorua tác dụng với nitrit và xác định lượng nitrit đê tính ch u yển ra nitrat sau khi đã trừ đi lượng nitrit chứa trong sản phấm. 2. H ó a chất Cadim i suníat (CdS0 4 .8H 2 0 ); D ung dịch được chuẩn bị như sau: H oà tan 37g cadim i siinfat ngậm 8 phân tử nước trong nước và thêm nước đến 1 lit. Dinatri etylen diam in tetraaxetat (d i-N a-E D T A ) [C H 2N (C H 2C 00H )C H 2C 00N a]2.2H 20 Natri nitrit (N aN O s) K ali nitrat (K N O ,) D ung dịch đệm c ó pH từ 9 ,6 đến 9,7 được chuẩn bị như sau: 2 0 m l axit clohydric, 12,50 m o l// (l,1 9 g /m l), pha loãng bằng nước đến 500m l; s-^.u khi khuấy đều ch o thêm lOg [C H 2N (C H 2 C 0 0 H )C H 2 C 0 0 N a ]2 .2 H 2 0 , và 5 5m l am oniac 17,75m ol// (0 ,8 8 g/m l). D ung dịch được thêm nước đến llít và chuẩn độ pH. K ẽm thanh. T huốc thử và dung dịch chuẩn bị theo bài trên 3. D ụng cụ, thiết bị 316 M áy trọn; Pipet; T hiết bị kết tinh; Cột thủy tinh (x e m hình vẽ); Cột để khửni trat Hình 11.7.3.9. Cột thủy tinh: 1- binh chứa 50ml ; 2- nút; 3- lớp cadimi ; 4- bình thủy tinh; 5- ống caosu. 4. C á ch tiến hành a. Chuẩn bị thử C ho 5-7 thanh kẽm vào cốc có chứa sẫn lOOOml dung dịch cadim i sunfat. Khi cadim i tạo thành bám vào thanh kẽm , gạt cadimi vào cốc khác. Cadim i thu được đem rửa 2 lần bằng Ilít nước, sau đó dùng 400m l dung dịch axit clohydric 0,1 m ol// ch u yển cad im i vào m áy trộn, nghiền trong 10 giây. C huyển tất cả từ m áy trộn sang c ố c phân tích, để lắng, thỉnh thoảng khuấy bằng dũa thủy tinh. N gày hôm sau khuấy m ột lần nữa để bọt khí lên. Chắt chất lỏng ra sau đó rửa cadim i 2 lần bằng Hít nước. Đ ể m ột m iếng bông thủy tinh vào dáy cột thủy tinh đã nút sẩn một đẩu ống, sau đó ch o cadim i vào cột bằng cách đố cùng với nước đến khi được một lớp cao khoảng 17cm , thinh thoảng vặn cho nước chảỵ ra nhimg không được để lớp cadim i bị lộ ra. Rửa cộ t cadim i lần lirợt bằng 25m l axit clohydric 0,1 m o l// và 50m l dung dịch đệm am oniac đã hòa tan với nước theo tỷ lệ 1+9. Tất cả các chất lỏng trên, được đưa vào qua bình chứa 1. Đ ể kiểm tra khả năng khử của cột cadim i, cần chuẩn bị các dung dịch sau: D ùng nước hòa tan 1,4 6 5 g kali nitrat đã sấy khố đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 103"C trorg bình định m ức dung tích lOOml, đổ nước đến vạch mức (dung dịch B). Lấy 5m l dung dịch B ch o vào bình định mức dung tích 1000 ml và đổ nước cho đến vạch (dung dịch C). D ung dịch c có chứa 73,25 Ị.ig/ml kali nitrat. Cho vào bình 317 chứa đồng thời dung dịch c và 5 ml dung dịch đệm , sau đó rừa thành bình bằng nirớc hai lần, m ỗi lẩn 15 ml và cho thêm nước vào bình chứa, dịch rửa giải tìr cột lấy vào bình định mức dung tích 100 m l, tốc độ chảy của dịch rửa giải không được quá 3 ml/phíit. Sau khi lấy được khoảng lOOml dịch rìra giải, lấy bình ra đổ nước cho đến vạch rồi lắc dều. D ùng pipét lấy 10 ml dịch rửa giải ch o vào bình định mức dung tích 100 m l, sau đó tiến hành như chỉ dần ở điều 4 của bài trên. N ếu nồng độ của nairi nitrit (tính theo đồ thị chuẩn) nhỏ hơn 0,9|.ig/m l thì cột đó không dùng được. Cadim i trong cột này phải được giữ dưới dung dịch axit clohydric 0,1 m ol//. Khả nãiig khử cùa cột cadim i phải được kiểm tra cho từng loại m ẫu thử. b. T iến hành thử Cho vào bình chứa đồng thời 20 ml dịch lọc được chuẩn bị th eo điều 4 bài trên và 5m l dung dịch đệm . Rửa thành bình hai lần bằng nước, m ỗi lần 15m l, cho đẩy nước vào bình. Thu eliiat vào bình định mức dung tích lOOml. Đ ổi với m ỗi loại thử đều tiến hành phép thử kiểm tra bằng cách ihay dịch lọc bằng nước. Hàm lượng natri nitrit được xác định theo điều 5 bài trên. 5. K ế t cntủ Hàm lượng nitrat (X |), biểu thị bằng số m g kali nilrat trong Ikg sản phẩm, được tính theo côn g thức sau: í X, = 1,465* m, * v , trong đó: C: nồng độ nitrit, đọc được trên đổ thị chuẩn, tương ứng với mật độ quang của dung dịch, ịig! ml; m,: khối lượng mẫu. g; V ,: thể tích eluat, dùng cho phản ứng so màu. mí; X: lượng nitrit, xác định trong cùng mẫu thử đó theo bài trên, m g/k g. 318 Màm luợng nitrat được biểu thị bằng kali nitral có thể tính chuyển sang natri nitrat và ngược lại như sau; N aN O , = 0 ,8 4 K N O , K N O ,= 1,19 N aN O , Bài 10. X á c đ ịn h d ư lư ợng so, Ị . N guyên tắ c C huyển anhydric sunfurơ (SO2) tự do và kết hợp sang dạng m uối natri sau đó chuẩn bằng iod. So sánh với mẫu đối chứng có íorm aldehyt kết hợp với SO2. 2. H ó a chất Natri cloriia, dung dịch 10%; Porm aldehyt, dung lốt, dung dịch 0,02N ; A xit clohydric 6 N; Hồ tinh bột, dung dịch 0,1%; Natri hydroxit IN; dịch 40%; D ung dịch đệm có pH 4,2- 4,6: Hoà tan 11,87 g Na^HPO^^HÔ vào llít nước được dung dịch 2 /15 N. H oà tan 9 ,0 7 8 g K H 2PO4 vào 1 lít nước, được dung dịch 1/15 N. Trộn đểu 0,1 phần dung dịch 2 /1 5 N với 9,9 phần dung dịch 1/15 N được 10 phần dung dịch đệm. 3. Ditng cụ, thiết bị Cân phân tích lO^g; ố n g đong 5, 10, lOOml; Bình định m ức 250m l; Biiret 25nil. Bình tam g iá c nút mài 250m l; 4. C á ch tiến hành 4.1. Đ ối với các mẫu ở dạng rắn, đặc Cân 25 g m ẫu, chính xác đến 0,001 g, chuyển toàn bộ vào cối nghiền bằng 9 0 - 100 ml natri clorua 20% , thêm 5m l dung dịch đệm , nghiền toàn bộ hỗn hợp trong cối vào bình định mức 2 5 0 m l, tráng cối nhiều lần bằng NaCl 20% và định mức tới vạch, lắc kỹ, lọc. D ùng pipet hút vào 2 bình tam giác m ỗi bình 50 ml dịch 319 lọc thêm vào m ỗi bình 2 ml HCl 6 N , thêm vào bình số hai 2 m l form aldehyt 40% . Chuẩn độ 2 bình bằng dung dịch iod 0 ,0 2 N với 1 ml chì thị hồ tinh bột. 4.2. Đ ối với mẫu ở thể iỏng Hút vào 2 bình tam giác, m ỗi bình 50m l m ẫu, 2 m l N aO H IN rồi làm tiếp như điều 4.1 5. K ế t quả Hàm lượng anhydric suníiirơ (X ) tính bằng % th eo cô n g thức; ^ ^ _ (V,-V,).0.00064.V m.v„ trong đ ó : V(|- thể tích dịch lọc lấy chuẩn độ, ml; V - thể tích bình định mức pha loãng m ẫu, ml; V |- thể tích dung dịch iod 0 ,0 2 N dùng chuẩn bình thứ nhất, ml; V ị- thể tích dung dịch iod 0 ,0 2 N dùng chuẩn bình thứ hai c ó form ald eh yt, ml 0 ,0 0 0 6 4 - lượng SO2 tương ứng với Im l dung dịch iod 0 ,0 2 N , g; m - khối lượng mẫu cân, g. 320 TÀI LIỆU THAM KHẢO ■ Bộ N ông nghiệp và Phát triển nông thôn (2003). Tuyển tập tiêu clniẩii nông nghiệp Việt NíHìu tập 4, 5. 6 , Hà Nội. Bộ Y tế (2 0 0 3 ). Q u y định b ổ sung vi chất dinh dưỡng vào thực ph ẩ m . Ban hành kèm theo Q uyết định sô' 6289/2003/Q Đ -B Y T ngày 9 tháng 12 năm 2 0 0 3 của Bộ trưởng Bộ Y tế. Hoàng M inh Châu, Từ Văn M ặc, Từ V ọng Nghi (2002). C ơ s ở lìoá học pìiăn tích. N X B Khoa học và K ỹ thuật. N guyền Hữu Chấn (2 0 0 0 ). N hững vấn đê' lioá sinh học hiện d ạ i. N X B K hoa học và Kỹ thuật. N guyễn Thị H iền và cộ n g sự (2007). K hoa học - Công nghệ M a lt và Bia. N X B Khoa học và Kỹ thuật. N guyễn C ông K hẩn & Hà Huy Khôi (2007). Chityéu tiếp dinh dưỡng ở V iệt N am. Tình hình dinh dưỡng \’â clừến lược can thiệp Ở V iệt Nam. N X B Y học. Từ Vãn M ặc và c ộ n g sự (2 0 0 3 ). Phân tíclì lioú lý: phương p h á p p h ổ Iigliiệin nghiên cứu cấu trú c p h â n tử. N X B Khoa học và Kỹ thuật. Lê Thanh M ai và cộ n g sự (2 0 0 5 ). C ác phương p h á p phún tích ngành công nghệ lên men. N X B K hoa h ọc và K ỹ thuật. N guyễn V ăn M ùi (2 0 0 1 ). Thực hành hóa sinh học. N X B Khoa học và K ỹ thuật. T ổng cục T iêu chuẩn - Đ o lường - Chất lượng (2008). Danh m ục tiêu chuẩn quốc gia - T C V N 2 00 8. Lê N gọc T hạch (2 0 0 3 ). Tinh dầu. N X B Đại học Q uốc gia 'IP. H ồ Chí Minh. Phạm Trương Thị T họ (2 0 0 1 ). G iá o trình lioá học rác' hợp ch ấ t tự Iiliiéii. N X B G iáo dục. Lâm Xuân Thanh (2 0 0 4 ). G iá o ràiilì C ông nghệ các sản p h ẩ m sữa. N X B Khoa học và K ỹ thuật. N gu yễn Đ ìn h Thưởng và cộn g sự (2000). Công nghệ sản x u ấ t và kiểm tra cồn etylic. N X B K hoa học và K ỹ thuật. 