Hai phương phỏp xỏc định trỡnh tự chớnh là phương phỏp hoỏ học của Maxam và Gilbert và phương phỏp enzym học của Sanger và cộng sự. Dự rất khỏc nhau về nguyờn tắc, nhưng hai phương phỏp này cú một số điểm chung: Hỡnh thành một tập hợp nhiều oligonucleotid cú chiều dài khỏc nhau, mỗi oligonucleotid cú xỏc suất xuất hiện bằng nhau trong phản ứng. Cỏc trỡnh tự này sau đú được phõn tỏch bằng phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamid cú khả năng phõn tỏch hai trỡnh tự chỉ cỏch nhau một nucleotid.
Trong thực nghiệm, việc sử dụng phương phỏp chớnh thống nờu trờn đũi hỏi thao tỏc phức tạp vỡ phải tạo dũng trở lại đoạn ADN cần xỏc định trỡnh tự vào một vector mạch đơn. Sự ra đời của phương phỏp nhõn ADN đặc hiệu (PCR) cho phộp xỏc định trực tiếp trỡnh tự của một đoạn ADN được nhõn lờn khụng qua tạo dũng. Nguyờn tắc của phương phỏp này dựa trờn sự phối hợp giữa phương phỏp PCR và phương phỏp sử dụng cỏc dideoxynucleotid đó được đỏnh dấu bằng một fluochrome cú màu khỏc nhau. Như vậy tất cả cỏc oligonucleotid cựng chấm dứt tại một loạt dideoxynucleotid sẽ cú cựng một màu. Sau khi điện di kết quả sẽ được phõn tớch bằng chương trỡnh vi tớnh.
Trước tiờn đoạn ADN cần xỏc định trỡnh tự được nhõn lờn bằng phương phỏp PCR. Sau đú sản phẩm PCR được tinh sạch để loại bỏ cỏc dNTP và mồi thừa. Tiếp theo hai mạch phõn tử ADN được tỏch rời nhau. Mỗi mạch được bắt cặp với một mồi và phản ứng PCR được thực hiện nhờ cỏc enzym và dideoxynucleotid đó được đỏnh dấu bằng một fluochrome [1, 200- 206].
Một trong những mỏy tự động giải trỡnh tự ADN hiện đại là ABI Prism 3700 của hóng Perkin – Elmer. Sản phẩm PCR cần giải trỡnh tự được tinh sạch bằng PCR – product pre – sequencing kit. Trong bộ kit này cú chứa enzym exonucleas I để loại mồi thừa và enzym Shrimpalkalinephosphatas phỏ huỷ cỏc dNTP cũn dư. Sản phẩm PCR sau khi đó được tinh sạch, sử dụng làm khuụn để thực hiện phản ứng PCR cựng với Big dye Terminator và mồi xuụi hoặc mồi ngược riờng biệt. Sản phẩm PCR với mồi xuụi hoặc mồi ngược riờng biệt được giải trỡnh tự bằng mỏy tự động ABI Prism 3700 theo nguyờn lý điện di mao quản. Kết quả giải trỡnh tự được phõn tớch bằng chương trỡnh vi tớnh.