4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các cơ quan gan; thận; tỳ tạng,
trên môi trường TSA (Tryptic soya agar). Sau 24 giờ, vi khuẩn tạo những khuẩn lạc với 2 dạng khác nhau. Các khuẩn lạc điển hình sẽ được cấy tách ròng, để thu được những khuẩn lạc thuần (xác định bằng phương pháp nhuộm
Bảng 4.3: Kết quả phân lập vi khuẩn
Chỉ tiêu Đốm đỏ Đỏ lườn
Số chủng VK 47 62
Tỷ lệ % 43,12 56,88
Hình dạng khuẩn lạc Nhỏ li ti To tròn Màu sắc khuẩn lạc Trắng trong Màu kem, trắng dục
Gram - -
Hình dạng vi khuẩn Hình que ngắn Hình que ngắn Kết quả tổng hợp cho thấy, từ 124 mẫu cá bệnh, đề tài tiến hành phân lập được 109 chủng vi khuẩn từ hai dạng bệnh khác nhau. Theo đó, từ 50 mẫu cá có biểu hiện của bệnh đốm đỏ phân lập được 47 chủng vi khuẩn (43,12% tổng số chủng vi khuẩn). Các chủng vi khuẩn được cấy từ gan, thận, tỳ tạng
trên môi trường TSA. Sau 24 giờ ủở 28oC, thu được những khuẩn lạc có các
đặc điểm tương đồng nhau là tròn, nhỏ, đường kính 0,5-2 mm, dạng lồi, rìa
trơn láng, màu trắng trong. Các khuẩn lạc điển hình sẽ được cấy tách ròng, để thu được những khuẩn lạc thuần (xác định bằng phương pháp nhuộm Gram).
A B
Hình 4.5: Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đốm đỏ trên môi trường TSA (A) và từ cá bệnh đỏ lườn trên môi trường GSP (B)
Bên cạnh đó, từ 74 mẫu cá có biểu hiện của bệnh đỏ lườn phân lập được 62 chủng vi khuẩn (56,88% tổng số chủng vi khuẩn). Các chủng vi khuẩn được cấy từ gan, thận, tỳ tạng trên môi trường TSA. Sau 24 giờ ủ ở 28oC, vi khuẩn tạo những khuẩn lạc màu kem, to tròn, mặt trơn láng không nhân. Các khuẩn lạc điển hình sẽ được cấy tách ròng, để thu được những khuẩn lạc thuần.
4.3.2 Kết quả định danh vi khuẩn
4.3.2.1 Kết quả định danh vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đốm đỏ
Quá trình định danh vi khuẩn được thực hiện theo phương pháp của Buller (2004) kết hợp với phương pháp của Cowan and Steel’s (Barrow and
Feltham, 1999). Theo đó, các chủng vi khuẩn thuần sẽ được kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản gồm: Gram, oxidase, catalase, O/F, di động. Đặc điểm
sinh hóa cơ bản của 47 chủng vi khuẩn được tổng hợp trong Bảng 4.4.
Bảng 4.4: Đặc điểm sinh hóa cơ bản của vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đốm đỏ
Chủng vi khuẩn
Gram Di động Oxidase Catalase O/F
DT37 - + - + +/+ HG41 - + - + +/+ Chủng chuẩn (Buller, 2004) - + - + +/+
Từ kết quả kiểm tra đặc điểm sinh lý cơ bản cho thấy đây là những chủng vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, catalase dương tính, oxidase âm tính và có khả năng lên men trong cả hai điều kiện hiếu khí và yếm khí. Vi khuẩn
di động mạnh ở điều kiện 37oC. Bên cạnh đó, khi khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn ở 3 nồng độ 0, 1, 2, 3% NaCl trong môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion). Kết quả cho thấy tất cả vi khuẩn có thể sinh
trưởng ở môi trường có nồng độ NaCl từ 0 – 3% và ở điều kiện nhiệt độ 28oC, 37oC. Qua kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản cho thấy những chủng vi khuẩn này thuộc nhóm vi khuẩn Enterobacteriaceae. Để định danh đến loài vi khuẩn, đề tài sử dụng bộ kít API 20E. Kết quả các chỉ tiêu API 20E được trình bày thông qua Bảng 4.5.
Kết quả kiểm tra với bộ kit API 20E cho thấy, các chủng có phản ứng
dương tính với indol, H2S . Bên cạnh đó, các chủng vi khuẩn không có khả năng sử dụng đường mannitol, sucrose và arabino nhưng cho phản ứng dương
tính với lysine, ornithine và glucose. Các đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập được hoàn toàn giống với loài Edwardsiella tarda tham khảo của Buller (2004) phân lập được. Từ kết quả API 20E trên các chủng vi khuẩn đại diện cho kết quả hoàn toàn phù hợp với chủng chuẩn, xác định đây là loài
Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn trong nghiên cứu bằng bộ kit API 20E và khả năng phát triển trong môi trường có nồng độ muối khác nhau E.tarda phân lập Hóa chất DT37 HG41 Chủng vi khuẩn E.tarda AHLDA 135 (Buller, 2004) Sinh Beta-galactosidase - - - Arginine - - - Lysine + + + Ornithine + + + Sử dụng citrate + + + Sinh H2S + + + Sinh urease - - - Sinh tryptophane - - - Sinh indole + + + Phản ứng Voges-Proskauer - - - Thủy phân Gelatin - - - Sử dụng đường glucose + + + Mannitol - - - Inositol - - - Sorbitol - - - Rhamnose - - - Sucrose - - - Melibiose - - - Amygdalin - - - Arabinose - - - Phát triển ở nồng độ muối: 0% + + + 1% + + + 2% + + + 3% + + +
Ghi chú: (+): Phản ứng dương tính, (-): Phản ứng âm tính
Hình 4.6: Kết quả test API 20E của chủng vi khuẩn E. tarda
Theo Inglis et al. (1993), giống vi khuẩn Edwardsiella spp. thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, được phát hiện đầu tiên vào năm 1962 bởi Sakazaki ở Nhật Bản và được mô tả bởi Ewing et al. (1965) (trích dẫn bởi Inglis et al., 1993). Nhóm vi khuẩn này gồm 3 loài vi khuẩn là: E. ictaluri, E. tarda và E. hoshinae. Trong đó, hai loài vi khuẩn E. ictaluri và E. tarda là mầm bệnh nguy hiểm và phổ biến nhất cho cá nước ngọt.
Giữa hai loài vi khuẩn E. ictaluri và E. tarda có nhiều đặc điểm tương đồng trong các chỉ tiêu sinh hóa. Vì vậy rất khó có thể phân biệt được hai loài vi khuẩn này. Tuy nhiên, đặc điểm sinh hóa của 2 loài này cũng có 1 vài chỉ
tiêu khác biệt giúp phân biệt giữa chúng. Theo đó, loài E. ictaluri phát triển sau 48 giờ và không phát triển trong môi trường có độ mặn 3%, còn loài E. tarda có khả năng chịu đựng nồng độ muối cao hơn nên có thể tồn tại ở môi
trường có độ mặn 3%, thời gian phát triển của chúng cũng nhanh hơn, khuẩn lạc to hơn sau 24giờ phát triển trên môi trường thạch nuôi cấy. Bên cạnh đó, 2 loài này có 3 điểm khác nhau trong chỉ tiêu sinh hóa, đó là khả năng sinh
indol, H2S và metyl red. Loài E. tarda dương tính với 3 chỉ tiêu trên, còn loài
E. ictaluri thì ngược lại. Đây là các chỉ tiêu quan trọng để phân biệt vi khuẩn
E.tarda với vi khuẩn cùng giống là E. ictaluri (Panangala et al., 2006).
Những đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn đề tài phân lập được cũng tương đồng với những ghi nhận của Noga (2010), theo đó, vi khuẩn
Edwardsiella thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, là vi khuẩn Gram âm, yếm khí tùy tiện, hình que ngắn, kích thước 1x2-3 µm, không sinh bào nang, chuyển động nhờ tiên mao, catalase dương tính, cytochrom oxidase âm tính,
lên men trong môi trường yếm khí. Bên cạnh đó những chủng vi khuẩn E. tarda phân lập từ loài cá trê Clarias Gariepinus trong nghiên cứu của Mahmoud et al. (2012), cũng có hình que, di động ở 25oC – 35oC. Vi khuẩn này phát triển nhanh hơn vi khuẩn E. ictaluri trên môi trường nuôi cấy. E. tarda phát triển tốt ở nhiệt độ 30oC, trong 24 – 48 giờ, có thể phát triển ở
37oC, 40oC và trong môi trường có độ mặn đến 3%, tạo thành những khuẩn lạc nhỏ trên môi trường nuôi cấy. Vi khuẩn này có thể được phân lập từ cơ, gan,
thận, tỳ tạng của cá trên môi trường chung là Tryptic Soya agar (TSA) hoặc nutrient agar (NA) (Mahmoud et al., 2012). Ngoài ra, để định danh đến loài vi khuẩn, nghiên cứu này còn thực hiện kiểm tra các đặc điểm sinh hóa bằng bộ
API 20E. Kết quả ghi nhận những chủng vi khuẩn này cũng có những điểm
tương đồng với ghi nhận của đề tài đó là các khả năng sinh indol, H2S và cũng
không sử dụng các loại đường khác ngoài đường glucose. Từ những ghi nhận trên, có thể thấy, kết quả định danh loài E. tarda phân lập từ cá bệnh đốm đỏ
là hoàn toàn phù hợp.
Thêm vào đó, những biểu hiện của bệnh đốm đỏ trên cá thát lát do đề tài ghi nhận được cũng có những biểu hiện tương đồng khi loài này gây bệnh trên các
loài cá nước mặn, nước ngọt khác. Bệnh do vi khuẩn E. tarda được phân lập
đầu tiên trên cá chình (Anguilla anguilla) vào năm 1962, là loài vi khuẩn được biết đến gây ra bệnh trên 25 loài cá nước ngọt, nước mặn khác, chim, bò sát,
Noga, 2010). Vi khuẩn E. tarda khi gây bệnh trên cá da trơn sẽ làm cá ít vận
động do vây đuôi bị tưa, rách. Cá xuất hiện nhiều vết thương tổn trên da (đường kính khoảng 3-5 mm), những vết thương này sẽ hình thành những khối rỗng bên trong cơ, da bị mất sắc tố. Ngoài ra, cá bệnh sẽ có những vết thương
bên dưới biểu bì và cơ, khi ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi, các vết thương
này sẽ làm hoại các vùng cơ xung quanh. Gan cá bệnh thường có dấu hiệu sung huyết, bầm đen, thận cá bệnh thường trương to hơn (Panangala et al., 2006). Khi gây bệnh trên cá nheo Mỹ (Ictalurus puntatus) E.tarda thường gây ra những vết loét nhỏ trên da, những trường hợp bệnh nặng, chúng gây ra những vùng bạc màu trên da, tại đó hình thành vùng bị áp xe sâu trong cơ của cá (Meyer và Bullock 1973). Mặt khác, E.tarda cũng là 1 tác nhân gây bệnh nguy hiểm và gây thiệt hại nặng cho nền công nghiệp nuôi cá bơn tại Nhật và cá rô phi ở Trung Quốc, tuy nhiên, ở cá cá bơn Paraliehthys olivaceus và cá
Tilapia nilotica, bệnh do E. tarda lại có biểu hiện trướng bụng do có nhiều dịch màu hồng trong xoang bụng (Nakat-Sugawa 1983;. Kubota et al., 1981); còn ở cá vền Evynnis japonicus khi bị nhiễm E.tarad lại có những vết loét trên vùng đầu của cá (Kusuda et al., 1977). Ngoài ra, khi nhiễm trên cá chép (Cyprinus carpio), cá chình Nhật Bản, và chẽm sọc (Morone saxatilis) vi khuẩn lại gây ra các đốm đỏ xuất huyết thân và vây (Miyazaki and Egusa 1976;. Sae-Oui et al., 1984). Tại Việt Nam, chưa có báo cáo nào phát hiện E. tarda gây bệnh trên cá tra, nhưng E. tarda đã được cho là tìm thấy trên cá trê
đen và cá trê vàng (Bùi Quang Tề và ctv, 2006), cá lóc (Lư Trí Tài, 2010). Từ
những thông tin trên, có thể thấy, những biểu hiện bệnh lý trên các loài khác nhau sẽ khác nhau khi nhiễm loài vi khuẩn này. Đối với những biểu hiện bệnh lý trên cá thát lát mà đề tài ghi nhận được có những đặc điểm tương đồng với những ghi nhận của các nghiên cứu trước đây.
Mặt khác, những ghi nhận về yếu tố bùng phát dịch bệnh của loài vi khuẩn này khá phù hợp với những ghi nhận mùa vụ bệnh đốm đỏ mà đề tài tổng hợp được. Theo đó, một số ý kiến cho rằng, áp lực môi trường như nhiệt
độ cao, chất lượng nước kém và hàm lượng hữu cơ cao chủ yếu góp phần vào sự khởi phát và mức độ nghiêm trọng của dịch bệnh do E. tarda trên cá (Plumb, 1999; Uhland et al., 2000; Zheng, 2004). Một số thí nghiệm cho thấy, cá nheo Mỹ giai đoạn giống nuôi trong môi trường có nồng độ CO2 và NH3
cao, hàm lượng oxy thấp thì có tỷ lệ nhiễm cao hơn so với những nghiệm thức khác. Ngoài ra, sự bùng phát của dịch bệnh do E. tarda còn được ghi nhận khi nhiệt độ môi trường tăng, tích tụ vật chất hữu cơ vước quá giới hạn cho phép,
trong đó mặc dù tỷ lệ hao hụt thấp nhưng cá thể thường nhiễm mãn tính và khó diều trị hơn (Meyer and Bullock, 1973; Noga 2000).
4.3.2.2 Kết quả định danh vi khuẩn phân lập từ cá bệnh xuất huyết
Quá trình định danh vi khuẩn được thực hiện theo các phương pháp tương tự như trường hợp cá bị bệnh đốm đỏ. Theo đó, các chủng vi khuẩn thuần sẽ được kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản gồm: Gram, oxidase,
catalase, O/F, di động làm cơ sở cho việc áp dụng bộ kit API 20E để dịnh
danh đến loài. Đặc điểm sinh hóa cơ bản của 62 chủng vi khuẩn được tổng hợp trong Bảng 4.6.
Bảng 4.6: Đặc điểm sinh hóa cơ bản của vi khuẩn phân lập từ cá bệnh xuất huyết
Chủng vi khuẩn
Gram Di
động
Oxidase Catalase O/F O/129
H1F39 - + + + +/+ Kháng D2F71 - + + + +/+ Kháng Chủng chuẩn (Buller, 2004) - + + + +/+ Kháng
Từ kết quả kiểm tra đặc điểm sinh lý cơ bản cho thấy đây là những chủng vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, catalase, oxidase dương tính và có khả năng lên men trong cả hai điều kiện hiếu khí và yếm khí, kháng với O/129. Vi khuẩn di động mạnh ở điều kiện 37oC. Ngoài ra, những chủng vi khuẩn này những khuẩn lạc màu vàng trên môi trường GSP. Kết quả ban đầu cho thấy các chủng vi khuẩn này thuộc giống vi khuẩn Aeromonas spp. Để định danh đến loài vi khuẩn, đề tài sử dụng bộ kít API 20E. Kết quả các chỉ tiêu API 20E được trình bày thông qua Bảng 4.7.
Kết quả các chỉ tiêu API 20E cho thấy các chủng này đều sinh indol, có khả năng sử dụng đường mannitol, sucrose và glucose. Đồng thời, chúng cho phản ứng dương tính với arginine, lysine, VP và phản ứng âm tính với
ornithine, đây là những chỉ tiêu điển hình của A. hydrophila, giúp phân biệt chúng với 2 loài vi khuẩn cùng giống là A. caviae và A. sobria (Sharon et al., 2003; Cipriano, 1984, 2001). Các đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập
được hoàn toàn giống với loài A. hydrophila tham khảo của Buller (2004) phân lập được.
Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng bộ kit API 20E A.hydrophila phân lập Chỉ tiêu H1F39 D2F71 Chủng vi khuẩn A.hydrophila ATCC 14715 (Buller, 2004) Sinh beta-galactosidase + + + Arginine + + + Lysine + + + Ornithine - - - Sử dụng citrate - - - Sinh H2S - - - Sinh urease - - - Sinh tryptophane - - - Sinh indole + + + Phản ứng Voges-Proskauer + + + Thủy phân Gelatin + + + Sử dụng đường glucose + + + Mannitol + + + Inositol - - - Sorbitol - - - Rhamnose - - - Sucrose + + + Melibiose - - - Amygdalin + + + Arabinose + + +
Ghi chú: (+): Phản ứng dương tính, (-): Phản ứng âm tính
Ngoài ra, các dấu hiệu bệnh lý của những mẫu cá bệnh do nhóm vi khuẩn này cũng giống với những mô tả về dấu hiệu bệnh lý do vi khuẩn
Aeromonas spp. gây ra của các tác giả như: Austin and Austin, 1987; Inglis et al. (1993); Aoki (1999); Noga (2010). Với các dấu hiệu điển hình như xuất huyết ở vây hậu môn và cơ quan nội tạng gan, thận, tỳ tạng đỏ bầm, nhũn, có
dịch trong xoang bụng. Tuy nhiên, những chủng vi khuẩn này không gây lồi và xuất huyết vùng mắt và miệng của cá như những mô tả của các tác giả trên khi chúng gây bệnh trên cá da trơn, cá chép. Từ kết quả API 20E trên 2 chủng vi khuẩn đại diện và so sánh với chủng chuẩn của Buller (2004), xác định đây
là loài Aeromonas hydrophila.
Theo Noga (2010), vi khuẩn giống Aeromonas spp. thuộc họ
Aeromonadaceae gồm 2 nhóm: di động Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae và Aeromonas sorbia và không di động Aeromonas salmonicada. Đặc tính chung của ba loài vi khuẩn thuộc nhóm di động là vi khuẩn Gram âm, dạng hình que ngắn, yếm khí tùy tiện. Tại Việt Nam, vi khuẩn thuộc giống
Aeromonas di động được phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là là loài A. hydrophila (Bùi Quang Tề, 2006). Bệnh do vi khuẩn
bởi Aoki (1999). Thập niên 1960, bệnh do vi khuẩn A. hydrophila đã được tập trung nghiên cứu. Nhóm vi khuẩn này đã được biết đến là nguyên nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chình (Anguilla anguilla) và cá chép (Cyprinus carpio) ở nhiều nước trên thế giới (Inglis et al., 1993; Aoki, 1999). Ờ Việt Nam, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila gây ra khá phổ biến trên nhiều loài cá nuôi như: cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá basa (Pangasianodon bocorti) và nhiều loài cá nước ngọt khác như cá lóc, cá rô
đồng, cá điêu hồng (Dung et al., 2005, Đỗ Thị Hoà và ctv, 2004; Lư Trí Tài,
2010).
Một số nghiên cứu đã ghi nhận vi khuẩn A. hydrophila là vi khuẩn Gram âm, dạng hình que, di động nhờ tiên mao. Đường kính 0,1-1,0 µm, dài 1,0-3,5 µm, không tạo bào nang, nhiệt độ cực thuận là 28°C, có thể phát triển
ở 37°C. Khuẩn lạc trên môi trường NA có màu trắng đến hồng nhạt, tròn, lồi, rìa trơn. Trên môi trường đặc trưng GSP, chúng tạo thành những khuẩn lạc