321 Đặng Thị Thu, N gu yền Thị Xuân Sâm, T ô Kim Anh (1 9 9 7 ). T h í nghiệm hóa sinh công nghiệp. Trường Đ H Bách Khoa Hà N ội. Lê N gọc Tú và cộn g sự (2 0 0 0 ). H oá sinh công nghiệp, N X B K hoa học và Kỹ thuật. Lê N gọc Tú và cộn g sự (2 0 0 1 ). H oá học thực p h ẩ m , N X B K hoa học và Kỹ thuật. Hà D uyên Tư (2 0 0 6 ). K ỹ tìiiiật plìáii tích cả m quan thực p h ẩ m , N X B Khoa học và Kỹ thuật. Hà D uyên Tư (2 0 0 6 ). Q uản lý chất lượng trong công n g h iệp thực p h ẩ m . N X B Khoa học và Kỹ thuật. Lê Bạch T uyết (2 0 0 0 ). Kiểm tra vờ quản lý chất lượng nhà m á y cíườiig. Chương trình M ía Đường Đ H Bách Khoa. V iện Dinh dưỡng (2 0 0 1 ). Chiểu lược quốc g ia dinh dưỡng. N X B Y học. Phạm Hùng V iệt (2 0 0 3 ). C ơ s à lý thuyết của phư ơng p h á p sắ c k ỷ khí, N X B Khoa học và K ỹ thuật. A F N O R -D G C C R F (1 9 8 9 ). C oiitrôle d e la qu a lité cles p r o d iiits alim eiitaires. M éth odes d 'analyses officielles. A nalytica M icrob iologica, EBC, Bios, V ol 8, N o 4 , 1977. Ann-Charlotte E liasson (2 0 0 6 ). C iirb oh ydra tes in F o o d , Second ed ition . U SA . A O A C (2 0 0 0 ;. O fficial M etliods. AOCS (1 9 9 7 ). OịỴiciaỉ m elhods a n d r e c o m m e iìd e d p r a c ti c e s o f the A O C S , 5th edition. Badal. c . Saha, Shelby. N. Freer, R odney. J. Bothast (1 9 9 4 ). Procìiiciioii, piirificafioii, aiưl p r o p e r tie s o f a Th erm ostable /3-glt(cosidase f r o m a c ơ lo r V ariant Straiii o f A u reo b a sid iu m piilỉitlans. A pplied and E nvironm ental M icrob iology, pages 3 7 7 4 -3 7 8 0 . c . B. Spricigo, A . B olzan, L. T. Pinto (2 0 0 1 ). M a tlie m a tic a l m o d e lin g o f initmeg essential oil extraction b y Uqiiid cơrbon dioxide. Latin A m erican A pplied R esearch 31: 397-401. 322 Carolyii Pisher & T hom as Scott (1998). F ood Pldvor, lỉiừlogỵ a n d C lìem isírỵ. The Royal Society o f C hem istry. Ernest Gucnther. T h e essentÌLil oil, V oliim c 4, ỉiidividiiíil Es.seiitiaỉ oils o f llie plaiìt /aiììilies. Robert E. K rieger Publishing Company, Malabar, Plorida. E vgiienie G eorgu iev (1 9 9 5 ). Công nghệ các chất thơm tỏ'ii,í> hợp \'ù lự nliiéiì. N X B Zem izdat (Sách tiếng Bulgaria). R IPAC (1 9 8 7 ). Staiidai d nieìliocừ f o r llie íiiialyỵis o f o iìs ,f a ís a n d d eriva tives, 7th edition. J.L.M iilton (1 9 9 1 ). T ec lm iq iie s d'íiiiíil\se et de controlc clưiis les indiistries agroalÌDieiiíiares, V olu m e 1, V olum e 2, V olum e 4. Lavoisier-Tec& D oc. Jam es c .p C H E N & C hung Chi CHOU (1993). Caiie Sỉigar H aiu lbook (1 ,2 ). N ew York. R. M. F. V a r g a sl, E. C a ss e ll, G. M. F. G o m esl, L. G. s. L o n g h il (2006). S u p ercritica l e.xtractioii o f C arqu eja essential oil: Experim ents a n d inocleliiig. Brazilian journal O f ch em ical Engineering vol. 23, no. 03, pp. 375 - 382. Richard M olard D. & L esaga L. (1985). F ood M icìo b io ỉo g y a n d w a te r activity. Centre de R ech erch es en A gro-A lim entaire de Nantes, Prance. R odney F. B oyer (1 9 9 3 ). M o d en i Experimentaỉ hioclieriiistry, Second edition. C alifornia, 1993. R oy T eraiiishl, E m ily L. W ick , Irvvin Hornstein (1998). Plcivor C ìiem istry - Thisty years o f Progress. K liiw er A cadem ic, Plenum Piiblislier. W H O (2 0 0 1 ). N u tritioii f o r lieallli and deveỉopmcnt. 323 [...]... nhữiig trường hợp này, các phương phitp phòng thí nghiệm có thể đirợc sử dụng nếu như đã qua kiểm định 1 1 2 4 ÁP DỤNG CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH I G íc jphircfng pháp phân tích truyền thống như phân tích trọng lirợiig và hóa học vẩn đ ifỊjt sử dụng trong các phân tích thực phẩm Tuy nhiên khi phân tích các hợp chất V(Ề hàm jirợng thấp và cần độ chính xác cao thì các phương pháp ịỊhân tích bằng cơng cụ ngày... với phân tích các hợp chấl khồng phân cực Tuy nhiên có thể dẫn xuất hóa các hợp chất phân cực trước khi đưa vào phân tích bằng sắc ký khí Ngược lại HPLC phù hợp với các phân tích axit amin, peptid, đường và vitamin • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Ngày nay, HPLC là thiết bị phân lích thực phẩm phổ biến nhất trong sơ' các kỹ thuật phân tích hiện đại HPLC được dùng trong phân tích các cấu tử thực phẩm. .. an tồn cho sản phẩm thực phẩm • Các loại độc tố khác Các độc tơ' trong thực phẩm còn có ngun nhân từ phụ gia như phụ gia tạo màu, tạo vị, các chất bảo quản, các chất tẩy trắng, tẩy rửa, diệt khuẩn, đặc biệt là các chất sinh ra trong q trình chế biến hoặc các chất bổ sung để cải thiện một tính chất nào đó nhưng lại có tính độc (như 3-MCPD, melamin) 1.2 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC THỰC PHẨM Lấy mẫu và... nhiều kỹ thuật phân tích thực phấm dựa trên ngun lý sắc ký, quang phổ, vật lý và sinh học 20 1.2,4.ỉ Các phuơtỉg pháp phán Ííclì hóa học Nhóm các phương pháp hỏa học chủ yếu clựa trên các pluiiì ứng hóa học và những dụng cụ thiết bị đơn gián đế phán tích các chất Các phương pháp này ra dời sớm, thường được dùng đế xác dịnh nhimg lượng lớn, iượng vừa và lượng khơng q nhỏ ệẩc chất LẬÂ.2, Các kỹ thuật... riít ngắn thời gian phân tích; -| tình trạng kỹ thuật: phương pháp chính thức, phương pháp ^hòiig thí nghiệm Các phương pháp chính thức đã được phát triển và nghiên cứu hồn thiện đê so sánh giỊía các phòng ih í nghiệm Các phương pháp chính thức bao gồm các phương phập tiêu chn như TC VN , ISO, A O A C , A A C C , và AOCS Tuy nhiên nhiổu kỹ thuậi phan tích khơng phải là các phương pháp tiêu chuẩn vì... quan trọng và phụ thuộc vào bản chất của hỗn hợp chất cần phán tích Để chọn được một phưcmg pháp phân tích tối ưu, người ta tiến hành nhiều các thí nghiệm với các điều kiện khác nhau để chọn ra được điều kiện phân tích có khả nãng tách tốt nhất • Sắc ký k h í (GC) Trong sắc ký khí pha động là chất khí hoặc hơi có nhiệm vụ đưa các phân tử chất phân tích đi qua cột Các chất khí sử dụng là khí hydro, nitrogen,... PHẨM Lấy mẫu và lựa chọn quy trình phân tích là quan trọng nhất trong phân tích thực phẩm Quy trình phân tích thường được tiến hành như sau: lấy mẫu (thu thập, bảo quản), xử lý mẫu (chiết, làm giàu, tách và làm sạch), phân tích định tính và/hoặc định lượng (sử dụng các kỹ thuật khác nhau như sắc ký, phổ) 1.2.1 LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU Bước đầu tiên trong phân tích thực phẩm là lấy mẫu Mẫu được lấy ngẫu... trong hầu hết các loại thực phẩm Thực phẩm chứa nhiều Na và K là bánh mì, thịt, sữa, khoai tây, cà chua - M a n g ie có nh iề u trong thực p h ẩ m Iiguồn g ố c thực vật n h ư cacao, ngũ cốc - Canxi là chất khống có tỷ lệ cao nhất trong cơ thể Ngồi các chất vơ cơ ở mức đa lượng trên đây trong thực phấm còn chứa một số chất vơ cơ ở mức vi lượng nhimg rất cần thiết cho hoạt động của cơ thể Các chất này giúp... phép phân tích mà kết quả thu được lại hồn lồn khơng 24 mắc sai số, mặc dù mọi cố gắng thực hiện các phép phân tích sao cho sai số nhỏ nhất Vì vậy trong phàn tích việc đánh giá các kêì quả là một trong những bước khơng ihể ihiếii dược của các q trinh phân tích Xử lý số liệu phân lích cho phép ta loại bỏ được các sai số của phép đo, phép phân tícli Ịựà thu đ ư ợ c ^á ^ ket q^Liả với độ tin cậy cao Các. .. hoạt động cỉia tim, của các cơ bắp và lăng cường sự hơ hấp - Phenol thực vật là một nhóm hợp chất hữu cơ có màu sắc, m ùi, vị đặc trưiig cho sản phẩm V ị đắng của hợp chất phenol trong một số sản phẩm có tác dụng nâng cao giá trị cho sản phẩm Trong q trình chế biến hợp chất phenol biến đổi tạo màu đặc trưng cho một sổ sản phẩm • Chất khống Trong thực phẩm, chất khống có hàm lượng khơng lớn nhưng có ... định nhiệt độ cao COiìg có ihể dùng bình có kíclì ihirớc hộp Petri có hai khoang: khoang dặi mầu vặi dịnlì xác định a,,., khoang ngồi dựng dung dịch muối bão hồ Bảng 2.3.2a Giá trị hoạt độ nước (ở... gluxit tổng số số thực phẩm Nhóm lương thực 74,9 76,2 70,0 36,4 28,5 Gạo nếp Gạo tẻ Ngơ Sắn tươi Khoai lang • Hàm lượng (%) Nhóm đậu, Đậu Hà Lan Đậu cơve Đậu xanh Chuối tiêu Gấc Hàm lượng (%) 50,0... nhóm, nhóm tan nước nhóm tan chất béo Vitam in có nhiều loại thịt, cá, trứng, sữa, lương thực, rau hoa Hàm lượng sơ' vitam in thực phẩm cho bảng 1.3 14 Báng 1.3 Hàm lượng vitamin số thực phẩm Thực

Ngày đăng: 09/10/2015, 07:10

Xem thêm: Các phương pháp phân tích chất lượng thực phẩm, Các phương pháp phân tích chất lượng thực phẩm

Các phương pháp phân tích chất lượng thực phẩm

Thông tin tài liệu

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan