Công thức Hãng sản xuất Khối lượng mol M Độ tinh khiết Nhiệt độ sôi Tỷ trọng (CH3)3COCH2CHOHCH2OH Sigma Aldrich 148 g/mol ≥97% 265,61 °C 1 g/mL at 20 °C 3.1.2. Dụng cụ 3.1.2.1. Cân phân tích
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 51
3.1.2.2. Micropipet
Sử dụng 2 micropipet để lấy chính xác lượng mẫu đem phân tích: Loại 1000 µl
Loại 100 µl
Hình 17: Micropipette loại 1000µl và 100µl
Chú ý trong việc sử dụng Micropipet có 2 nấc:
Nấc hút dùng để lấy chính xác thể tích mẫu theo con số cài đặt trên Micropipet Nấc đẩy dùng để đẩy toàn bộ mẫu vào lọ (Vial) đem đi phân tích.
Mỗi đầu tip chỉ sử dụng một lần để lấy cho 1 mẫu để đảm bảo chính xác và không lẫn tạp chất.
Xoay núm vặn để điều chỉnh thể tích hút một cách chính xác.
3.1.2.3. Bình định mức 25ml
3.1.2.4. Lọ (Vial) 2ml
Là các lọ nhỏ bằng thủy tinh dùng để dựng mẫu đem đi phân tích GC/MS Trên nắp lọ có 1 lớp đệm cao su để kim lẫy mẫu có thể đi xuyên qua.
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 52
Hình 18: Bình định mức 25ml và lọ (Vial) 2ml
Hình 19: Lọ đựng mẫu đặt trên khay chứa.
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 53
Hình 20: Hệ máy GC/MS tại phòng thí nghiệm CN Lọc hóa dầu và VLXTHP
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 54
Hình 22: Kim bơm mẫu thiết bị GC-MS
3.2. Kỹ thuật lẫy mẫu
3.2.1 Chọn chất nội chuẩn
Để sửa lỗi có thể xảy ra khi khối lượng tiêm khác nhau hoặc điều kiện sắc ký thay đổi chút ít giữa các lần chạy, phương pháp nội chuẩn có thể được sử dụng. Trong phương pháp này, một chất nội chuẩn có tính chất hóa học tương tự như hóa chất cần phân tích định lượng và có peak tách biệt với các chất có trong dung dịch mẫu, được thêm vào một lượng không đổi cho tất cả các mẫu phân tích.
Các tính chất nội chuẩn lí tưởng đước tóm tắt trong bảng 3.1. Hầu như không có chất nội chuẩn nào đáp ứng được đầy đủ những tính chất đó mà chỉ có thể gần đạt đến yêu cầu khi chúng có tính chất tương tự với chất được xác định.
Các chất được dùng làm chất nội chuẩn gồm có các chất có cấu trúc giống nhau nhưng thành phần khác nhau một nguyên tố, chất đồng đẳng, chất đồng phân, chất đồng phân hình học, chất đồng vị của chất phân tích. Vì các chất có cấu trúc giống nhau nhưng thành phần khác nhau một nguyên tố hoặc chất đồng đẳng rất có sẵn nên được sử dụng nhiều hơn so với các chất khác. Các chất nội chuẩn đồng vị thường được dùng trong phương pháp sắc kí khí khối phổ vì phương pháp này có thể phân biệt được khối lượng của chất phân tích và chất nội chuẩn.
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 55
Bảng 9: Các tính chất cần thiết của một chất nội chuẩn lí tưởng
STT Tính chất
1 Chất nội chuẩn càng giống với chất phân tích về thành phần hóa học và vật lí càng tốt
2 Chất nội chuẩn không có trong thành phần mẫu
3 Chất nội chuẩn phải được kết hợp với nền mẫu như chất phân tích
4 Chất nội chuẩn và chất phân tích phải được phân giải bằng sắc kí đến đường nền (ngoại trừ các mẫu đồng vị được xác định bằng sự phân biệt mảnh phổ hoặc phóng xạ, rửa giải ra rất sát nhau, tương thích với hệ thống phân tích và có nồng độ tương đương.
Chất nội chuẩn được sử dụng là Đietylen Glycol Mono Butyl ether. Có công thức:
Là một tạp chức có 2 chức ete và 1 chức rượu.
3.2.2. Lấy mẫu
3.2.2.1.Mẫu từng hóa chất sử dụng riêng biệt
Để xác định đặc trưng sắc ký đồ của từng chất riêng biệt, trong đó quan trọng nhất là thời gian lưa của peak phục vụ định tính và định lượng. Lần lượt lấy mẫu từng hóa chất riêng biệt pha với dung môi Acetonitrile cho vào Vial (lọ) theo các bước:
Bước 1: lấy 50 µl mẫu chất bằng micropipet cho vào lọ 2 ml.
Bước 2: lấy 1000 µl dung môi cho vào lọ, đậy nắp lắc đều cho hòa tan hoàn toàn. Thực hiện với các mẫu:
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 56 Dung môi Acetonitrile
TBA và dung môi Glycerol và dung môi
3.2.2.2.Mẫu nguyên liệu
Nguyên liệu sử dụng gồm Glycerol và TBA theo tỷ lệ G/T = ¼ trong đó TBA được lấy dư cho phản ứng.
Bước 1: Lấy 30 ml Glycerol và 157 ml TBA bằng ống đong cho vào cốc thủy tinh. Bước 2: Khuấy trộn đều nguyên liệu bằng máy khuấy từ trong 15 phút
Bước 3: Dùng Micropipet lấy chính xác 1 ml hỗn hợp nguyên liệu đã khuấy trộn đều đem cân bằng cân phân tích, ghi lại khối lượng mẫu nguyên liệu ms0
Bước 4: Định mức mẫu nguyên liệu bằng dung môi Acetolnitrile bằng bình định mức 25ml thu được dung dịch St0
Bước 5: Lấy 1ml dung dích St0, bổ sung 20µl nội chuẩn DGBE cho vào Vial (lọ) 2ml để phân tích GC-MS.
3.2.2.3.Mẫu sản phẩm
Sản phẩm sau phản ứng được cân để kiểm tra bảo toàn khối lượng, đảm bảo không có cấu tử nào mất mát khỏi hỗn hợp phản ứng. Sau đó tiến hành lấy mẫu sản phẩm gồm các bước:
Bước 1: Dùng Micropipet lấy chính xác 1ml sản phẩm, đem cân bằng cân phân tích, ghi lại khối lượng ms1
Bước 2: Định mức mẫu sản phẩm bằng dung môi Acetolnitrile bằng bình định mức 25ml thu được dung dịch St1
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 57 Bước 3: Lấy 1ml dung dích St1, bổ sung 20µl nội chuẩn DGBE cho vào Vial (lọ) 2ml để phân tích GC-MS.
3.2.3. Bảo quản mẫu
Sản phẩm sau phản ứng đựng trong bình thủy tinh tối màu, nút kín và để trong tủ lạnh.
3.3.Định tính và định lượng bằng GC – MS
3.3.1. Định tính.
Dựa trên kết quả sắc ký đồ của các mẫu đem phân tích, ta có thể định danh các chất có mặt trong sản phẩm dựa vào kết quả mảnh khối tương ứng của peak các chất đó.
3.3.2. Định lượng Glycerol bằng phương pháp lập đường chuẩn phân tích
Hình 23: Sơ đồ khối quá trình lập đường chuẩn và định lượng
Giá trị R2 đảm bảo nằm trong giới hạn cho phép, nếu vượt quá cần phải chuẩn bị lại đường chuẩn.
Ai diện tích peak của cấu tử cần phân tích trong dung dịch chuẩn Acsi diện tích peak của cấu tử IS tương ứng trong dung dịch chuẩn Cx lượng cấu tử cần đo có trong dung dịch chuẩn (đơn vị khối lượng)
R2 : hệ số tương quan (tính toán cho từng chất ở trong đường chuẩn , hệ số này cần càng sát 1 để giảm thiểu sai số.)
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 58 Lập các đường chuẩn riêng rẽ đối với một cấu tử trong hỗn hợp bằng cách tiêm những thể tích bằng nhau của một loạt dung dịch chất chuẩn có nồng độ khác nhau. Như vậy một loạt các nồng độ của các chất chuẩn đã được phân tích và diện tích của chúng được xác định. Một đường chuẩn được dựng cho mỗi cấu tử với một trục nồng độ và trục kia là diện tích tương ứng để kiểm tra sự tuyến tính của đáp ứng của detector.
Tiêm cùng thể tích của mẫu có các cấu tử cần phân tích và phân tích sắc kí trong cùng điều kiện như khi phân tích chuẩn. Từ các diện tích thu được của các cấu tử cần phân tích và đường chuẩn vừa thiết lập suy ra được nồng độ của chúng.
Ở đây phản ứng ete hóa sử dụng dư TBA, độ chuyển hóa được tính theo Glycerol nên tiến hành lập đường chuẩn theo glycerol.
Tiến hành pha các dung dịch Glycerol theo nồng độ tuyến tính giảm dần và phân tích GCMS. Cách pha và nồng độ Glycerol của các mẫu được trình bày như sau:
Bước 1: cân chính xác lượng Glycerol mG = 0.5 g cho vào bình định mức 25 ml Bước 2: định mức bằng dung môi AcetoNitrile đến vạch 25 ml thu được dung dịch S1 Bước 3: tiến hành pha các mẫu dung dịch với nồng độ chính xác được cho trong bảng sau:
Bảng 10: Các mẫu dùng để xây dựng đường chuẩn Glycerol
Mẫu Thể tích (µl) Lượng Glycerol
(mg/ml mẫu) S1 Dung môi Tổng T1 1000 0 1000 20 T2 500 500 1000 10 T3 250 750 1000 5 T4 125 875 1000 2.5 T5 60 940 1000 1.2 T6 30 970 1000 0.6
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 59
3.3.2. Định lượng Glycerol bằng phương pháp nội chuẩn
3.3.2.1.Xây dựng đường chuẩn
Pha các hỗn hợp có tỷ lệ trọng lượng của G (glycerol) và S (chất nội chuẩn) biết trước, chạy sắc kí, đo diện tích các peak, lập tỉ số diện tích tương ứng, cuối cùng lập đường chuẩn tương đối.
Bước 1: cân chính xác lượng Glycerol mG = 0.5 g cho vào bình định mức 25 ml Bước 2: định mức bằng dung môi AcetoNitrile đến vạch 25 ml thu được dung dịch SI1
Bước 3: tiến hành pha các mẫu dung dịch với nồng độ chính xác được cho trong bảng sau:
Bảng 11: Các mẫu dùng để xây dựng đường chuẩn Glycerol với chất nội chuẩn
Mẫu Thể tích (µl) Lượng
Glycerol (mg/ml mẫu)
SI1 Dung môi Chất nội
chuẩn Tổng TI1 1000 0 20 1020 19,60784 TI2 500 500 20 1020 9,803922 TI3 250 750 20 1020 4,9019608 TI4 125 875 20 1020 2,45098 TI5 60 940 20 1020 1,176471 TI6 30 970 20 1020 0,588235
3.3.2.2. Định lượng Glycerol và tính độ chuyển hóa cho mẫu
1. Định lượng
Căn cứ vào diện tích peak của Glycerol thu được trên sắc ký đồ của các mẫu riêng biệt nội suy ra nồng độ tương ứng của Glycerol có trong mẫu theo 2 phương pháp là đường chuẩn và nội chuẩn.
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 60
2.Xác định độ chuyển hóa của phản ứng
Độ chuyển hóa được tính theo Glycerol: (X(G)%) được tính từ lượng Glycerol (g) ban đầu và lượng glycerol trong sản sau khi kết thúc phản ứng :
X(G)% = ∗ 100% (1) Áp dụng công thức : X(G)% = /( ∗ ) /( ∗ )
/( ∗ ) x 100 (2) Trong đó: mGo : lượng Glycerol trong nguyên liệu mG1 : lượng Glycerol trong sản phẩm
A1: là diện tích peak của glycerol trong nguyên liệu A2: là diện tích peak của glycerol trong sản phẩm
A0: là diện tích peak của chất nội chuẩn trong mẫu nguyên liệu hoặc sản phẩm đó ms0: khối lượng mẫu nguyên liệu phân tích
ms1: khối lượng mẫu sản phẩm phân tích
3.3.3 Định lượng ME theo phương pháp nội chuẩn
Qua các quá trình thực nghiệm, ta thu được kết quả phương pháp nội chuẩn sử dụng để định lượng cho kết quả với độ chính xác cao nhất, do đó để định lượng ME trong mẫu sản phẩm ta chỉ tiến hành theo phương pháp nội chuẩn với chất nội chuẩn sử dụng vẫn là DGBE.
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 61
Hình 24: Sơ đồ quá trình phân tích định lượng ME
Trong đó:
Mi: diện tích peak ME trong mẫu sản phẩm thứ i Mci : diện tích peak ME trong mẫu xây đường chuẩn Acsi: diện tích peak chất nội chuẩn trong mẫu sản phẩm Ci : nồng độ ME trong mẫu pha đường chuẩn (mg/ml)
Cx: nồng độ ME trong mẫu sản phẩm được nội suy từ đường chuẩn (mg/ml)
3.3.3.1 Xây dựng đường chuẩn tính toán cho ME
Pha các hỗn hợp có tỷ lệ khối lượng của ME (Mono tert butyl glycerol ete) và S (chất nội chuẩn) biết trước, phân tích sắc kí, đo diện tích các peak, lập tỉ số diện tích tương ứng, cuối cùng lập đường chuẩn tương đối.
