trên thế giới
Từ lâu các nhà khoa học đã quan tâm đến vấn đề kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản nói riêng. Nhóm vi khuẩn A. hydrophila cũng không nằm ngoài xu hướng đó. Từ rất lâu
đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
này đã được công bố rộng rãi như: Aoki (1974); Fass (1981); Akashi (1986);
Austin and Austin (1987); Chang (1987). Mức độ kháng với nhiều loại kháng
sinh như ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, nitrofurantoin, kháng sinh nhóm sulfonamides, tetracyclines của loài vi khuẩn này trên cá nheo Mỹ
(Ictalurus punctatus) đã được ghi nhận (Aoki, 1988; DePaola et al., 1988). Bên cạnh đó, những công trình nghiên cứu về cơ chế kháng thuốc cũng đã
được tiến hành. Đối với vi khuẩn A. hydrophila được xem là kháng tự nhiên với nhóm β-lactam, cơ chế kháng nhóm thuốc này đã được tìm hiểu bởi Wen-
Chen (1988). Vi khuẩn đã tiết ra enzyme β-lactamase làm vỡ vòng β-lactam, dẫn đến đề kháng được với kháng sinh β-lactam. Tiếp theo đó, có nhiều nhóm
kháng sinh được ghi nhận là đã bị nhóm vi khuẩn này đề kháng như
trimethoprim-sulfamethoxazole, gentamycin, cefazolin, ticarcillin, cefalotin, cefalexin, erythromycin, oxytetracycline, với giá trị MIC khá cao, có tới 24,32% chủng có giá trị MIC trên 128ppm và chỉ có 4,75% chủng nhạy với các kháng sinh ở nồng độ thấp 0,1-0,25ppm (Akinbowel, 2006).
Bên cạnh đó, 2 loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda thuộc nhóm vi khuẩn Edwardsiella spp. là 2 tác nhân gây bệnh phổ biến trên cá cũng đã được nghiên cứu và có nhiều ghi nhận về đặc tính nhạy, kháng với nhiều loại thuốc. Hawke (1979) là nhà khoa học đầu tiên đã thực hiện
kháng sinh đồ trên 10 chủng vi khuẩn E. ictaliri. Sau đó, Walman và Shotts
(1986) kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 chủng E. ictaluri phân lập được ở
Hoa kỳ với 37 loại thuốc kháng sinh, kết quả cho thấy, đa số vi khuẩn kháng với nhóm sulfonamides và thuốc colistin nhưng lại nhạy với nhóm penicillins, quinolones, tetracyclines và kháng sinh chloramphenicol. Tương tự, vi khuẩn
E. tarda phân lập từ cá bệnh tại Mỹ và Đài Loan cũng đã được ghi nhận là nhạy cao với các loại kháng sinh ampicillin, chloramphenicol, tetracycline, sulfamethoxazole-trimethoprim, cefotaxim, gentamycin, nhưng trong đó 90%
số chủng vi khuẩn kháng cao với polymycin và colistin (Reinhardt et al.,
1985; Walman and Shotts, 1986). Tương tự, tác giả Reger (1993) cũng ghi
nhận các chủng E. tarda nhạy cao với kháng sinh thuộc nhóm quinolones, kháng sinh gentamycin và doxycycline. Một số công trình công bố gần đây
cũng cho kết quả nhạy tương tự với nhóm kháng sinh tetracyclines, aminoglycosides, beta lactams, quinolones và các kháng sinh chloramphenicol, gentamycin (Stock and Wiedemann, 2001; Lim et al., 2003).
Tuy nhiên, không như loài vi khuẩn Aeromonas spp. có enzyem β-lactamase nên có khả năng kháng tự nhiên với nhóm thuốc β-lactam, những chủng E. tarda và E.ictaluri cũng sản xuất được enzyme β-lactamase nhưng chúng
không thể hiện tính kháng đối với nhóm kháng sinh này (Clark et al., 1991; Reger, 1993) nhưng nhóm vi khuẩn này lại được ghi nhận là có thể kháng tự
nhiên với colistin và có khả năng kháng cao với kháng sinh nhóm macrolides và glycopeptides.
Đối với bệnh trắng đuôi do vi khuẩn F. columnare gây ra, là một dịch
bệnh nguy hiểm gây hao hụt cao trên nhiều loại cá nước ngọt, trên thế giới có nhiều tác giả đã đưa ra nhiều ý kiến khác nhau về việc điều trị, trong đó kháng
sinh và hóa chất là hai biện pháp được dùng hiệu quả và phổ biến nhất (Soumalainen et al., 2005). Tuy nhiên, do đây là nhóm vi khuẩn ngoại ký sinh nên việc điều trị bằng hóa chất thường được nhiều tác giả đề cập hơn, những
nghiên cứu về dùng kháng sinh điều trị dịch bệnh này chỉ được một số tác giả
nghiên cứu như sau. Theo Tripathi et al. (2003), điều trị bệnh Columnaris bằng các loại kháng sinh khác nhau bao gồm benzylpenicillin, oxytetracycline, chloramphenicol… cho hiệu quả cao. Trong khi phương pháp của hai tác giả
Robert (1998), Schäperclaus et al. (1992) và Francis-Floyd (1998) là dùng Terramycin® (oxytetracycline HCl) trị bệnh Columnaris với liều lượng 50- 100 mg/kg của trọng lượng cơ thể. Ngoài ra sau khi đã thử nghiệm với nhiều loại kháng sinh khác nhau, Kubilay et al. (2008) còn xác định vi khuẩn F. columnare nhạy với rất nhiều loại kháng sinh trong đó có chloramphenicol
(30μg), furazolidone (100μg), nitrofurantoin (300µg), erythromycin (15μg) và streptomycin (10μg).
Ngoài ra, sự đa kháng thuốc của các họ vi khuẩn: Enterobacteriacae,
Pseudomonas, Vibrio cũng đã được ghi nhận. Nghiên cứu của Akinbowale et al. (2006) về sự kháng thuốc của vi khuẩn phân lập từ môi trường nuôi thủy sản ở Úc với 19 loại kháng sinh, trong đó: Vibrio spp. chiếm 60%, Aeromonas spp. 21%, Pseudomonas spp. 4%, E. tarda 2%, Flavobacterium spp. 2% cho thấy sự kháng cao của Pseudomonas spp. với cefotaxim (75%), chloramfenicol , flofenicol, sxt (50%), ampicillin (50%), các giống vi khuẩn còn lại kháng với ampicillin (54,8%), erythromycin (47,1%), cefotaxim (41,4%).
Ngoài những thông tin về sự kháng thuốc của các nhóm vi khuẩn Gram
âm đã được nhiều tác giả công bố, những công trình nghiên cứu về sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là nhóm Streptococcus spp. gây bệnh trên các loài cá nước ngọt cũng được một số tác giả nước ngoài đề
cập đến (Horodniceanu et al., 1979; Culebras et al., 2002; Lim, 2003; Martel, 2004; Domelier et al., 2008; Park et al., 2009). Từ những năm 1979 các
nghiên cứu của Horodniceanu về sự kháng thuốc của 18 chủng Streptococcus agalactie đối với 20 loại thuốc kháng sinh đã ghi nhận loài vi khuẩn này kháng với nhiều loại kháng sinh như tetracycline, chloramphenicol, macrolide (erythromycine), lincomycine với giá trị MIC dao động từ 0,1-250 ppm. Nghiên cứu của Culebras (2002) gần đây cho thấy loài vi khuẩn Gram dương này đề kháng cao với kháng sinh macrolide và tetracycline ở mức MIC 90% là
64 ppm. Tương tự, loài Streptococcus iniae phân lập trên cá bơn (Paralicthys olivaceus) tại Nhật cũng được công bố là kháng cao với kháng sinh nhóm macrolide và kháng sinh tetracycline với giá trị MIC lên đến 256 ppm và 128 ppm (Park et al., 2009). Tuy nhiên loài vi khuẩn này cũng nhạy với nhiều loại kháng sinh phổ biến như cefotaxim, ofloxacin, penicillin, cephalexin, gentamicin (Park et al., 2009; Lim et al., 2003).
