Sepharose-4B tự tạo
3.3.2.1. Quy trỡnh tạo cột sắc kớ ỏi lực ConM-Sepharose-4B
Sử dụng 50mg ConM tinh sạch gắn với 5g gel Sepharose-4B đó được hoạt hoỏ bằng CNBr theo mụ tả ở mục 2.2.4.2. Nạp cột cú kớch thước 1,2cm x 8,0cm thu được cột ConM-Sepharose-4B tự điều chế. Cột này cú thể sử dụng lặp lại nhiều lần nếu thường xuyờn tỏi sinh và bảo quản trong đệm TBS cú azit natri 0,02%.
5g Gel Sepharose-4B đó được hoạt hoỏ
bằng CNBr, ngõm trong HCl 1mM/15 phỳt. Rửa bằng đệm bicarbonate natri pH 8,3 chứa NaCl 0,5M.
50mg lectin ConM hoà tan trong đệm TBS pH 7,4 chứa
3mM Ca2+ Mn2+
Hỗn hợp ConM-Sepharose-4B
- Lắc nhẹ nhàng ở 40C/8 giờ
- Bao võy nhúm hoạt tớnh cũn lại bằng đệm bicarbonate pH 8,3 chứa glycine 0.2M
- Rửa loại protein khụng gắn cột bằng đệm acetate 0,1M chứa NaCl 0,5M. Rửa đệm bao võy bằng đệm TBS pH 7,4chứa 3mM Ca2+ Mn2+. Nạp cột
Hỡnh 3.22. Sơ đồ tạo cột ConM-Sepharose-4B Cột ConM-Sepharose-4B
3.3.2.2. Quy trỡnh tinh chế IgG
IgG được tinh chế bằng cột ConM-Sepharose-4B tự chế tạo, ngoài ra IgG cũn được tinh chế bằng cột chuẩn ProteinA-Sepharose-4B (hóng SIGMA- USA) để so sỏnh với cột tự tạo ConM-Sepharose-4B. Chế phẩm IgG tinh sạch được sử dụng để xõy dựng đồ thị chuẩn cho kỹ thuật LECTIN-ELISA.
Hỡnh 3.23. Quy trỡnh tinh chế IgG
Huyết thanh
Dịch chứa cỏc Ig
- Kết tủa bằng (NH4)2SO4 45% bóo hoà
- Li tõm 8000 v/p/15 phỳt, thu tủa, hoà tủa trong đệm PBS. - Thẩm tớch Cột ConM-Sepharose-4B (Cột ProteinA-Sepharose-4B) Nạp cột - Rửa cột bằng đệm PBS pH 7,4. - Phản hấp phụ bằng glycine 0,2M pH 2,6 cú trung hoà mỗi phõn đoạn hứng bằng Tris- HCl 0,75M pH 8,8
- Thu cỏc phõn đoạn đỉnh Chế phẩm IgG tinh sạch
Kiểm tra độ tinh sạch bằng SDS-PAGE
Xõy dựng đồ thị chuẩn IgG
Ở quy trỡnh tinh chế này, chỳng tụi tiến hành giải hấp phụ IgG bằng glycine 0,2M pH 2,6; cú trung hoà bằng đệm Tris- HCl 0,75M pH 8,8. Sau khi thăm dũ chỳng tụi thấy lượng Tris- HCl 0,75M pH 8,8 để sẵn ở dưới mỗi ống nghiệm hứng cỏc phõn đoạn là như sau:
Phõn đoạn 1: Khụng cần chứa sẵn Tris-HCl mà pH vẫn ở mụi trường trung tớnh.
Phõn đoạn 2: Cần chứa sẵn 100 l Tris-HCl thỡ pH đạt ở mụi trường trung tớnh. Cỏc phõn đoạn cũn lại: Cần chứa sẵn 500 l Tris-HCl 0,75M pH 8,8 thỡ pH đạt ở mụi trường trung tớnh.
3.3.2.3. Tinh sạch IgG người bằng sắc kớ cột ỏi lực ConM-Sepharose-4B và Protein A-Sepharose-4B
Đế xỏc định rừ ỏi lực của ConM đối với IgG huyết thanh người, chỳng tụi đó tiến hành so sỏnh với ỏi lực IgG và proteinA. Như chỳng ta đó biết khả năng liờn kết giữa IgG và proteinA từ thành tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus đó được nghiờn cứu sõu sắc bởi nhiều tỏc giả từ thế kỷ trước, và đó trở thành một kỹ thuật kinh điển trong nghiờn cứu miễn dịch khỏng thể IgG[16].
IgG được tinh chế theo cựng một quy trỡnh ở cả 2 loại cột ỏi lực ConM-Sepharose- 4B và cột Protein A-Sepharose-4B. Nạp cột 2ml mẫu, chỉnh tốc độ 20ml/giờ, thu mỗi phõn đoạn 2ml, rửa cột bằng đệm PBS pH 7,4; phản hấp phụ bằng glycine 0,2M pH 2,6 cú trung hoà mỗi phõn đoạn hứng bằng Tris- HCl 0,75M pH 8,8, thu cỏc phõn đoạn đỉnh.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Các phân đoạn O D (2 8 0 n m ) ConM-SEPHAROSE-4B PROTEINA-SEPHAROSE-4B
Hỡnh 3.24. Cỏc phõn đoạn IgG từ cột sắc kớ ConM-sepharose-4B và cột Protein A-Sepharose-4B.
Kết quả thấy rừ cả 2 cột sắc kớ đều thu được 1 đỉnh. Mặc dự trong cựng một điều kiện rửa cột và giải hấp phụ, nhưng với cột ConM-Sepharose-4B đỉnh thuộc phõn đoạn thứ 4, cũn với cột proteinA-Sepharose 4B đỉnh lại thuộc phõn đoạn thứ 3. Nguyờn nhõn cú thể là do ỏi lực của IgG với ConM mạnh hơn ỏi lực của IgG với proteinA vỡ vậy mà IgG ở cột ConM-Sepharose-4B bị đẩy ra chậm hơn.
3.3.2.4. Tổng kết quỏ trỡnh tinh chế IgG
Bảng 3.10. Tinh chế khỏng thể IgG từ huyết thanh người bỡnh thường bằng cột ConM-Sepharose-4B và cột ProteinA-Sepharose-4B
Số mẫu
Cột ConM - Sepharose-4B Cột ProteinA - Sepharose-4B HL Protein (mg/ml) HL IgG (mg/ml) HL Protein (mg/ml) HL IgG (mg/ml) 1 67,52 11,98 68,92 11,75 2 69,14 12,23 70,14 12,83 3 70,56 12,98 67,23 11,88 4 72,14 13,08 72,13 13,25 5 69,78 12,07 67,35 12,04 6 66,15 11,03 69,14 12,16 7 68,56 11,78 66,57 10,79 8 70,14 12,87 68,56 12,01 9 72,56 13,14 71,48 12,99 10 68,23 11,28 66,78 11,04 TB 69,47 3,57 12,24 0,51 68,83 3,38 12,07 0,56
Hàm lượng khỏng thể IgG tinh chế được bằng 2 loại cột ConM-Sepharose-4B và ProteinA-Sepharose-4B là tương đương nhau. Kết quả hàm lượng khỏng thể IgG tinh chế được bằng cột ConM-Sepharose-4B trung bỡnh là 12,24 0,51 mg/ml, dao động từ 11,03-13,14 mg/ml, kết quả hàm lượng khỏng thể IgG tinh chế được bằng cột ProteinA-Sepharose-4B trung bỡnh là 12,07 0,56 mg/ml, dao động từ 10,79- 12,99 mg/ml. Kết quả này phự hợp với những thụng số bỡnh thường của người Việt Nam và phự hợp với tỏc giả Văn Đỡnh Hoa và cộng sự[11] khi họ sử dụng bộ sinh
phẩm xột nghiệm của nước ngoài. Điều đú chứng tỏ hoàn toàn cú thể dựng cột ConM-Sepharose-4B để tinh chế KT IgG từ HT người.
3.3.2.5. Đỏnh giỏ mức độ tinh sạch của chế phẩm IgG được tinh chế bằng cột ConM -Sepharose-4B và Protein A-Sepharose-4B
Để đỏnh giỏ độ tinh sạch của chế phẩm IgG tinh chế được bằng cột ConM- Sepharose-4B và cột ProteinA- Sepharose-4B, chỳng tụi tiến hành điện di chế phẩm trờn gel polyacrylamide cú SDS và 2-mercaptoethanol (SDS-PAGE).
Kết quả thể hiện trờn hỡnh 3.25. cho thấy chế phẩm IgG thu được từ cột chuẩn ProteinA-Sepharose-4B và cột ConM-Sepharose-4B tự tạo là hoàn toàn tinh sạch. Chỉ biểu hiện 2 băng là chuỗi nặng (53kDa) và chuỗi nhẹ (25kDa) khi kiểm tra bằng kỹ thuật SDS-PAGE.
Như vậy dựng lectin ConM làm khỏng nguyờn đặc hiệu để tinh chế khỏng thể IgG từ huyết thanh người là một phương phỏp mới, cú thể sử dụng rộng rói trong nghiờn cứu Y học. Phương phỏp này thu được chế phẩm IgG cú độ tinh khiết cao, quy trỡnh lại đơn giản, dễ thực hiện trong điều kiện của nước ta.
Hỡnh 3.25. Điện di SDS-PAGE đỏnh giỏ độ tinh sạch của chế phẩm IgG Chỳ thớch:
Cột 1: Protein chuẩn (đó được chỳ thớch ở hỡnh 3.3.). Cột 2: IgG tinh chế bằng cột ConM - Sepharose-4B Cột 3: IgG tinh chế bằng cột ProteinA - Sepharose-4B
Quan trọng hơn, kết quả này đó chứng minh rằng lectin ConM liờn kết đặc hiệu với khỏng thể IgG mà khụng hề liờn kết với thành phần protein nào khỏc trong HT người. Như vậy chỳng tụi đó tỡm thấy lectin ConM từ hạt đậu dao biển Việt Nam (Canavalia maritima Aublet) cú khả năng liờn kết đặc hiệu với khỏng thể IgG trong huyết thanh người. Đõy là tớnh chất quý của lectin đậu dao biển, cần nghiờn cứu, khai thỏc tớnh chất này để ứng dụng vào cuộc sống.