3.1.3.1. Quy trỡnh tinh chế lectin ConG
- Tủa bằng (NH4)2SO4 70% bóo hoà. - Li tõm 8000 v/p/15 phỳt, thu tủa,
hoà tan tủa bằng đệm PBS pH 7,4. Thẩm tớch Dịch chiết thụ
Chế phẩm lectin thụ
Chế phẩm lectin ConG tinh sạch
Kiểm tra độ tinh sạch
bằng SDS-PAGE Sử dụng nhận dạng AFP - Rửa cột bằng đệm PBS pH 7,4 - Giải hấp phụ bằng glucose 0,2M - Thu cỏc phõn đoạn đỉnh. Thẩm tớch Cột Sephadex G- 75 Nạp cột
Hỡnh 3.8. Quy trỡnh tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.)
- Chiết rỳt bằng đệm BPS 0,02M, pH 7,4. - Li tõm 8000 v/p/15 phỳt, lấy dịch nổi. Hạt đậu gươm nghiền khụ
3.1.3.2. Tinh sạch lectin ConG bằng sắc kớ cột ỏi lực Sephadex G- 75
Nạp cột 2ml lectin thụ, rửa cột bằng đệm PBS pH7,4; giải hấp phụ bằng glucose 0,2M; thu cỏc phõn đoạn đỉnh; thẩm tớch. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Phân đoạn O D 2 8 0 n m
Hỡnh 3.9. Cỏc phõn đoạn lectin ConG từ cột sắc kớ Sephadex G-75:
Lectin ConG thu được tập trung ở một đỉnh thuộc phõn đoạn thứ 4.
3.1.3.3. Đỏnh giỏ độ tinh sạch của lectin ConG
Để kiểm tra độ tinh sạch và xỏc định khối lượng phõn tử lectin ConG, chỳng tụi dựng phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamide12%.
Điện di cho thấy lectin ConG cho 3 băng trong đú cú một băng chớnh đậm cú khối lượng phõn tử khoảng 31kDa và hai băng phụ cú khối lượng khoảng 14 và 23
Chỳ thớch:
Cột 1,2: Lectin ConG tinh sạch Cột 3: Protein chuẩn (đó chỳ thớch ở hỡnh 3.3.)
Hỡnh 3.10. Điện di SDS - PAGE đỏnh giỏ độ tinh sạch của chế phẩm lectin ConG:
L
kDa. Kết quả điện di trờn gel polyacrylamide12% cú SDS và mercaptoethanol cho thấy chế phẩm lectin ConG thể hiện 3 băng protein cú khối lượng khoảng 31 kDa, 23 kDa và 14 kDa. Kết quả này phự hợp với kết quả của tỏc giả Renato [88]. Mặc dự quy trỡnh tinh chế lectin ConG của chỳng tụi tương tự như tỏc giả Trương Văn Chõu[3], nhưng kết quả điện di trờn gel polyacrylamide12% cú SDS và mercaptoethanol chế phẩm lectin ConG của tỏc giả chỉ xuất hiện 2 băng protein cú khối lượng phõn tử khoảng 31kDa và 14 kDa. Cú thể rằng đó xảy ra quỏ trỡnh phõn li nội sinh (proteoliz) đối với lectin tạo ra sự xuất hiện thờm một băng mới bắt nguồn từ lectin ConG ban đầu. Điều này thường xảy ra đối với một số lectin cú mặt trong hạt của một số loài đậu. Vỡ vậy mà kết quả điện di của chỳng tụi đó xuất hiện thờm băng 23 kDa.
3.1.3.4. Tổng kết quỏ trỡnh tinh chế lectin ConG
Bảng 3.5. Tinh chế lectin ConG từ 10g bột hạt đậu gươm Giai đoạn tinh chế Hàm lượng
protein (mg) HĐTS (HAA) HĐR (HAA/mg) Độ sạch tăng Tỷ lệ thu hồi hoạt độ % Dịch chiết thụ 40 4500 112,5 1 100 Sắc kớ ỏi lực Sephadex G-75 12 2760 230 2,04 61,3 Chú thích:
- HĐTS (Hoạt độ tổng số): Tính bằng đơn vị HAA. - HĐR (Hoạt độ riêng): Tính bằng đơn vị HAA/mg.
- Độ sạch: Là tỉ số giữa hoạt độ riêng của chế phẩm với hoạt độ riêng của dịch chiết thô.
- Tỉ lệ thu hồi hoạt độ: Đ-ợc tính bằng tỉ lệ phần trăm giữa hoạt độ tổng số của mẫu thu đ-ợc với hoạt độ tổng số của dịch chiết ban đầu.
Từ 10g bột hạt đậu g-ơm sau khi tinh chế thu đ-ợc 12mg lectin ConG, tỷ lệ thu hồi hoạt độ sau tinh chế là 61,3%. Lectin ConG sau tinh chế vừa có độ tinh sạch, vừa có hiệu suất cao.
3.2. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN MÍT ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgA1 TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI