3.2.1.1. Quy trỡnh tạo cột sắc kớ ỏi lực Jacalin-Sepharose-4B
Sử dụng 50mg lectin mớt dai tinh sạch gắn với 5g gel Sepharose-4B đó được
hoạt hoỏ bằng CNBr, nạp cột cú kớch thước 1,2cm x 8,0cm thu được cột
Jacalin-Sepharose-4B tự điều chế. Cột này cú thể sử dụng lại nhiều lần nếu thường xuyờn tỏi sinh và bảo quản trong đệm PBS cú azit natri 0,02%.
5g gel Sepharose-4B đó được hoạt hoỏ
bằng CNBr, ngõm trong HCl 1mM/15 phỳt. Rửa bằng đệm bicarbonate natri pH 8,3
chứa NaCl 0,5M. 50mg jacalin hoà tan
trong đệm bicarbonate
Hỗn hợp Jacalin-Sepharose-4B đó hoạt hoỏ bằng CNBr
- Lắc nhẹ nhàng ở 40C/8 giờ
- Bao võy nhúm hoạt tớnh cũn lại bằng đệm bicarbonate pH 8,3 chứa glycine 0,2M - Rửa loại protein khụng gắn cột bằng đệm acetate 0,1M chứa NaCl 0,5M. Rửa bằng đệm PBS pH 7,4.
- Nạp chất cộng hợp Jacalin - Sepharose vào cột nhựa.
Hỡnh 3.11. Sơ đồ tạo cột Jacalin-Sepharose-4B
3.2.1.2. Quy trỡnh tinh chế khỏng thể IgA1
Để khai thỏc tiềm năng ứng dụng của lectin mớt dựa trờn khả năng tương tỏc đặc hiệu của lectin mớt với IgA1 trong nghiờn cứu biểu hiện KT IgA1, trước tiờn chỳng tụi tiến hành tinh chế IgA1 từ huyết thanh người bỡnh thường bằng cột Jacalin-Sepharose-4B tự chế tạo.
Đó cú nhiều cụng bố trong và ngoài nước về việc sử dụng lectin mớt làm KN
- Rửa cột bằng đệm PBS pH 7,4.
- Giải hấp phụ bằng glycine 0,2M pH 2,6 cú trung hoà mỗi phõn đoạn hứng bằng Tris- HCl 0,75M pH 8,8 - Thu cỏc phõn đoạn đỉnh
Hỡnh 3.12. Quy trỡnh tinh chế IgA1
Ở quy trỡnh này IgA1 được giải hấp phụ bằng glycine 0,2M pH 2,6. Mỗi phõn đoạn giải hấp phụ được trung hoà bằng đệm Tris-HCl 0,75M pH 8,8.
Huyết thanh
Dịch chứa cỏc KT
- Kết tủa bằng (NH4)2SO4 45% bóo hoà
- Li tõm 8000 v/p/15 phỳt, thu tủa, hoà tủa trong đệm PBS, thẩm tớch.
Cột Jacalin- Sepharose-4B Nạp cột
Chế phẩm IgA1 tinh sạch
Kiểm tra độ tinh sạch bằng SDS-PAGE
Xõy dựng đồ thị chuẩn IgA1
đặc hiệu để tinh chế IgA1 từ HT người [3],[19],[23],[61]. Cỏc tỏc giả đều sử dụng -metilgalactoside 0,05M để tiến hành giải hấp phụ IgA1. Cũn trong quy trỡnh của chỳng tụi, IgA1 được giải hấp phụ bằng glycine 0,2M pH 2,6 và cú trung hoà mỗi phõn đoạn hứng bằng Tris-HCl 0,75M pH 8,8.
Sau khi thăm dũ chỳng tụi thấy lượng Tris- HCl 0,75M pH 8,8 để sẵn ở dưới mỗi ống nghiệm hứng là như sau:
Phõn đoạn 1: Khụng cần chứa sẵn Tris-HCl mà pH vẫn ở mụi trường trung tớnh.
Phõn đoạn 2: Cần chứa sẵn 100 l Tris-HCl thỡ pH đạt ở mụi trường trung tớnh. Cỏc phõn đoạn cũn lại: Cần chứa sẵn 500 l Tris-HCl 0,75M pH 8,8 thỡ pH đạt ở mụi trường trung tớnh.
3.2.1.3. Tinh sạch IgA1 từ huyết thanh người bằng sắc kớ cột ỏi lực Jacalin- Sepharose-4B
Nạp cột 2ml dịch chứa cỏc KT, rửa cột bằng đệm PBS pH 7,4; giải hấp phụ bằng glycine 0,2M pH 2,6 cú trung hoà mỗi phõn đoạn hứng bằng bằng Tris-HCl 0,75M pH 8,8; thu cỏc phõn đoạn đỉnh. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Phân đoạn OD 2 8 0 nm HTBT HTUTG HTUTVH
Hỡnh 3.13. Cỏc phõn đoạn IgA1 từ huyết thanh người bỡnh thường và bệnh nhõn ung thư bằng cột sắc kớ Jacalin-Sepharose-4B: Cả 3 loại huyết thanh đều chỉ cú 1 đỉnh duy nhất ở phõn đoạn 4, OD280nm ở đỉnh của HTUTG là cao nhất, của
HTUTVH cao hơn người bỡnh thường
Cả 3 loại huyết thanh đều chỉ cú 1 đỉnh duy nhất ở phõn đoạn 4, OD280nm ở đỉnh của HTUTG là cao nhất, HTUTVH cao hơn người bỡnh thường. Điều này
chứng tỏ hàm lượng khỏng thể IgA1 trong HTUTG và HTUTVH là cao hơn trong HTBT.
3.2.1.4. Hàm lượng IgA1 sau tinh chế
5.84 11.33 3.60 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 HTUTVH (n=10) HTBT (n=10) HTUTG (n=10) Hàm l- ợn g IgA 1 ( m g/ml)
Hỡnh 3.14. Hàm lượng IgA1 từ HTBT, HTUTG, HTUTVH sau tinh chế
Kết quả ở hỡnh 3.14. cho thấy hàm lượng IgA1 trong huyết thanh của người bỡnh thường trung bỡnh là 3,6 0,54 mg/ml, dao động từ 2,52 đến 4,74 mg/ml.
Hàm lượng IgA1 trong HTUTVH dao động từ 4,75 đến 7,00 mg/ml; trung bỡnh là 5,84 0,59 mg/ml. Cao hơn khoảng 1,6 lần so với người bỡnh thường. Qua xử lớ thống kờ chỳng tụi thấy mức độ tăng này là cú ý nghĩa (P = 2,08 x 10-6 nhỏ hơn nhiều so với 0,05)[24].
Hàm lượng IgA1 trong HTUTG dao động từ 7,29 đến 13,64 mg/ml; trung bỡnh là 11,32 1,44mg/ml. Cao hơn khoảng 3,14 lần so với người bỡnh thường. Qua xử lớ thống kờ chỳng tụi thấy mức độ tăng này là cú ý nghĩa (P = 1,4 x 10-7 nhỏ hơn nhiều so với 0,05)[24].
Chỳng tụi sử dụng lectin mớt dai (Artocarpus heterophyllus Lamk) để bắt giữ IgA1 trong huyết thanh người, kết quả hàm lượng IgA1 trung bỡnh ở người khoẻ bỡnh thường là 3,6 mg/ml. Kết quả này hoàn toàn phự hợp với những thụng số của
P<0.05 P<0.05 HTUTVH (n=10) HTBT (n=10) HTUTG (n=10)
người Việt Nam, phự hợp với cỏc nghiờn cứu của tỏc giả Trương Văn Chõu[3] khi sử dụng lectin mớt mật (Artocarpus heterophyllus Lamk) để định lượng IgA1 trong huyết thanh bằng cột sắc kớ ỏi lực Jacalin-Sepharose-4B, tỏc giả Đỗ Ngọc Liờn[19] khi sử dụng lectin mớt tố nữ (Artocarpus champeden Gagn.) để định lượng IgA1 trong huyết thanh bằng cột sắc kớ ỏi lực Jacalin-Sepharose-4B, tỏc giả Nguyễn Văn Lợi[23] khi sử dụng lectin mớt dại (Artocarpus masticata Gagn.) để định lượng IgA1 trong huyết thanh bằng kỹ thuật LECTIN - ELISA, tỏc giả Johnstone A. và cs.[69] và kết quả xột nghiệm của Văn Đỡnh Hoa khi họ sử dụng KITs thử của nước ngoài[11]. Kết quả này cho thấy hoàn toàn cú thể định lượng IgA1 trong huyết thanh người bằng cột sắc kớ ỏi lực Jacalin-Sepharose-4B tự chế tạo.
3.2.1.5. Tổng kết quỏ trỡnh tinh chế IgA1
Bảng 3.6. Tinh chế IgA1 từ huyết thanh người bỡnh thường và bệnh nhõn ung thư Số mẫu HTBT a) HTUTG HTUTVH Protein huyết thanh (mg/ml) HL IgA1 (mg/ml) Protein huyết thanh (mg/ml) HL IgA1 (mg/ml) Protein huyết thanh(mg/ml) HL IgA1 (mg/ml) 1. 67,54 3,88 69,41 12,01 68,76 4,93 2. 72,13 2,93 66,78 9,02 67,42 5,34 3. 70,14 3,74 65,45 10,8 66,53 5,81 4. 69,71 2,52 69,32 13,17 67,48 6,58 5. 73,14 4,74 70,34 12,01 66,52 6,00 6. 68,09 3,44 66,42 11,36 69,08 5,87 7. 70,13 2,81 69,71 12,95 66,34 5,43 8. 69,04 4,55 67,42 13,64 67,42 4,75 9. 65,42 3,62 66,28 7,29 65,43 7,00 10. 66,78 3,35 64,17 10,87 69,14 6,67 TB 69,21 3,60,54 67,53 11,321,44 67,41 5,840,59
Nhỡn vào bảng 3.6. thấy rằng, mặc dự protein tổng số trong HTUTG và HTUTVH là khụng tăng so với người bỡnh thường, nhưng hàm lượng IgA1 trong HTUTG và HTUTVH lại cao hơn so với người bỡnh thường. Điều này chứng tỏ rằng sự đỏp ứng miễn dịch ở những cơ thể bị mắc bệnh ung thư gan và ung thư vũm họng được biểu hiện bằng khả năng tăng tổng hợp khỏng thể IgA1.
Do đú nồng độ khỏng thể IgA1 trong mỏu của bệnh nhõn tăng hơn mức bỡnh thường.
Kết quả tinh chế khỏng thể IgA1 trung bỡnh trong HTBT dao động từ 2,55-4,55 mg/ml, trong khi đú hàm lượng khỏng thể IgA trung bỡnh trong HTBT khoảng từ 2,7- 4,5 mg/ml, chứng tỏ rằng hiệu suất tinh chế khỏng thể IgA1 từ HT bằng cột Jacalin- Sepharose 4B tự chế tạo là rất cao.
3.2.1.6. Đỏnh giỏ độ tinh sạch của chế phẩm IgA1 tinh chế được bằng cột Jacalin-Sepharose-4B
Để đỏnh giỏ độ tinh sạch và xỏc định khối lượng phõn tử của IgA1, chỳng tụi dựng phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamide 12%.
Hỡnh 3.15. Điện di SDS-PAGE đỏnh giỏ độ tinh sạch của chế phẩm IgA1
(Chế phẩm IgA1 hoàn toàn tinh sạch, chỉ thể hiện2 băng TLPT: 56 kDa, 23kDa)
Kết quả điện di cho thấy chế phẩm IgA1 là hoàn toàn tinh khiết, khụng cú sự biểu hiện sai khỏc nào về khối lượng phõn tử của 2 chuỗi IgA1 trong HTUTG và HTUTVH so với người bỡnh thường. Điện di đồ của chế phẩm IgA1 trong HTBT và bệnh lớ đều cú 2 băng protein, một băng cú trọng lượng phõn tử khoảng 56kDa và một băng khoảng 23kDa, cỏc băng này tương ứng với chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của
Chỳ thớch:
Cột 1. Protein chuẩn (đó giải thớch ở hỡnh 3.3.) Cột 2. IgA1 người bỡnh thường
Cột 3. IgA1 người ung thư gan
IgA1. Kết quả này tương tự như những cụng bố trong cỏc cụng trỡnh trước đõy [3], [19], [23],[69].
Kết quả thu được chứng tỏ rằng sử dụng cột Jacalin-Sepharose-4Bđể tinh chế KT IgA1 từ HT người là đỳng đắn. Đặc biệt kết quả này một lần nữa khẳng định jacalin chỉ liờn kết với KT IgA1 mà khụng liờn kết với cỏc thành phần khỏc trong HT người.
Như vậy dựng lectin mớt làm KN đặc hiệu để tinh chế IgA1 trong HT người là một phương phỏp mới đó được nhiều nhà khoa học trờn thế giới và ở Việt Nam chứng minh cú thể sử dụng rộng rói trong nghiờn cứu Y học. Phương phỏp này thu được chế phẩm IgA1 cú độ tinh khiết cao, quy trỡnh đơn giản, dễ thực hiện trong điều kiện của nước ta. Những kết quả nghiờn cứu này đó cho thấy lectin mớt ở nước ta là một nguồn tài nguyờn phong phỳ, cú thể được sử dụng trong nghiờn cứu Sinh học và Miễn dịch bệnh lớ ở Việt Nam.