Phương pháp làm kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006). Dùng tâm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn đã được xác định đạt mật độ 108 CFU/ml bằng máy so màu quang phổ, trãi đều lên mặt môi trường thạch TSA. Sau đó
dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách giữa 2 tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa
tâm đĩa kháng sinh với rìa của đĩa petri là: 10-15 mm. Sau khi hoàn tất việc
đặt đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủấm ở điều kiện 28oC . Sau 24 giờ
tiến hành đọc kết quả.
Đo đường kính vòng vô trùng (mm): dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006) để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng.
3.3.5 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn
MIC được xác định bằng phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh
trong ống nghiệm (phương pháp Broth), theo Clinical and Laboratory Standards Institute, 2006 (CLSI M49-A).
Thí nghiệm sử dụng 4 loại thuốc kháng sinh tinh: ampicillin, enrofloxacin, oxytertracycline và trimethoprim+sulfamethoxazole.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Pha dung dịch thuốc gốc trong 2 chai (50 ml) có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi phù hợp. Pha loãng dung dịch thuốc kháng sinh gốc bằng nước cất tiệt trùng, nồng độ thuốc giảm đi một nửa: 1024; 256; 128; 64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5 µg/ml.
Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong dung dịch BHI- B ủở 28oC, trong 24 giờ. Đo mật độ vi khuẩn bằng máy quang phổ (OD 625 = 0,085-0,13) tại giá trị này vi khuẩn đạt mật độ 108 CFU/ ml. Pha loãng mật độ vi khuẩn bằng môi trường BHB với độ pha loãng 1:10. Mật độ vi khuẩn cần cho tiến hành MIC là 105 CFU/ml.
Tiến hành thí nghiệm: cho 2 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm chứa 2 ml thuốc có các nồng độ khác nhau .Đối chứng âm (2 ml BHB+ 2 ml nước cất) và đối chứng dương (2 ml vi khuẩn + 2 ml nước cất).
Đọc kết quả
Kiểm tra sự thuần của chủng vi khuẩn xét nghiệm trên đĩa TSA. Nếu phát hiện thấy có sự tạp nhiễm thì không đọc kết quả MIC.
Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ đục của mỗi ống MIC với ống đối chứng âm, đối chứng dương.
Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc trong ống nghiệm đầu tiên không có vi khuẩn phát triển.
3.3.6 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn trên cá thát lát còm 3.3.6.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn trên cá thát lát còm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng cảm nhiễm tại phòng thí nghiệm - Bể nhựa 60 L được khử trùng bằng chlorine và xà phòng sau đó rửa lại bằng
nước sạch và sục khí cho hết chlorine.
Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn
Chọn 2 chủng vi khuẩn E.tarda (DT37 và HG41) và 2 chủng vi khuẩn
A.hydrophila (D2F71 và H1F39) để tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm. Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA ở 28°C và nuôi tăng sinh vi khuẩn
trong môi trường BHI-B được đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau đó tiến hành ly tâm 4000 vòng/phút ở 4°C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý đã được thanh trùng để
rửa vi khuẩn (lặp lại 3 lần).Tiến hành xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610 nm và OD = 1±0,1 tương ứng với mật độ
vi khuẩn là 109 CFU/ml. Sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến các nồng độ: 104, 106, 108 CFU/ml. Mật số vi khuẩn của từng nghiệm thức được khẳng định bằng phương pháp trải dung dịch trên đĩa agar.
Bố trí thí nghiệm
Phương pháp tiêm:Cá thát lát giống mua từ trại ở Hậu Giang có trọng
lượng khoảng 15±4 g/con, cá khỏe, có da sáng và phản ứng linh hoạt với tiếng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
động. được trữ trong bể composite, có sục khí, cho ăn thức ăn công nghiệp,
cho ăn theo nhu cầu của cá. Cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức có mật
độ vi khuẩn lần lượt là: 104, 106, 108 CFU/ml, nghiệm thức đối chứng không tiêm và nghiệm thức đối chứng tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần với mật độ cá thí nghiệm 10 con/bể. Cá được tiêm vi khuẩn với các nồng độ thí nghiệm ở gốc vi bụng của cá. Tiêm 0,1 ml/cá thể và cho ăn suốt quá trình thí nghiệm. Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 14 ngày.
Phương pháp ngâm được tiến hành trên cá thát lát bột 40 ngày tuổi với chủng vi khuẩn E.tarda (HG41) và A.hydrophila (H1F39) .