2.3.2.2 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá ở Việt Nam ở Việt Nam
Tại Việt Nam, nhiều chủng A. hydrophila phân lập từ cá tra cho thấy kháng cao với streptomycin nhưng lại nhạy với gentamycin. Ngoài ra, một số
loại kháng sinh khác như: sulfonamide và amoxicillin cũng được phát hiện là
đã bị kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá tra tại ĐBSCL (Phuong et al., 2005). Tương tự, nghiên cứu của Phạm Thanh Hương (2010) cũng ghi
nhận được những chủng A. hydrophila phân lập trên cá tra tại Cần Thơ, Đồng Tháp, Sóc Trăng nhạy cao với tetracycline, florfenicol, chloramphenicol và kháng cao với sulfamethoxazole-trimethoprim (32,8%), streptomycin (55,7%); giá trị MIC của streptomycin khá cao đến 64ppm, ngoài ra, giá trị MIC 90% của các loại kháng sinh như: florfenicol, enrofloxacin, oxytetracycline có giá trị lần lượt là 12,7 ppm, 6,1 ppm, 48 ppm. Nghiên cứu cũng cho thấy có đến 23% các chủng vi khuẩn thể hiện sự đa kháng.
Ngoài ra, có rất nhiều nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn E. ictaluri đã được công bố, ghi nhận sự đa kháng cao với nhiều loại kháng sinh phổ biến (Dung et al., 2008; Từ Thanh Dung và ctv 2010; Nguyễn Thiện Nam
và ctv, 2010; Phạm Thanh Hương, 2011). Tương tự, loài vi khuẩn E. tarda
cũng được nhiều tác giả trên thế giới tập trung nghiên cứu về sự kháng thuốc
do đặc tính gây bệnh phổ biến của loài vi khuẩn này. Tuy nhiên tại Việt Nam hiện vẫn chưa có công trình nào được công bố chính thức về sự kháng thuốc của loài vi khuẩn này trên các loại cá.
Tiếp sau đó, nghiên cứu của Sarter (2007) với 92 dòng vi khuẩn (Enterobacteriaceae spp. chiếm 49,1%, Pseudomonad spp. chiếm 35,2% và
Vibrionaceae chiếm 15,7% ) được phân lập từ môi trường thuộc 3 trại nuôi cá
da trơn tại Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy sự kháng cao của các chủng vi khuẩn này với 6 loại thuốc kháng sinh oxytetracycline, chloramphenicol, trimethoprim-sulphamethoxazol, nitrofurantion, nalidic acid và ampicillin. Tổng cộng có 73 dòng là đa kháng thuốc (kháng trên 2 loại kháng sinh). Phần lớn các chủng vi khuẩn đều có hiện tượng đa kháng thuốc.
Theo Phuong et al., (2005) có nhiều loại thuốc kháng sinh thường được sử dụng ở các trại nuôi và sản xuất giống cá da trơn tại Đồng bằng sông Cửu
Long như: -lactams, quinolones, aminosids, sulfonamides, tetracyclines.
Nhưng việc kết hợp nhiều loại kháng sinh với nhau trong phòng và trị bệnh cũng được người nuôi sử dụng phổ biến. Những tác giả này đã kiểm tra sự
kháng thuốc của các dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường nước và bùn đáy ở
các trại nuôi các trại nuôi các đối tượng khác nhau: cá da trơn, cá rô phi ở 5 tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả cho thấy 90% dòng vi khuẩn
kháng với tetracycline, 76% kháng với ampicillin, 100% kháng với chloramphenicol, 65% kháng với nitrofurantoin và 89% kháng với trimethoprim-sulphamethoxazole. Từ kết quả, có thể thấy sự kháng thuốc của các vi khuẩn trong môi trường ao nuôi thuỷ sản đang ở mức độ rất cao.
Từ những thông tin nêu trên cho thấy, đặc tính kháng kháng sinh của vi
khuẩn này thay đổi rất đa dạng, chúng khác nhau qua từng năm và từng vùng
địa lý.Vì thế hiện nay rất cần thiết tiến hành thí nghiệm xác định đặc tính
kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nhằm mang đến những biện pháp điều
Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Thủy sản- Đại học Cần Thơ
từ tháng 10/2012 đến tháng 07/2013.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
Thiết bị: Tủ cấy, tủấm, tủ sấy, tủ đông, máy tiệt trùng, máy vortex.
Dụng cụ: Bộ tiểu phẩu, que cấy vi sinh, đèn cồn, đĩa petri, ống nghiệm.
Hóa chất:
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Tryptic Soya Agar (TSA, Merck ). Môi
trường chọn lọc 2 giống vi khuẩn Pseudomonas và Aeromonas Selective Agar (GSP Agar, Merck). Môi trường nuôi vi khuẩn Nutrient Broth (NB, Merk, Darmstadt, Germany).
Các loại kháng sinh đĩa giấy: ampicillin (AMP/10µg), doxycyclinee (DO/30µg), oxytetracycline (OXY/30µg), enrofloxacin (ENR/5µg), florfenicol (FFC/30µg), flumequine (UB/30µg), streptomycin (S/10µg), trimethoprim+sulfamethoxazole (SXT/1,25/23,75µg), cephalexin (CL/10µg), cefotaxim (CTX/10µg), cefazolin (KZ/10µg), colistin (CT/50 g) (Hãng Oxoid).
Kháng sinh tinh: ampicillin, enrofloxacin, oxytetracycline, trimethoprim+sulfamethoxazole (hãng Sigma).
3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp điều tra 3.3.1 Phương pháp điều tra
Điều tra thu mẫu để xác định nguyên nhân và tác nhân gây bệnh trên cá thát còm nuôi trong ao ở một số địa bàn tỉnh Hậu giang và Đồng Tháp. Điều
tra theo phương pháp chuẩn bị câu hỏi và các thông tin có liên quan đến điều kiện bộc phát bệnh (các kỹ thuật nuôi, cách quản lý môi trường và dịch bệnh).
3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá và phân lập vi khuẩn
Địa điểm thu: Cá thát lát còm có biểu hiện bệnh ở hai tỉnh: Hậu Giang và Đồng Tháp. Cá được thu từ 15 ao và bể nuôi có biểu hiện bệnh, mỗi lần thu 6-8 con cá biểu hiện bệnh và 2-4 con cá khỏe. Cá được giữ sống trong thùng xốp có sục khí, vận chuyển về phòng thí nghiệm của bộ môn Bệnh học Thủy sản-Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Sau đó, mẫu cá được tiến hành phân tích trong ngày và chỉ phân tích mẫu khi cá còn sống. Cá được phân tích
mẫu theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993). Vi khuẩn được phân lập từ các cơ quan khác nhau: gan, thận, tỳ tạng của từng con cá và cấy trên môi
trường TSA Tryptichoặc môi trường đặc trưng cho vi khuẩn phát triển. Những khuẩn lạc rời rạc và hình dạng đặc trưng được tách ròng, lưu giữ để định danh.
3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn
Các đặc điểm về hình thái, sinh-hoá của vi khuẩn được xác định bằng cách kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản (primary test) và sử dụng bộ kit API 20E, (MicrobankTM, PRO-LAB Diagnostics, UK). Vi khuẩn được định danh theo
phương pháp của Cowan and Steel’s (Barrow and Feltham, 1999).
3.3.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ
Phương pháp làm kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006). Dùng tâm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn đã được xác định đạt mật độ 108 CFU/ml bằng máy so màu quang phổ, trãi đều lên mặt môi trường thạch TSA. Sau đó
dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách giữa 2 tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa
tâm đĩa kháng sinh với rìa của đĩa petri là: 10-15 mm. Sau khi hoàn tất việc
đặt đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủấm ở điều kiện 28oC . Sau 24 giờ
tiến hành đọc kết quả.