Bước 1: Cân chính xác lượng ME mME = 0.0788 g cho vào bình định mức 4 ml Bước 2: Định mức bằng dung môi AcetoNitrile đến 4 ml thu được dung dịch SI2 Bước 3: Tiến hành pha các mẫu dung dịch với nồng độ chính xác được cho trong bảng sau:
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 62
Bảng 12: Các mẫu dùng để xây dựng đường chuẩn ME với chất nội chuẩn
Mẫu Thể tích (µl) Lượng ME Ci
(mg/ml mẫu)
SI2 Dung môi Chất nội
chuẩn Tổng M1 1000 0 20 1020 19,31372549 M2 500 500 20 1020 9,656862745 M3 250 750 20 1020 4,828431373 M4 125 875 20 1020 2,414215686 M5 60 940 20 1020 1,158823529 M6 30 970 20 1020 0,579411765 3.3.3.2 Định lượng ME và tính độ chọn lọc 1. Định lượng ME
Từ đường chuẩn ME, nội suy biết được nồng độ khối lượng CXME của ME khi biết tỷ lệ diện tích peak ME với chất chuẩn (theo phương pháp nội chuẩn) có trong khối lượng ms1 mẫu sản phẩm đem phân tích, từ đó tính được tổng lượng ME có trong mẫu sản phẩm.
2. Xác định độ chọn lọc ME
Để có được số mol ME tạo thành từ kết quả định lượng Cx (mg/ml): nME = ∗ (mmol/g) Ta sử dụng công thức tính độ chọn lọc αME : αME (%)= ∗ 100% = ∗ 100% = ∗ *100% (3) Trong đó:
CxME : lượng ME có trong mẫu sản phẩm phân tích ms1 : khối lượng mẫu sản phẩm đem đi phân tích nME : số mol ME trong sản phẩm
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 63 nsp : số mol sản phẩm thu được
nGpu : số mol Glycerol phản ứng nGo: số mol Glycerol ban đầu
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 64
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH
4.1 Kết quả định tính các chất
4.1.1 Kết quả các mẫu riêng biệt
Các mẫu riêng biệt được đem đi phân tích và thu được kết quả sắc kí đồ và khối phổ tương ứng. Với mỗi peak đặc trưng cho 1 chất, sau khi có kết quả khối phổ của peak, GCMS sẽ giúp ta định danh chính xác chất bằng việc so sánh nó với chất chuẩn trong thư viện khối phổ.
4.1.1.1 Mẫu dung môi Acetonitrile
Hình 25: Sắc ký đồ của dung môi Acetonitrile
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 65
Hình 26: Khối phổ đặc trưng của Acetonitrile
Bảng 13: Kết quả tìm trong thư viện khối phổ ứng với peak Acetonitrile
Stt Ion chọn lọc (m/z) Công thức
1 38 [CCN]+
2 39 [CHCN]+
3 40 [CH2CN]+
4 41 CH3CN
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 66
Hình 27: Sắc ký đồ của TBA và dung môi Acetonitrile
Peak đặc trưng của TBA có thời gian lưu là 2.14 phút.
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 67
Bảng 14: Kết quả tìm trong thư viện khối phổ ứng với peak TBA
Stt Ion chọn lọc (m/z) Công thức
1 31 [C2H7]+
2 41 [C3H5]+
3 43 [C3H7]+
4 59 [C3H7O]+
4.1.1.3 Mẫu Glycerol và dung môi
Hình 29: Sắc ký đồ của Glycerol và dung môi Acetonitrile
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 68
Hình 30: Khối phổ đặc trưng của Glycerol
Bảng 15: Kết quả tìm trong thư viện khối phổ ứng với peak Glycerol
Stt Ion chọn lọc (m/z) Công thức
1 31 [C2H7]+
2 43 [C3H7]+
3 44 [C3H8]+
4 61 [C3H9O]+
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 69
Hình 31: Sắc ký đồ của DGBE và dung môi Acetonitrile
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 70
Hình 32: Khối phổ đặc trưng của DGBE
Bảng 16: Kết quả tìm trong thư viện khối phổ ứng với peak DGBE
Stt Ion chọn lọc (m/z) Công thức
1 29 [C2H5]+
2 41 [C3H5]+
3 45 [C2H5O]+
4 57 [C4H9]+
4.1.2 Mẫu nguyên liệu và sản phẩm
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 71
Hình 33: Sắc ký đồ của mẫu nguyên liệu
Mẫu nguyên liệu có thêm chất nội chuẩn:
Hình 34: Sắc ký đồ của mẫu nguyên liệu có thêm chất nội chuẩn
Sinh viên thực hiện: Trần Công Minh –KTHH2-K54 Page 72
Bảng 17: Các peak trong mẫu nguyên liệu
Chất Thời gian lưu
(phút) Thời gian bắt đầu (phút ) Thời gian kết thúc (phút) Ghi chú
TBA 2,11 2,05 2,35 Nguyên liệu
Acetonitrile 2,84 2,72 3,17 Dung môi
DGBE 15,41 15,24 15,52 Chất nội chuẩn
Glycerol 20,49 20,34 20,67 Nguyên liệu
4.1.2.2 Mẫu sản phẩm
Hình 35: Sắc ký đồ của mẫu sản phẩm