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức có mật
độ vi khuẩn lần lượt là: 104, 105, 106 CFU/ml, nghiệm thức đối chứng không ngâm và nghiệm thức đối chứng ngâm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần với mật độ cá thí nghiệm 10 con/bể. Cá được ngâm tiếp xúc với dung dịch vi khuẩn với các nồng độ thí nghiệm trong thời gian 30 phút. Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 14 ngày.
3.3.6.2 Phương pháp xác định LD50
LD50: Lethal dose (nồng độ vi khuẩn gây chết cá 50%). Xác định LD50
theo phương pháp của Reed và Muench (1938) để biết được khả năng gây
bệnh của vi khuẩn và so sánh độc lực giữa các chủng vi khuẩn.
Xác định LD50 theo công thức Reed & Muench (1938):
LD50 = 10 a-p.d
Trong đó: p.d =
a: số lũy thừa của mật độ vi khuẩn gây chết dưới và cận 50% H%: tỉ lệ chết nhỏ và cận 50%
L %: tỉ lệ chết trên và cận 50% L% -50 %
3.2.6.4 Tái phân lập và định danh vi khuẩn
Tiến hành thu mẫu và phân lập vi khuẩn ở cá có biểu hiện lờ đờ hay vừa mới chết, đồng thời ghi lại thời gian, dấu hiệu bên ngoài và bên trong cơ
thể mẫu cá. Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận và tỳ tạng. Các đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn phân lập được tái định danh theo
phương pháp của Cowan and Steel’s (Barrow and Feltham, 1999).
3.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được thu thập và xử lý để vẽ đồ thị, biểu bảng, viết luận văn
bằng phần mềm Microsoft Excel và Microsoft Word. Xử lý thống kê bằng
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thông tin điều tra nông hộ
4.1.1 Một số thông tin chung về hộ nuôi
Qua kết quả điều tra 25 hộ nuôi cho thấy có 2 mô hình nuôi cá thát lát còm phổ biến là nuôi trong ao đất và nuôi trong vèo, có thả ghép với cá sặc rằn với các yếu tố về ao nuôi được trình bày trong Phụ lục 1. Về vấn đề con giống, các hộ nuôi thường chọn nguồn giống từ các trại sản xuất giống của địa
phương, trong số 25 hộ điều tra, chỉ có 20% là tự sản xuất con giống. Tuy nhiên, qua điều tra cho thấy các hộ nuôi đều nhận định chất lượng con giống
chưa cao và không ổn định vì bên cạnh một số trại giống có uy tín và sản xuất chú trọng đến chất lượng con giống thì do tình trạng nhu cầu con giống lớn, hiện tại địa phương vẫn chưa đáp ứng được đủ nhu cầu người nuôi, dẫn đến tình trạng giá cá giống rất cao nên một số trại giống chỉ quan tâm đến việc sản xuất đạt số lượng cao để thu về nhiều lợi nhuận hơn chứ chưa chú trọng đến chất lượng con giống sản xuất ra. Đó cũng chính là một trong những yếu tố
dẫn đến tình trạng các hộ nuôi cho rằng không nên xử lý con giống trước khi thả, Đa số cho rằng con giống còn nhỏ, giá giống lại rất đắt nên lo ngại nếu xử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lý sẽ làm cá bị sốc và gây hao hụt. Theo kinh nghiệm của hộ nuôi, nếu nuôi ở
mật độ cao thì dịch bệnh dễ xảy ra và cá dễ bị phân đàn. Theo đó, các hộ thường thả nuôi với mật độ 30 con/m2 đối với nuôi trong ao đất và 120 con/m2 đối với mô hình nuôi trong vèo (Phụ lục 1). Các hộ cho biết tuy có sử
dụng thức ăn công nghiệp cho cá thát lát còm nhưng giai đoạn đầu hầu như đều phải sử dụng hoàn toàn trùn chỉ và cá tạp làm thức ăn cho cá thát lát do
đặc tính ăn động vật của cá thát lát, hơn nữa giá cá tạp lại thấp nên giảm được giá thành sản xuất. Tuy nhiên, các hộ cũng nhận thấy rằng khi sử dụng thức ăn
là cá tạp thì nước rất mau dơ. Về chế độ thay nước, các hộ nuôi thường hạn chế thay nước trong tháng đầu tiên, chỉ có 32% hộ là định kỳ 15-20 ngày thì thay nước, các hộ chỉ thay khi nhận định cảm tính rằng nước dơ và hoàn toàn không kiểm tra các chỉ tiêu môi trường nước trong suốt vụ nuôi. Hầu hết các
hộ được phỏng vấn đều không sử dụng ao lắng, bơm và thải nước trực tiếp
nước ra sông.
Qua khảo sát điều tra cho thấy vấn đề chất lượng con giống chưa cao,
việc sử dụng thức ăn là trùn chỉ và cá tạp dẫn đến rất khó kiểm soát chất lượng
nước, cùng với sự chưa quan tâm quản lý môi trường nước đúng mức của các hộ nuôi và nuôi mật độ cao là một trong số các yếu tố dẫn đến sự xuất hiện của bệnh trên cá thát lát còm.
4.1.2 Thông tin về tình hình xuất hiện bệnh và sử dụng thuốc hóa chất
Sau vấn đề con giống và thức ăn thì chi phí dùng cho thuốc và hóa chất
để xử lý khi cá bệnh cũng là một vấn đề mà các nông hộ được điều tra quan tâm nhất?. Theo các hộ nuôi thì cá thát lát còm ít bị bệnh hơn cá lóc và cá rô.
Kết quả ghi nhận cho thấy, các loại bệnh xuất hiện phổ biến như: Kí sinh
trùng, xuất huyết hay còn gọi là đỏ lườn và bệnh đen thân hay còn gọi là đốm
đỏ (Hình 4.1).
Trong đó bệnh do ký sinh trùng đã xuất hiện khá phổ biến, tần suất xuất hiện trung bình khoảng 64% số hộ khảo sát. Bệnh ký sinh trùng cũng được ghi nhận là đã có xảy ra ở các vụ nuôi trước và xuất hiện suốt vụ nuôi nhưng thường gây thiệt hại cao ở giai đoạn cá giống. Trùng bánh xe và sán lá là 2 tác nhân ký sinh trùng được ghi nhận là tác nhân ký sinh trùng phổ biến trên cá thát lát. Các hộ thường xử lý bằng tạt formol hoặc các thuốc xử lý ngoại ký sinh.
Bệnh xuất huyết hay còn gọi là bệnh đỏ lườn được các hộ cho biết là một bệnh nguy hiểm trên cá thát lát với tỷ lệ nhiễm 76%. Bệnh xuất hiện hầu
như suốt vụ nhưng phổ biến và gây thiệt hại nhiều nhất ở giai đoạn chuyển thức ăn cho cá từ trùn chỉ qua thức ăn công nghiệp và thời điểm các tháng mùa lũ (tháng 7-9) khi mưa nhiều liên tục.
Kế đến một bệnh đốm đỏ hay còn gọi là bệnh đen thân, xuất hiện chủ
yếu lúc đầu vụ khi vận chuyển cá về nuôi và vào những cơn mưa đầu mùa (tháng 4-6). So với 2 dịch bệnh trước thì bệnh đốm đỏ ít phổ biến hơn, khi chỉ
Hình 4.1: Tình hình xuất hiện bệnh trên cá thát lát
Theo nhận định từ phía hộ nuôi, bệnh trên cá còm xảy ra hầu như quanh năm nhưng thường tập trung vào các tháng mùa mưa. Điều này có thể
xuất phát từ việc môi trường vào các tháng mùa mưa thường thay đổi và gây sốc cho cá, môi trường nước nhiều vật chất hữu cơ và mầm bệnh theo nguồn
nước xâm nhiễm vào ao nuôi gây bệnh. Ngoài ra, hiện nay,dịch bệnh có phần tiến triển phức tạp và gia tăng nhiều hơn so với những năm đầu mới triển khai mô hình. Điều này có thể là do mật độ thâm canh ngày càng cao, môi trường trong ao nuôi tích tụ mầm bệnh trong thời gian dài và quá trình cải tạo cũng đã không diệt hết các mầm bệnh ở những vụ trước.
