2.3.1 Những đặc điểm của thuốc kháng sinh
Cho đến nay thuốc kháng sinh vẫn còn sử dụng một cách phổ biến để
phòng trị bệnh vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. Thuốc kháng sinh là hợp chất được sản xuất bởi sinh vật hay tổng hợp, ở nồng độ thấp thì có thểức chế
hoặc giết các sinh vật khác. Thuốc kháng sinh được Fleming phát hiện đầu tiên là penicillin vào năm 1929. Những năm sau thuốc kháng sinh khác được sản xuất từ vi sinh vật hoặc tổng hợp hay bán tổng hợp. Với những tác dụng hữu hiệu của các thuốc kháng sinh đối với mầm bệnh nên chúng được dùng rộng rãi trong việc điều trị bệnh cho người, vật nuôi nói chung ở cả động vật thủy sản (Prescott et al., 2000).
Các loại thuốc kháng sinh tác động vào tế bào vi khuẩn thông quá các
cơ chế như: (1) Tác động lên quá trình tạo thành tế bào vi khuẩn như các
kháng sinh nhóm thuốc beta lactam; (2) Các kháng sinh nhóm polymcycin tác
động lên màng nguyên sinh chất, làm mất phương hướng hoạt động của màng; (3) Các kháng sinh nhóm fenicol và aminoglycoside gây rối loạn và ức chế sự
tổng hợp protein của vi khuẩn ở mức ribosome; (4) Kháng sinh nhóm quinolone và macrolide tác dụng ức chế tổng hợp acid nucleic; (5) Các kháng
sinh như trimethoprim gây ức chế quá trình tạo acid folic (Prescott et al., 2000).
Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản không theo qui định đã tạo điều kiện thuận lợi hình thành các vi khuẩn kháng kháng sinh, dẫn đến những tác hại nghiêm trọng cho động vật nuôi và cả con người. Sự kháng thuốc của vi khuẩn nói chung và của vi khuẩn gây bệnh trên trên động vật thủy sản nói riêng đã được quan tâm, nghiên cứu từ rất lâu. Từ những năm 50 của thế kỷ 20 các nhà khoa học Nhật Bản đã nghiên cứu sự lan truyền rộng rãi của các loài vi khuẩn kháng cùng lúc nhiều loại thuốc kháng sinh thông dụng.
Kháng thuốc của vi khuẩn là hiện tượng 1 chủng vi khuẩn nào đó có
khả năng chống lại tác dụng ức chế, kìm hãm, tiêu diệt của 1 số loại kháng
sinh đối với vi khuẩn đó. Khả năng kháng thuốc này được qui định bởi gen kháng thuốc nằm trên plasmid, nằm trong nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn (Prescott et al., 2000). Cũng theo tác giả này thì sự đề kháng thuốc của vi khuẩn có 2 dạng:
(1) Kháng thuốc tự nhiên: do bản chất của vi khuẩn có thể kháng với 1 hay nhiều loại kháng sinh nào đó. Đây là hiện tượng bất khả kháng vì nó thuộc về bản chất của vi khuẩn. VD: Streptococcus kháng tự nhiên với aminosid, Aeromonas kháng tự nhiên với ampicillin, E. ictaluri kháng tự nhiên với colistin. (2) Kháng thuốc thu nhận: vi khuẩn thu được những yếu tố
kháng thuốc trong quá trình sống do đột biến ngẫu nhiên hoặc do tiếp xúc. Trong kiểu kháng thuốc này có 2 dạng đề kháng đó là: (1) Kháng thuốc do đột biến của nhiễm sắc thể, có liên quan đến gen. Loại này ít xảy ra (10% - 20%), mang tính tự phát. Loại này phát triển chậm nhưng bền. (2) Và kháng thuốc do plasmid. Loại này lan tràn nhanh do tiếp hợp hoặc qua trung gia thực khuẩn thể (chiếm 80% - 90%). Sự kháng bằng plasmid có thể tạo ra nhiều chủng vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng sinh, dẫn đến hiện tượng đa kháng thuốc ở
Theo Bùi Kim Tùng (2001) thì kháng thuốc do plasmid không bền. Loại này qua vài thế hệ, plasmid có thể biến mất và đề kháng không còn. Bên cạnh đó, còn có dạng kháng thuốc chai lì, ở đây các khuẩn này chịu đựng được tác dụng của kháng sinh mà không bị tiêu diệt. chúng sống trong tình trạng trì trệ, khi gặp thuận lợi lại tiếp tục phát triển và thế hệ sau vẫn nhạy cảm với thuốc. Một số cơ chế kháng kháng sinh hình thành ở vi khuẩn để chống lại tác
động của thuốc kháng sinh được các tác giả mô tả như sau: (Prescott et al., 2000; Treves-Brown, 2000; Bùi Kim Tùng, 2001)
(1) Tiết enzym phân hủy thuốc: VD: nhiều vi khuẩn tiết ra β-lactamase phân hủy kháng sinh nhóm β-lactam. (2) Giảm hấp thụ kháng sinh: màng tế bào thay đổi tính thấm chọn lọc và thuốc kháng sinh không thể vào trong tế
bào. (VD: các khuẩn kháng tetracycline, aminosid). (3) Thay đổi điểm tác dụng: thay đổi các thụ thể trên ribosom mà kháng sinh gắn vào kháng sinh vô hiệu. (VD: các khuẩn kháng aminosid). (4) Đổi quy trình tổng hợp: các vi khuẩn thay đổi quy trình tổng hợp vỏ tế bào, hay các quy trình khác kháng sinh vô hiệu (vi khuẩn kháng với penicillin). (5) Sản xuất chất cạnh tranh với kháng sinh: có những vi khuẩn tiết ra nhiều APAB (acid para aminobenzoic) là chất kháng sulfonamide nên chúng đề kháng được với kháng sinh này.
Hiện nay trên thị trường tồn tại nhiều loại thuốc kháng sinh và việc sử
dụng chúng rất tùy tiện, không đúng liều, đúng cách vì thế mà vi khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng, đặc biệt là sự đa kháng thuốc được tìm thấy ngày một nhiều hơn, với nhiều loại thuốc hơn.
2.3.2 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá. 2.3.2.1 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh ở cá 2.3.2.1 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh ở cá trên thế giới
Từ lâu các nhà khoa học đã quan tâm đến vấn đề kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản nói riêng. Nhóm vi khuẩn A. hydrophila cũng không nằm ngoài xu hướng đó. Từ rất lâu
đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
này đã được công bố rộng rãi như: Aoki (1974); Fass (1981); Akashi (1986);
Austin and Austin (1987); Chang (1987). Mức độ kháng với nhiều loại kháng
sinh như ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, nitrofurantoin, kháng sinh nhóm sulfonamides, tetracyclines của loài vi khuẩn này trên cá nheo Mỹ
(Ictalurus punctatus) đã được ghi nhận (Aoki, 1988; DePaola et al., 1988). Bên cạnh đó, những công trình nghiên cứu về cơ chế kháng thuốc cũng đã
được tiến hành. Đối với vi khuẩn A. hydrophila được xem là kháng tự nhiên với nhóm β-lactam, cơ chế kháng nhóm thuốc này đã được tìm hiểu bởi Wen-
Chen (1988). Vi khuẩn đã tiết ra enzyme β-lactamase làm vỡ vòng β-lactam, dẫn đến đề kháng được với kháng sinh β-lactam. Tiếp theo đó, có nhiều nhóm
kháng sinh được ghi nhận là đã bị nhóm vi khuẩn này đề kháng như
trimethoprim-sulfamethoxazole, gentamycin, cefazolin, ticarcillin, cefalotin, cefalexin, erythromycin, oxytetracycline, với giá trị MIC khá cao, có tới 24,32% chủng có giá trị MIC trên 128ppm và chỉ có 4,75% chủng nhạy với các kháng sinh ở nồng độ thấp 0,1-0,25ppm (Akinbowel, 2006).
Bên cạnh đó, 2 loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda thuộc nhóm vi khuẩn Edwardsiella spp. là 2 tác nhân gây bệnh phổ biến trên cá cũng đã được nghiên cứu và có nhiều ghi nhận về đặc tính nhạy, kháng với nhiều loại thuốc. Hawke (1979) là nhà khoa học đầu tiên đã thực hiện
kháng sinh đồ trên 10 chủng vi khuẩn E. ictaliri. Sau đó, Walman và Shotts
(1986) kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 chủng E. ictaluri phân lập được ở
Hoa kỳ với 37 loại thuốc kháng sinh, kết quả cho thấy, đa số vi khuẩn kháng với nhóm sulfonamides và thuốc colistin nhưng lại nhạy với nhóm penicillins, quinolones, tetracyclines và kháng sinh chloramphenicol. Tương tự, vi khuẩn
E. tarda phân lập từ cá bệnh tại Mỹ và Đài Loan cũng đã được ghi nhận là nhạy cao với các loại kháng sinh ampicillin, chloramphenicol, tetracycline, sulfamethoxazole-trimethoprim, cefotaxim, gentamycin, nhưng trong đó 90%
số chủng vi khuẩn kháng cao với polymycin và colistin (Reinhardt et al.,
1985; Walman and Shotts, 1986). Tương tự, tác giả Reger (1993) cũng ghi
nhận các chủng E. tarda nhạy cao với kháng sinh thuộc nhóm quinolones, kháng sinh gentamycin và doxycycline. Một số công trình công bố gần đây
cũng cho kết quả nhạy tương tự với nhóm kháng sinh tetracyclines, aminoglycosides, beta lactams, quinolones và các kháng sinh chloramphenicol, gentamycin (Stock and Wiedemann, 2001; Lim et al., 2003).
Tuy nhiên, không như loài vi khuẩn Aeromonas spp. có enzyem β-lactamase nên có khả năng kháng tự nhiên với nhóm thuốc β-lactam, những chủng E. tarda và E.ictaluri cũng sản xuất được enzyme β-lactamase nhưng chúng
không thể hiện tính kháng đối với nhóm kháng sinh này (Clark et al., 1991; Reger, 1993) nhưng nhóm vi khuẩn này lại được ghi nhận là có thể kháng tự
nhiên với colistin và có khả năng kháng cao với kháng sinh nhóm macrolides và glycopeptides.
Đối với bệnh trắng đuôi do vi khuẩn F. columnare gây ra, là một dịch
bệnh nguy hiểm gây hao hụt cao trên nhiều loại cá nước ngọt, trên thế giới có nhiều tác giả đã đưa ra nhiều ý kiến khác nhau về việc điều trị, trong đó kháng
sinh và hóa chất là hai biện pháp được dùng hiệu quả và phổ biến nhất (Soumalainen et al., 2005). Tuy nhiên, do đây là nhóm vi khuẩn ngoại ký sinh nên việc điều trị bằng hóa chất thường được nhiều tác giả đề cập hơn, những
nghiên cứu về dùng kháng sinh điều trị dịch bệnh này chỉ được một số tác giả
nghiên cứu như sau. Theo Tripathi et al. (2003), điều trị bệnh Columnaris bằng các loại kháng sinh khác nhau bao gồm benzylpenicillin, oxytetracycline, chloramphenicol… cho hiệu quả cao. Trong khi phương pháp của hai tác giả
Robert (1998), Schäperclaus et al. (1992) và Francis-Floyd (1998) là dùng Terramycin® (oxytetracycline HCl) trị bệnh Columnaris với liều lượng 50- 100 mg/kg của trọng lượng cơ thể. Ngoài ra sau khi đã thử nghiệm với nhiều loại kháng sinh khác nhau, Kubilay et al. (2008) còn xác định vi khuẩn F. columnare nhạy với rất nhiều loại kháng sinh trong đó có chloramphenicol
(30μg), furazolidone (100μg), nitrofurantoin (300µg), erythromycin (15μg) và streptomycin (10μg).
Ngoài ra, sự đa kháng thuốc của các họ vi khuẩn: Enterobacteriacae,
Pseudomonas, Vibrio cũng đã được ghi nhận. Nghiên cứu của Akinbowale et al. (2006) về sự kháng thuốc của vi khuẩn phân lập từ môi trường nuôi thủy sản ở Úc với 19 loại kháng sinh, trong đó: Vibrio spp. chiếm 60%, Aeromonas spp. 21%, Pseudomonas spp. 4%, E. tarda 2%, Flavobacterium spp. 2% cho thấy sự kháng cao của Pseudomonas spp. với cefotaxim (75%), chloramfenicol , flofenicol, sxt (50%), ampicillin (50%), các giống vi khuẩn còn lại kháng với ampicillin (54,8%), erythromycin (47,1%), cefotaxim (41,4%).
Ngoài những thông tin về sự kháng thuốc của các nhóm vi khuẩn Gram
âm đã được nhiều tác giả công bố, những công trình nghiên cứu về sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là nhóm Streptococcus spp. gây bệnh trên các loài cá nước ngọt cũng được một số tác giả nước ngoài đề
cập đến (Horodniceanu et al., 1979; Culebras et al., 2002; Lim, 2003; Martel, 2004; Domelier et al., 2008; Park et al., 2009). Từ những năm 1979 các
nghiên cứu của Horodniceanu về sự kháng thuốc của 18 chủng Streptococcus agalactie đối với 20 loại thuốc kháng sinh đã ghi nhận loài vi khuẩn này kháng với nhiều loại kháng sinh như tetracycline, chloramphenicol, macrolide (erythromycine), lincomycine với giá trị MIC dao động từ 0,1-250 ppm. Nghiên cứu của Culebras (2002) gần đây cho thấy loài vi khuẩn Gram dương này đề kháng cao với kháng sinh macrolide và tetracycline ở mức MIC 90% là
64 ppm. Tương tự, loài Streptococcus iniae phân lập trên cá bơn (Paralicthys olivaceus) tại Nhật cũng được công bố là kháng cao với kháng sinh nhóm macrolide và kháng sinh tetracycline với giá trị MIC lên đến 256 ppm và 128 ppm (Park et al., 2009). Tuy nhiên loài vi khuẩn này cũng nhạy với nhiều loại kháng sinh phổ biến như cefotaxim, ofloxacin, penicillin, cephalexin, gentamicin (Park et al., 2009; Lim et al., 2003).
2.3.2.2 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá ở Việt Nam ở Việt Nam
Tại Việt Nam, nhiều chủng A. hydrophila phân lập từ cá tra cho thấy kháng cao với streptomycin nhưng lại nhạy với gentamycin. Ngoài ra, một số
loại kháng sinh khác như: sulfonamide và amoxicillin cũng được phát hiện là
đã bị kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá tra tại ĐBSCL (Phuong et al., 2005). Tương tự, nghiên cứu của Phạm Thanh Hương (2010) cũng ghi
nhận được những chủng A. hydrophila phân lập trên cá tra tại Cần Thơ, Đồng Tháp, Sóc Trăng nhạy cao với tetracycline, florfenicol, chloramphenicol và kháng cao với sulfamethoxazole-trimethoprim (32,8%), streptomycin (55,7%); giá trị MIC của streptomycin khá cao đến 64ppm, ngoài ra, giá trị MIC 90% của các loại kháng sinh như: florfenicol, enrofloxacin, oxytetracycline có giá trị lần lượt là 12,7 ppm, 6,1 ppm, 48 ppm. Nghiên cứu cũng cho thấy có đến 23% các chủng vi khuẩn thể hiện sự đa kháng.
Ngoài ra, có rất nhiều nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn E. ictaluri đã được công bố, ghi nhận sự đa kháng cao với nhiều loại kháng sinh phổ biến (Dung et al., 2008; Từ Thanh Dung và ctv 2010; Nguyễn Thiện Nam
và ctv, 2010; Phạm Thanh Hương, 2011). Tương tự, loài vi khuẩn E. tarda
cũng được nhiều tác giả trên thế giới tập trung nghiên cứu về sự kháng thuốc
do đặc tính gây bệnh phổ biến của loài vi khuẩn này. Tuy nhiên tại Việt Nam hiện vẫn chưa có công trình nào được công bố chính thức về sự kháng thuốc của loài vi khuẩn này trên các loại cá.
Tiếp sau đó, nghiên cứu của Sarter (2007) với 92 dòng vi khuẩn (Enterobacteriaceae spp. chiếm 49,1%, Pseudomonad spp. chiếm 35,2% và
Vibrionaceae chiếm 15,7% ) được phân lập từ môi trường thuộc 3 trại nuôi cá
da trơn tại Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy sự kháng cao của các chủng vi khuẩn này với 6 loại thuốc kháng sinh oxytetracycline, chloramphenicol, trimethoprim-sulphamethoxazol, nitrofurantion, nalidic acid và ampicillin. Tổng cộng có 73 dòng là đa kháng thuốc (kháng trên 2 loại kháng sinh). Phần lớn các chủng vi khuẩn đều có hiện tượng đa kháng thuốc.
Theo Phuong et al., (2005) có nhiều loại thuốc kháng sinh thường được sử dụng ở các trại nuôi và sản xuất giống cá da trơn tại Đồng bằng sông Cửu
Long như: -lactams, quinolones, aminosids, sulfonamides, tetracyclines.
Nhưng việc kết hợp nhiều loại kháng sinh với nhau trong phòng và trị bệnh cũng được người nuôi sử dụng phổ biến. Những tác giả này đã kiểm tra sự
kháng thuốc của các dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường nước và bùn đáy ở
các trại nuôi các trại nuôi các đối tượng khác nhau: cá da trơn, cá rô phi ở 5 tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả cho thấy 90% dòng vi khuẩn
kháng với tetracycline, 76% kháng với ampicillin, 100% kháng với chloramphenicol, 65% kháng với nitrofurantoin và 89% kháng với trimethoprim-sulphamethoxazole. Từ kết quả, có thể thấy sự kháng thuốc của các vi khuẩn trong môi trường ao nuôi thuỷ sản đang ở mức độ rất cao.
Từ những thông tin nêu trên cho thấy, đặc tính kháng kháng sinh của vi
khuẩn này thay đổi rất đa dạng, chúng khác nhau qua từng năm và từng vùng
địa lý.Vì thế hiện nay rất cần thiết tiến hành thí nghiệm xác định đặc tính
kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nhằm mang đến những biện pháp điều
Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Thủy sản- Đại học Cần Thơ
từ tháng 10/2012 đến tháng 07/2013.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
Thiết bị: Tủ cấy, tủấm, tủ sấy, tủ đông, máy tiệt trùng, máy vortex.
Dụng cụ: Bộ tiểu phẩu, que cấy vi sinh, đèn cồn, đĩa petri, ống nghiệm.
Hóa chất:
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Tryptic Soya Agar (TSA, Merck ). Môi
trường chọn lọc 2 giống vi khuẩn Pseudomonas và Aeromonas Selective Agar (GSP Agar, Merck). Môi trường nuôi vi khuẩn Nutrient Broth (NB, Merk, Darmstadt, Germany).
Các loại kháng sinh đĩa giấy: ampicillin (AMP/10µg), doxycyclinee (DO/30µg), oxytetracycline (OXY/30µg), enrofloxacin (ENR/5µg), florfenicol (FFC/30µg), flumequine (UB/30µg), streptomycin (S/10µg), trimethoprim+sulfamethoxazole (SXT/1,25/23,75µg), cephalexin (CL/10µg), cefotaxim (CTX/10µg), cefazolin (KZ/10µg), colistin (CT/50 g) (Hãng Oxoid).
Kháng sinh tinh: ampicillin, enrofloxacin, oxytetracycline, trimethoprim+sulfamethoxazole (hãng Sigma).
3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp điều tra 3.3.1 Phương pháp điều tra
Điều tra thu mẫu để xác định nguyên nhân và tác nhân gây bệnh trên cá thát còm nuôi trong ao ở một số địa bàn tỉnh Hậu giang và Đồng Tháp. Điều
tra theo phương pháp chuẩn bị câu hỏi và các thông tin có liên quan đến điều kiện bộc phát bệnh (các kỹ thuật nuôi, cách quản lý môi trường và dịch bệnh).
3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá và phân lập vi khuẩn
Địa điểm thu: Cá thát lát còm có biểu hiện bệnh ở hai tỉnh: Hậu Giang và Đồng Tháp. Cá được thu từ 15 ao và bể nuôi có biểu hiện bệnh, mỗi lần thu 6-8 con cá biểu hiện bệnh và 2-4 con cá khỏe. Cá được giữ sống trong thùng xốp có sục khí, vận chuyển về phòng thí nghiệm của bộ môn Bệnh học Thủy sản-Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Sau đó, mẫu cá được tiến hành phân tích trong ngày và chỉ phân tích mẫu khi cá còn sống. Cá được phân tích
mẫu theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993). Vi khuẩn được phân lập từ các cơ quan khác nhau: gan, thận, tỳ tạng của từng con cá và cấy trên môi