Đo đường kính vòng vô trùng (mm): dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006) để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng.
3.3.5 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn
MIC được xác định bằng phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh
trong ống nghiệm (phương pháp Broth), theo Clinical and Laboratory Standards Institute, 2006 (CLSI M49-A).
Thí nghiệm sử dụng 4 loại thuốc kháng sinh tinh: ampicillin, enrofloxacin, oxytertracycline và trimethoprim+sulfamethoxazole.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Pha dung dịch thuốc gốc trong 2 chai (50 ml) có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi phù hợp. Pha loãng dung dịch thuốc kháng sinh gốc bằng nước cất tiệt trùng, nồng độ thuốc giảm đi một nửa: 1024; 256; 128; 64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5 µg/ml.
Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong dung dịch BHI- B ủở 28oC, trong 24 giờ. Đo mật độ vi khuẩn bằng máy quang phổ (OD 625 = 0,085-0,13) tại giá trị này vi khuẩn đạt mật độ 108 CFU/ ml. Pha loãng mật độ vi khuẩn bằng môi trường BHB với độ pha loãng 1:10. Mật độ vi khuẩn cần cho tiến hành MIC là 105 CFU/ml.
Tiến hành thí nghiệm: cho 2 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm chứa 2 ml thuốc có các nồng độ khác nhau .Đối chứng âm (2 ml BHB+ 2 ml nước cất) và đối chứng dương (2 ml vi khuẩn + 2 ml nước cất).
Đọc kết quả
Kiểm tra sự thuần của chủng vi khuẩn xét nghiệm trên đĩa TSA. Nếu phát hiện thấy có sự tạp nhiễm thì không đọc kết quả MIC.
Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ đục của mỗi ống MIC với ống đối chứng âm, đối chứng dương.
Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc trong ống nghiệm đầu tiên không có vi khuẩn phát triển.
3.3.6 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn trên cá thát lát còm 3.3.6.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn trên cá thát lát còm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng cảm nhiễm tại phòng thí nghiệm - Bể nhựa 60 L được khử trùng bằng chlorine và xà phòng sau đó rửa lại bằng
nước sạch và sục khí cho hết chlorine.
Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn
Chọn 2 chủng vi khuẩn E.tarda (DT37 và HG41) và 2 chủng vi khuẩn
A.hydrophila (D2F71 và H1F39) để tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm. Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA ở 28°C và nuôi tăng sinh vi khuẩn
trong môi trường BHI-B được đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau đó tiến hành ly tâm 4000 vòng/phút ở 4°C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý đã được thanh trùng để
rửa vi khuẩn (lặp lại 3 lần).Tiến hành xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610 nm và OD = 1±0,1 tương ứng với mật độ
vi khuẩn là 109 CFU/ml. Sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến các nồng độ: 104, 106, 108 CFU/ml. Mật số vi khuẩn của từng nghiệm thức được khẳng định bằng phương pháp trải dung dịch trên đĩa agar.
Bố trí thí nghiệm
Phương pháp tiêm:Cá thát lát giống mua từ trại ở Hậu Giang có trọng
lượng khoảng 15±4 g/con, cá khỏe, có da sáng và phản ứng linh hoạt với tiếng
động. được trữ trong bể composite, có sục khí, cho ăn thức ăn công nghiệp,
cho ăn theo nhu cầu của cá. Cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức có mật
độ vi khuẩn lần lượt là: 104, 106, 108 CFU/ml, nghiệm thức đối chứng không tiêm và nghiệm thức đối chứng tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần với mật độ cá thí nghiệm 10 con/bể. Cá được tiêm vi khuẩn với các nồng độ thí nghiệm ở gốc vi bụng của cá. Tiêm 0,1 ml/cá thể và cho ăn suốt