Trước tình hình xuất bệnh xảy ra trên cá còm ngày càng nhiều đòi hỏi công tác phòng và điều trị bệnh càng trở nên cấp thiết và chú trọng hơn. Hiện
này, để đối phó với dịch bệnh, thuốc kháng sinh vẫn là lựa chọn phổ biến với
người nuôi, 100% người nuôi thường sử dụng kháng sinh để điều trị khi dịch bệnh xảy ra. Theo kết quả điều tra cho thấy, tổng cộng khoảng 12 loại kháng sinh, thuộc 7 nhóm kháng sinh là: beta lactams, tetracyclines, fenicols, quinolones, polymyxins, aminoglycosids và trimethorprim+sulfamethoxazole,
được người nuôi sử dụng để điều trị bệnh nhưng đa số các hộ sử dụng thuốc theo kinh nghiệm bản thân từ những vụ nuôi trước hoặc theo sự hướng dẫn của những người nuôi có kinh nghiệm trong vùng, của cửa hàng thuốc hoặc sự hướng dẫn của trại giống nơi mình mua giống. Những loại kháng sinh được
người nuôi sử dụng phổ biến gồm oxytetracycline, doxycycline, florfenicol, trimethorprim+sulfamethoxazole, chloramphenicol, streptomycin, ampicillin, amoxicilin, colistin, enrofloxacin, ciprofloxacin, cephalexin. Người nuôi sử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ngừng hao hụt. Tuy nhiên, qua những nhận định của nhiều hộ nuôi cho thấy, những năm gần đây, khi mà mô hình nuôi ngày càng nhân rộng và phát triển thì tình hình dịch bệnh diễn ra phức tạp và khó điều trị hơn trước. Điều này cho thấy có thề việc sử dụng thuốc không đúng cách, đúng liều lượng quy định
đã tạo điều kiện cho mầm bệnh kháng với thuốc và khó tiêu diệt hơn, ngoài ra,
còn dẫn đến tình trạng môi trường ô nhiễm hơn trước.
Hình 4.2: Các nhóm kháng sinh được sử dụng điều trị bệnh cho cá thát lát còm
Qua Hình 4.2 có thể thấy, nhóm kháng sinh beta lactams và quinolones thường
được người nuôi sử dụng để điều trị bệnh do vi khuẩn nhất (60%). Ngược lại, có thể là do hiệu quả điều trị không hiệu quả cao nên các khánh sinh nhóm tetracyclines và kháng sinh trimethorprim+sulfamethoxazole ít được chọn lựa sử dụng (36%). Ngoài ra, kết quả phỏng vấn cũng cho thấy, hiện nay, việc sử
dụng kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản nói chung và trong nuôi cá thát lát nói riêng còn nhiều bất cập, nhiều loại kháng sinh đã cấm sử dụng vẫn được
người nuôi lựa chọn sử dụng, liều lượng, quy trình điều trị không được áp dụng hợp lý. Từ đó phát sinh nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc gây khó khăn
cho việc điều trị trong tương lai
4.2. Kết quả thu mẫu cá thát lát còm bệnh
4.2.1 Số lượng mẫu cá thát lát còm bệnh
Trong 25 hộ nuôi được phỏng vấn thông tin kỹ thuật, đề tài tiến hành thu mẫu cá thát lát còm có biểu hiện bệnh và cá khỏe (Mẫu đối chứng). Kết quả thu mẫu được tổng hợp trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1: Kết quả thu mẫu cá bệnh ở Đồng Tháp và Hậu Giang
Mẫu cá bệnh Số chủng VK Địa điểm Mẫu cá khỏe
Đốm đỏ Đỏ lườn Tổng số mẫu cá Đốm đỏ Đỏ lườn Đồng Tháp 15 17 32 64 15 24 Hậu Giang 30 33 42 105 32 38 Tổng 45 50 74 169 47 62 % tổng số 100 40,32 59,68 43,12 56,88 Từ Bảng 4.1 cho thấy, đề tài đã thu được 124 mẫu cá bệnh và 45 mẫu cá khỏe. Trong đó, phần lớn là cá có biểu hiện của 2 bệnh đốm đỏ và đỏ lườn.
Theo đó, mẫu cá bệnh đỏ lườn có xu hướng nhiều hơn với 74 mẫu cá có biểu hiện bệnh xuyết huyết (59,68%), trong khi chỉ có khoảng 50 mẫu cá thu được
ở 2 tỉnh có biểu hiện bệnh đốm đỏ (40,32%). Do nghề nuôi cá thát lát còm ở
Hậu Giang phát triển mạnh nên số ao nuôi đề tài có thể thu mẫu được nhiều
hơn, vì vậy số lượng cá bệnh cũng như số chủng vi khuẩn thu được ở địa
phương này đều nhiều hơn tỉnh Đồng Tháp.