Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Quy trình chiết xuất
2.2.1. Quy trình chiết xuất
3 kg bột khô ngọn rau Khoai lang và 3 kg lá Bìm bìm được ngâm chiết với ethanol 80% ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 ngày (quá trình được lặp lại 3 lần). Gộp các dịch chiết, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không thu cặn ethanol. Cặn ethanol được hòa tan trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi hexan, chlorofom, ethylacetate, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng.
2.2.2. Phương pháp xác định chất khô tuyệt đối
Cân chính xác 0,5g mỗi mẫu (3 mẫu) cho vào ống nghiệm (đã cân khối lượng), đưa vào tủ sấy, sấy ở 1100C trong 24h. Sau đó đưa ra nút ngay nắp ống nghiệm lại, đưa vào buồng cân phân tích, để nguội 10 phút, rồi rút nắp ra cân ngay. Lấy trung bình cộng của 3 mẫu đã cân.
2.2.3. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên của rau Khoai lang và lá Bìm bìm [11, 18, 20, 22, 39]
2.2.3.1. Định tính flavonoid
Mẫu thử được pha trong ethanol với một lượng thích hợp. Rồi tiến hành các thí nghiệm sau:
Phản ứng Shinoda: cho thêm vài giọt acid chlohidric vào dung dịch
mẫu. Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm
vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
Phản ứng diazo hóa: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm một ống
đối chứng, ống kia nhỏ thêm vài giọt thuốc thử diazo. Phản ứng cho kết quả dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu da cam.
Phản ứng với acid sunfuric: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm một
ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
Phản ứng định tính catechin: nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc,
nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính.
2.2.3.2. Định tính tannin
Mẫu thử cũng được pha như trên và làm các phản ứng:
Phản ứng với vanilin: chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm một ống
đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4 phản ứng dương tính khi thu được màu đỏ đậm.
Phản ứng với gelatin/NaCl: cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu,
phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục. .
Phản ứng với acetate chì : cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào
dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa.
Phản ứng với dung dịch kiềm: dung dịch mẫu thử được pha như trên.
Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10% Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
Phản ứng với FeCl3: nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
2.2.3.4. Định tính glycoside
- Phản ứng Keller-Killian:
+ Thuốc thử Keller-killian:
Dung dịch A: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50 ml acid acetic 100%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch B: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50 ml acid sunfuric đặc.
+ Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm lml dung dịch A lắc cho
tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng dương tính
khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
2.2.3.5. Định tính alkaloid
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng.
Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acid acetic): alkaloid phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ.
2.2.3.6. Định tính saponin
Phản ứng tạo bọt: mẫu thử đã pha như ở trên. Chia dung dịch nhận
được vào 2 ống: ống 1 cho 5ml dung dịch NaOH 0,5N (pH = 13), ống 2 cho
5ml dung dịch HCl 0,1N (pH= l). Sau đó cho vào mỗi ống 5ml dịch chiết mẫu thử, lắc mạnh hai ống. Nếu thấy có nhiều bọt và bền vững ở môi trường kiềm
(ống l) thì cho thấy sự có mặt của saponin steroid, môi trường acid (ống 2) là saponin tritecpen.
2.2.4. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin - Ciocalteau [34]
* Chuẩn bị mẫu:
+ Cân chính xác 5g bột dây khoai lang và ngâm trong 50ml ethanol
80%, lọc thu dịch chiết.
+ Cân chính xác 10mg mỗi loại phân đoạn n- hexan, phân đoạn
chloroform và phân đoạn ethylacetate, hòa loãng trong lml ethanol 80%. Các dung dịch trên sau đó được hòa loãng ở các nồng độ thích hợp để làm phản ứng định lượng hợp chất polyphenol tổng số theo phương pháp Folin - Ciocalteau. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc các hợp chất polyphenol trong dung dịch phản ứng với thuốc thử Folin - Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam, đo độ hấp thụ ở bước sóng 765 nm, lấy acid gallic làm chất chuẩn để tính lượng polyphenol tổng số.
* Nguyên liệu
+ Dung dịch acid gallic: 0,5g acid gallic + l0ml ethanol 96% + 90ml
nước cất hai lần (bảo quản lạnh sử dụng trong 2 tuần). Dịch gốc này dùng làm dịch pha các mẫu lập đồ thị chuẩn theo mg/l của acid gallic
+ Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O, đem đun sôi. Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24h đem lọc và dẫn nước cất tới l000ml.
* Tiến hành
+ Chuẩn bị cóng định lượng theo tỉ lệ 0, 1 , 2, 3 , 5 và 10ml, sau đó dẫn
nước cất tới l00ml ta sẽ thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500mg/1 acid gallic.
+ Mỗi cóng định lượng cho 0,02ml (20μl) mẫu + 1,58ml H2O + 0,1ml
Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2h ở 20oc rồi đo OD ở bước sóng 765nm.
+ Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
Bảng 2.1. Bảng kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
STT Dịch gốc (ml) Nước cất thêm vào (ml) Hàm lượng acid gallic (mg/l) OD765nm 1 0 100 0 0,009 2 1 99 50 0,062 3 2 98 100 0,119 4 3 97 150 0,168 5 5 95 250 0,265 6 10 90 500 0,519 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.4. Đồ thị chuẩn acid gallic * Cách đo với dịch nghiên cứu:
Tiến hành như trên nhưng thay 0,02ml (20μl) dịch chuẩn bằng dịch nghiên cứu được pha loãng thích hợp sao cho số đo nằm trong đường chuẩn. 2.2.5. Sắc ký lớp mỏng [2]
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715). Hệ dung môi chạy sắc ký TEAF (Toluen:
Ethylacetate: Acetone: Formic acid) với tỷ lệ 5: 3: 1: 1. Sau khi chạy, bản sắc
ký được nhuộm bằng dung dịch H2SO4 10% và hơ nóng ở 110oC trong 5 phút. Xác định hệ số Rf theo công thức: Rf =
b a
a: khoảng di chuyển của chất nghiên cứu b: khoảng di chuyển của dung môi
2.2.7. Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng theo typ 2 [14, 32, 35] Chuột nhắt cho nhịn ăn 12h trước khi tiến hành gây ĐTĐ bằng STZ. STZ được pha trong đệm citrate (0,01M, pH 4,5) và được giữ lạnh khi sử dụng. Chuột gây bệnh được tiêm màng bụng dung dịch STZ với liều duy nhất 90mg/kg thể trọng. Lô đối chứng chỉ tiêm đệm citrate. Sau khi tiêm chuột được cho ăn bình thường.
Xác định nồng độ glucose huyết của chuột trước và sau 72h tiêm STZ. Chuột coi như đã mắc bệnh ĐTĐ khi nồng độ glucose huyết lúc đói ≥ 18mmol/l. Sau đó tiếp tục theo dõi nồng độ glucose huyết trong 2 tuần tiếp theo khi điều trị bằng các phân đoạn.
2.2.8. Cách xác định một số chỉ số hóa sinh trước và sau khi điều trị bằng dịch chiết
2.2.8.1. Phương pháp định lượng glucose huyết [ 24, 28]
Máu sử dụng để định lượng đường huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi chuột.
Định lượng đường huyết bằng máy đo đường huyết tự động và bộ kít thử tương ứng (One Touch Ultra, Johnson & Johnson, USA). Nguyên tắc của phương pháp dựa trên phản ứng đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kít thử với glucose trong máu tạo thành acid gluconic và hydrogen peroxide (H2O2) (phản ứng 1). H2O2 vừa tạo thành được peroxydase phân hủy giải phóng oxy, oxy hoá O-dianisidin tạo phức chất mầu vàng nâu (phản ứng 2).
Glucose + H2O2 + O2 → acid gluconic + H2O2 (1)
O-Dianisidin + H2O2 → phức hợp nâu vàng + H2O2 (2)
Cường độ màu được xác định theo phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose trong máu cần định lượng.
Phương pháp tiến hành đo:
Gắn một que thử để bật máy. Nhấn nút C để chọn mã số chính xác với mã ghi trên lọ que thử.
Cắt đuôi chuột, bỏ giọt máu đầu, lấy giọt máu thứ 2. Mẫu máu dùng cho việc đo là 1μl và phải là một giọt máu tròn đầy. Thấm nhẹ giọt máu vào điểm nhận máu trên đầu que thử, máu tự động được hút vào vùng đo nơi phản ứng xảy ra. Sau 5 giây kết quả sẽ hiển thị trên màn hình.
2.2.8.2. Xác định nồng độ triglycerid trong máu [19]
Thủy phân triglycerid bằng enzym lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành 4- aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:
Đo mật độ quang ở bước sóng 500nm, so với ống chuẩn để tính kết quả.
2.2.8.3. Xác định nồng độ cholesterol trong máu [17]
Định lượng cholesterol sau khi thủy phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hóa bằng cholesterol oxidase (CHO). Đo mật độ quang của quinoneimine tạo nên từ phản ứng của H2O2 với 4 –
Triglycerid Lipase Glycerol + acid béo
Glycerol + ATP GK Glycerol – 3 – phosphate + ADP Glycerol – 3 – phosphate + O2 GOD Dihydroxyaceton phosphate + H2O2
H2O2 + aminoantipyrine + 4-chlorophenol POD Quioneimine + HCl + 4 H2O
aminoantipyrine và phenol nhờ sự xúc tác của peroxidase (POD). Các phản ứng xảy ra như sau:
Đo mật độ quang ở bước sóng 500nm, so với ống chuẩn để tính kết quả.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});